关键词:
食源性致病菌
芽孢
SERS技术
固相基底
快检
摘要:
食源性致病菌芽孢由于抗逆性强不易杀灭,是危害食品安全和人类健康的主要潜在隐患。相关防治研究近年来受到学界和工业生产的广泛关注。而检测是防治的前提,传统检测技术受时效性限制,开发灵敏高效的芽孢快检技术是食品安全领域亟待解决的关键问题。表面增强拉曼光谱技术(Surface-enhanced Raman Spectroscopy,SERS)是一种新型生物“指纹”图谱识别技术,可以提供丰富的理化结构组成信息和生物信号,具有无标记、操作简便、耗时短和信号强等优势,满足食品安全领域细菌芽孢快速检测的需求。基于高质量的基底材料是SERS技术良好检测性能的关键,本研究围绕优化完善与制备高性能基底材料而开展,将传统微生物检测方法与SERS技术互相印证,突出其检测优势和定性能力,并制备了两种多热点均匀排列结构和新型复合材料的SERS基底,结合多元统计分析方法和化学计量学构建识别模型和定量关系,从而达到灵敏高效的芽孢定性定量快检目的。本研究分为三个部分,具体内容如下:(1)基于溶胶基底的SERS技术对食源性芽孢菌快速识别研究。本章以市场上随机选购的火腿肠为研究对象,通过(非)热激处理方式、不同培养基的选择培养分离纯化出8株典型菌落。经过革兰氏染色镜检和PCR鉴定,结果为地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、克雷伯氏菌、植生拉乌尔菌、解鸟氨酸拉乌尔菌。通过表面增强拉曼光谱技术分别对8株菌采集其SERS光谱,在400-1800cm主要特征峰集中区域进行光谱解析,借助显著或细微的光谱特征峰差异成功区分不同类型食源性病微生物。此外结合多元统计分析结果表明:PCA前三个最佳主成分累计贡献率大于95%,识别率良好,每种微生物的SERS光谱独立成簇可以彼此区分开,实现不同微生物的分类识别以及革兰氏阴性菌和阳性菌的区分。为食品安全和微生物快检领域提供了一种快速有效可靠的手段,为基于SERS技术的细菌芽孢后续定性定量分析提供理论依据和奠定基础。(2)种子介导自组装固相SERS基底制备及芽孢传感研究。本章通过种子介导生长法优化纳米结构的尺寸和形状,并结合液相界面自组装技术制备了一种密集热点有序排列的固相基底材料(Ag NPs Self-assembled solid-phase,Ag NPs-SASP)。这种均匀的二维阵列呈膜状附着在硅片上,具有良好的SERS重现性和增强效应,增强系数高达1.79×10。对3种不同食源性致病菌芽孢进行SERS检测其峰位归属分析结果表明:Ca-DPA(芽孢内核标志2-6吡啶羧酸与钙的络合物)的拉曼特征峰在不同芽孢SERS光谱中占主要地位,且峰数量和峰强度存在显著差异。不同的芽孢在不同波段具有的独特特征峰分别归属于芽孢的不同生物结构和化学键振动形式。结合聚类分析既实现了3种芽孢之间的有效区分,也实现了梭菌和杆菌属芽孢的种属区分。线性判别分析完全区分了3种芽孢的SERS光谱,具有良好的灵敏性和特异性。可以实现不同芽孢的快速准确鉴别。基于本章开发的Ag NPs-SASP基底材料的SERS技术为食源性致病菌芽孢检测和食品安全风险控制提供了有效手段。(3)基于液面组装的石墨烯@银复合基底优化及芽孢快检研究。本章我们基于SERS技术将Ag NPs搭载在石墨烯薄膜上,制备了石墨烯@Ag-MLF(石墨烯@纳米银单层液膜)复合结构的新型SERS生物传感器,通过场发射扫描电镜及其EDS元素分布mapping表征了均匀的基底形貌和不同元素的分布,对三种不同芽孢进行SERS检测结果表面增强因子达到10以上,丰富的特征峰归属解析也可以为芽孢的初步识别鉴定提供支持。此外,SERS增强性能稳定,重现性良好(RSD<3%);结合多元统计和化学计量学方法分析结果表明PCA前三个主成分的累积方差贡献率高达96.35%,聚类分析实现不同芽孢光谱之间的的无干扰独立分簇。在最优主成分的基础上应用KNN和LS-SVM构建快速定性识别模型进一步分析,其中LS-SVM的预测集和训练集均达到100%实现完全区分。最后,基于石墨烯@Ag-MLF基底材料对三种不同芽孢进行定量检测其检测限在10-10CFU/m L之间,SERS强度与芽孢浓度之间呈现良好线性关系。这种新型材料石墨烯@Ag-MLF复合结构SERS传感平台具有快速灵敏、稳定的良好传感性能,为SERS技术在食品安全和微生物检测领域的应用提供了有力的技术支持。