关键词:
藏鸡
转录组测序
腿肌
lncRNA
ceRNA
摘要:
藏鸡是我国特有的地方性品种,以往的研究主要集中在家禽骨骼肌出生后阶段的生长发育规律与调控及其生长性状上,对胚胎发育阶段骨骼肌发育的研究相对较少。然而胚胎期是鸡骨骼肌生长发育的关键阶段。circRNA、lncRNA和miRNA是骨骼肌生长发育过程中至关重要的调节因子。因此,本研究随机选取已孵化10、14、18天的藏鸡胚胎为试验材料。每日龄选取3只作为生物学重复,并采集腿肌组织进行组织形态学观察和转录组测序,在此基础上,筛选出E10、E14、E18三个不同胚胎发育时期差异表达的mRNA、miRNA、circRNA以及lncRNA,并对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。同时本研究预测了可以靶向同一miRNA的circRNA、lncRNA和mRNA,并筛选出与肌肉发育相关的mRNA构建了ceRNA调控网络。最后,对测序结果进行了RT-qPCR验证,并对ceRNA网络中与肌肉发育相关的长链非编码RNA lnc21490.5进行cDNA末端快速扩增,获得了其全长。主要结果如下:1.藏鸡胚胎期10、14、18d腿肌组织的转录组测序9组藏鸡胚胎期腿肌样本测序所得原始数据经质控过滤后共获得14.10亿条高质量质控数据,有91.24%-94.68%的高质量质控数据可以比对到鸡参考基因组(GRCg6a)。在藏鸡胚胎E10期和E14期共筛选出2184个差异表达的mRNAs,E14期和E18期共筛选出3263个差异表达的mRNAs,E10期和E18期共筛选出6627个差异表达的mRNAs,共有745个mRNAs在三个时期均差异表达。对三个时期均差异表达的基因进行GO以及KEGG富集分析,GO富集分析结果显示,显著富集的前20个条目大部分与骨骼肌发育有关,筛选出与肌肉发育相关的基因如ACTA1、MYL4、MYH1C、TNNI2等88个;KEGG通路富集分析结果显示,显著富集到PI3K-Akt等10个信号通路。在藏鸡胚胎E10期和E14期共筛选出980个差异表达的circRNAs,E14期和E18期共筛选出937个差异表达的circRNAs,E10期和E18期共筛选出1906个差异表达的circRNAs,共有59个circRNAs在三个时期均差异表达。在藏鸡胚胎E10期和E14期共筛选出220个差异表达的lncRNAs,E14和E18期共筛选出302个差异表达的lncRNAs,E10期和E18期共筛选出663个差异表达的lncRNAs,共有31个lncRNAs在三个时期均差异表达。对差异表达的31个lncRNAs进行靶基因预测,共获得451个靶基因,对其进行KEGG富集分析,共有171个出现在差异表达基因显著富集的KEGG通路上。随机选取的3个差异表达mRNA、circRNA、lncRNA的表达情况与测序结果均显示一致,通过RT-qPCR验证。2.藏鸡胚胎期10、14、18d腿肌组织的small RNA测序9组藏鸡胚胎期腿肌样本测序所得原始数据经质控过滤后,共获得0.97亿条高质量质控数据clean reads,将clean reads经过筛选获得长度为18-32 nt的useful reads,有96.32%-99.81%的useful reads可以比对到鸡参考基因组。在藏鸡胚胎E10期和E14期共筛选出51个差异表达的miRNAs,E14期和E18期共筛选出41个差异表达的miRNAs,E10期和E18期共筛选出130个差异表达的miRNAs,共有11个miRNAs在差异表达。对E10、E14、E18三个时期均差异表达的miRNAs进行靶基因预测,共获得55个靶基因并对其进行KEGG通路富集分析,共有23个靶基因出现在差异表达基因显著富集的KEGG通路上。随机选取的3个差异表达miRNA的表达情况与测序结果均显示一致,通过RT-qPCR验证。3.非编码RNA lnc21490.5的克隆根据转录组测序所得到的原始序列设计cDNA末端快速扩增的5'端、3'端特异性引物,将扩增产物进行测序并拼接,获得lnc21490.5长度为522 bp,对其进行编码潜能预测分析可知其编码潜能仅有2.7%,利用blastn未发现与其全长相似的同源序列,利用blastp未发现与其编码氨基酸相似的同源序列。lnc Loactor2.0预测其位于细胞核内。预测lnc21490.5靶基因共66个并对其进行GO、KEGG富集分析,GO富集分析结果显示显著富集条目大部分与骨骼肌发育有关,KEGG通路富集分析结果显示显著富集通路大部分与心肌疾病有关。RT-qPCR结果显示,lnc21490.5在三个时期的表达量呈显著下降趋势(P<0.05),同RNA-seq趋势一致,在42日龄藏鸡肾中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05)。综上所述,本研究筛选出藏鸡胚胎腿肌发育过程中差异表