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关键词： 微量元素   乙肝   铁   锌   谷丙转氨酶  

摘要： 目的：探讨血清微量元素与乙型肝炎病毒感染的关系。方法收集235例乙型肝炎病毒感染患者，根据疾病进展分为慢性乙肝携带者组、肝硬化组、肝癌组和50例健康对照者，采用罗氏生化分析仪进行血清钙、镁、铜、锌、铁、谷丙转氨酶的测定。结果慢性乙肝携带者组、肝硬化组、肝癌组血清铜含量高于健康对照组，差异有统计学意义(<0.05)，慢性乙肝携带者组、肝硬化组、肝癌组血清锌、铁、镁含量低于健康对照组，差异有统计学意义(<0.05)。血清钙与健康对照组比较差异无统计学意义(>0.05)，乙型肝炎病毒感染患者血清锌、铁、铜与谷丙转氨酶存在相关性(<0.05)。结论血清微量元素与乙型肝炎病毒感染存在一定的关系，血液中保持合理平衡的微量元素对于肝脏的保护具有积极作用。

关键词： HCC   HBV   HBx   多态性   亚型   预后分析   整合   细胞增殖  

摘要： 在消化系统疾病中,原发性肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是肝脏疾病中严重威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤,其在全球的病死率排名第二。病毒性肝炎、肝硬化、黄曲霉毒素、饮用水污染及遗传因素等均是常见的诱癌因素。与欧美国家因饮酒过量导致的酒精性肝硬化是肝癌的主要病因不同的是,在我国由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)触发的慢性乙型肝炎和肝硬化是肝癌最主要的致病因素。据流行病学调查,在我国患有慢性乙型肝炎的患者约有1亿左右,而由HBV相关性疾病引起的死亡每年约有50万左右,因此深入研究HBV在肝癌发生、发展中的作用及机制对降低肝癌发生率和死亡率有着重要而深远的意义。HBV是嗜肝属不全双链环状DNA病毒,当其感染宿主后可在肝细胞内生长繁殖,同时激活免疫系统引起肝脏炎症反应,并通过基因片段整合和反式激活作用等多种复杂机制最终导致了肝癌的发生和发展。乙型肝炎病毒X基因(Hepatitis B Virus X Gene,HBx)是HBV四个开放阅读框中最小的非结构基因,由452-465个碱基组成,其直接参与HBV的感染、复制过程。研究证实HBx蛋白可通过广泛的反式激活作用调控宿主细胞多条信号传导通路,从而影响细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖、细胞自噬和迁移能力等多种生物学过程。此外,多项全基因组测序数据显示HBV整合在宿主基因组上的片段约80%均是HBx片段,因此HBx还可通过由片段整合引起的基因组不稳定性、癌基因的激活、抑癌基因的失活等效应诱发肝癌。HBV的复制需进行反转录,在此过程中易发生DNA序列的变异。根据HBV的变异程度可将其分为8种亚型(A-H型)及不同的准种,这些不同HBV序列所携带的HBx DNA序列均不同。此外,HBx还可分为ayw, adr, adw, ayr四种不同的血清型。HBx序列本身也存在着点突变、C端截断突变和缺失突变三种突变形式。这些证据表明HBx DNA序列存在多态性。HBV多种亚型及HBx基因型均可影响HCC的发生和发展,表明HBx多态性在HCC的进程中可能存在重要的生物学功能。因此,系统的研究HBx多态性现象,进一步挖掘其可能的生物学作用及临床意义,可为HCC的防治提供新的证据和方向。第一部分HBV相关HCC患者HBx基因多态性分析及临床相关性研究目的：检测HBV相关HCC患者HBx基因的多态性并进行临床相关性分析,寻找具有临床意义的HBx亚型。方法：搜集多中心HBV相关HCC患者癌及癌旁组织、血清及临床资料,并对患者进行长期随访。抽提癌、癌旁组织及血清样本中基因组DNA,采用巢式PCR扩增HBx片段并进行测序。利用Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.05(MEGA6.05)和Cluster 3.0软件寻找差异位点并进行聚类分析。采用χ2检验、Kaplan-meier法、Log-rank检验统计分析各种多态性类型的临床意义。结果：1、HCC患者癌和癌旁组织中分别获得准确的HBx序列：287例患者癌中获得213条、癌旁中获得268条准确的HBx序列,癌旁中更容易获得HBx序列;2、癌组织中的HBx序列与癌旁中的不完全相同：其中癌和癌旁HBx完全相同占39%,不同的占61%,且不同的序列中差异位点较分散、无规律;3、癌和癌旁组织的HBx多态性大体可分为三型：我们将聚类分析显示的287例HCC队列中的HBx亚型分别命名为EHBH1、EHBH2和EHBH3;4、携带有HBx亚型EHBH2(以下简称HBx-EHBH2)的患者预后较好,且与多项临床指标相关：HCC患者(癌和癌旁)携带有HBx-EHBH2的总体生存率(OS)较高(癌,P=0.042;癌旁,P=0.041),且其在癌组织中HBx-EHBH2与肿瘤包膜相关(P=0.002),在癌旁组织中HBx-EHBH2与肝硬化(P=0.000)、TNM分期(P=0.033)、肿瘤包膜(P=0.010)、子灶(P=0.012)相关;5、验证队列证明HBx-EHBH2的存在并与患者预后相关：不同地区的HCC患者队列表明携带HBx-EHBH2的患者有预后较好的趋势;6,血清中HBx DNA序列与癌旁中的相同;7,血清中的HBx-EHBH2与患者预后相关：外周血中携带HBx-EHBH2的患者总体生存率较高(P=0.032)。结论：HCC患者癌和癌旁组织中HBx基因均存在多态性且不完全相同;HBx亚型EHBH2在HCC进程中有着重要的临床意义。第二部分HBx亚型EHBH2在人基因组整合的系统分析目的：研究HBx-EHBH2在人基因组整合的特点,对整合频率和位点进行相关分析。方法：利用HVID(High-throughput Viral Integration Detection

关键词： 乙型肝炎病毒表面抗原   乙型肝炎病毒   定量检测   临床意义  

摘要： 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)作为乙型肝炎病毒(HBV)感染的一个重要的指标，不仅能够有效的反映出乙肝患者的具体病情，并且在药物治疗效果及预后方面具备良好的前瞻性。本文指出了当前主要HBsAg检测方法的优势与不足，并对其的临床意义加以分析与探讨。

关键词： CD8(+) T-CELLS   ADAPTIVE IMMUNE-RESPONSES   PERIPHERAL-BLOOD   EXPRESSION   CARCINOMA   EXPANSION   CD4(+)  

摘要： Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) have been shown to inhibit T-cell responses in many diseases, but, in hepatitis C virus (HCV) infected patients, MDSCs are still poorly studied. In this assay, we investigated the phenotype and frequency of two new populations of MDSCs denoted as monocytic and granulocytic MDSCs (M-MDSCs and G-MDSCs) in HCV infected patients and analyzed their clinical significance in these patients respectively. We found that the frequency of CD14(+)HLA-DR-/low cells (M-MDSCs) from HCV infected patients (mean +/- SE, 3.134% +/- 0.340%) was significantly increased when compared to healthy controls (mean +/- SE, 1.764% +/- 0.461%) (Z = -2.438, P = 0.015), while there was no statistical difference between the frequency of HLA-DR(-/low)CD33(+)CD11b(+)CD15(+) (G-MDSCs) of HCV infected patients and healthy donors (0.201% +/- 0.038% versus 0.096% +/- 0.026%, P > 0.05), which suggested that HCV infection could cause the proliferation of M-MDSCs instead of G-MDSCs. Besides, we found that the frequency of M-MDSCs in HCV infected patients had certain relevance with age (r = 0.358, P = 0.003); patients older than 40 years old group (mean +/- SE, 3.673% +/- 0.456%) had a significantly higher frequency of M-MDSCs than that of age less than 40 years old group (mean +/- SE, 2.363% +/- 0.482%) (Z = -2.685, P = 0.007). The frequency of M-MDSCs, however, had no correlation with HCV RNA loads, aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), and the level of liver inflammation degree.

关键词： 乙型肝炎   表面抗原   定量检测   临床意义  

摘要： 目的：对乙型肝炎患者乙肝病毒表明抗原进行定量检测，探讨其对乙型肝炎病毒复制情况的临床意义。方法选取本院自2014年4月~11月收治的110例乙型肝炎患者治疗前的血清样本为主要研究对象，根据表面抗原含量多少分为5组，对其应用化学发光法进行乙型肝炎表面抗原的定量检测以及HBV-DNA检测，血清学标志物检测，对比测算HBsAg含量，并计算HBV-DNA阳性率，观察两者之间关系。结果发现HBsAg的含量和DNA阳性率成正相关。结论血清中HBsAg含量，可以间接反映出患者体内HBV-DNA情况，进而反应乙肝病毒复制的活跃程度。

关键词： 肝炎病毒   乙型   准种   Illumina Miseq   PCR-克隆-测序   遗传异质性   突变率指数  

摘要： 背景与目的本课题组之前采用克隆测序（CBS）的方法研究发现乙型肝炎病毒（HBV）逆转录酶区（RT区）准种异质性可作为接受核苷类似物治疗患者抗病毒疗效的一个预测指标。近年来,第二代测序技术（NGS）以其相对快速、超深度、高灵敏度的特点给HBV准种研究带来了新的策略。目前对于HBV感染后不同临床阶段的病毒全长准种异质性的研究还未见报道。本研究应用CBS及NGS方法扩增并获得急性乙型肝炎（AHB）、慢性HBV携带（IT）、慢性乙型肝炎（CHB）、慢加急性乙型肝炎伴肝衰竭（ACLF）、代偿期肝硬化（LC）患者血清病毒全长序列,结合生物信息学分析方法描述准种遗传异质性特征及探讨其临床意义,以期更好的阐述HBV自然史及致病机制。研究对象与方法本研究共纳入97名HBV感染的患者（AHB、IT、CHB、ACLF、LC）。40例应用CBS方法、87例应用NGS方法（30例同时应用两种方法）获得HBV全长基因组的准种后,通过生物信息学方法对准种的异质性（复杂度和离散度）特征进行分析,并建立了NGS大数据初筛流程和质控方法,最后分析五种不同感染阶段的病毒准种异质性、氨基酸突变指数、单个核苷酸复杂度、CP/Pre C核苷酸突变率的特点及其与临床病程演变的相关性。结果第一部分:40例HBV感染患者,采用CBS方法,平均每名患者获得14-17株HBV全长克隆,急性HBV感染的准种复杂度较慢性HBV感染的准种复杂度低;慢性HBV感染免疫耐受期准种复杂度低于免疫清除期;不同的免疫压力下Core区aa60-130及X区aa131-135氨基酸变异指数（MFI）有统计学差异,ACLF在这些区域氨基酸突变指数大于IT及AHB,CHB次之。高突变位点集中在Core区T、B细胞表位。第二部分:87例HBV感染患者,采用Illumina Miseq高通量测序获得30G数据,经过数据初筛获得可分析数据20G,约12 000 000条序列进入最终分析阶段。在建立高通量测序的大数据筛选流程的基础上,对于高通量数据进行筛选（步骤包括:测序质量、测序长度、序列比对优化、PCR错误纠正优化、内参质控评价）和生物信息学分析,每个区段丰度（除P3外）中位数为6 000（1 500-20000）。在五种不同感染阶段中,IT的复杂度（Sn）和平均遗传距离（d）最低,其次为CHB和AHB,ACLF与LC的Sn和d最高。准种的Sn和d在CHB患者中与高谷丙转氨酶（＞5×ULN）、与总胆红素（＞1×ULN）血症、与ACLF预后无关。BCP/Pre C区核苷酸的分析发现:ACLF和LC患者在CP区A1762T、G1764A、A1846T/C的变异率达到50%-90%,高于其他组（P＜0.001）。T1800C在感染B基因型的ACLF患者中变异率最高达46%,而在C基因型中仅有2.4%。未经核苷类似物治疗的患者病毒准种耐药位点突变率在LC组高于其他组（1-4%vs.＜1%）。CBS与NGS的Sn和d相关性和一致性较差（P＞0.05）。综合上述结果发现,AHB准种异质性在CBS研究中为最低,但是在NGS研究中高于IT及CHB准种异质性。慢性感染患者的HBV准种复杂度与免疫压力和感染时间有关,即免疫压力越大（ACLF）,感染时间越长（LC）,复杂度越高,B细胞表位对应的氨基酸突变率（HBc Ag）越高。IT患者三年的HBV准种变化的主要发生在HBs Ag/RT区域,表现为突变的积累。结论本研究建立了Illumina Miseq高通量测序研究HBV准种的大数据筛选流程和质控分析方法,发现在低丰度变异的检测和准种模拟方面,Illumina Miseq描述准种异质性的表现力较CBS方法更敏感、准确和高效。对HBV准种异质性的分析可以间接反映机体免疫系统对病毒的应答状态及感染时间的长短,从而为临床个体化抗病毒治疗提供科学依据。

关键词： 阴道上皮内瘤变   人乳头瘤病毒   基因分型   临床诊断  

摘要： 目的：探讨人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）基因分型在阴道上皮内瘤变中的检测情况及临床意义。　　方法：选择2012年1月1日-2014年7月31日在中国医科大学附属盛京医院门诊及病房经病理检查确诊并行HPV检测的阴道上皮内瘤变患者228例为研究对象，其中VAINⅠ组134例，VAINⅡ组78例，VAINⅢ组16例，回顾性分析HPV感染基因分型的检测结果及临床意义。　　结果：228例患者HPV阳性检出率为78.07％，VAINⅠ组、VAINⅡ组、VAINⅢ组中HPV检出率分别为73.88％、83.33％、87.50％，呈依次上升趋势。HPV16在各组中检出率分别为27.27％、50.77％、85.76％，HPV16在各组中感染率逐渐上升。　　结论：HPV是发生阴道上皮内瘤变的重要临床检测指标，对于早期诊断阴道上皮内瘤变有重要作用。 HPV16为阴道上皮内瘤变中最常见的基因型，且随病变级别升高，感染率逐渐升高。

关键词： 乙型肝炎病毒前 s1 抗原   乙型肝炎病毒血清标志物   检测  

摘要： 目的：探讨乙型肝炎患者前 s1抗原（Pres1-ag）与乙型肝炎病毒血清标志物（HBV-M）的相关性及其在临床意义。方法用酶联免疫吸附试验(elisa)法测定354例乙型肝炎患者血清中 Pres1-ag 和 HBV 血清标志物，并对检测结果进行分析。结果在354例乙型肝炎患者中 Pres1-ag 在 HBeag（+）组的阳性率为73.48%，明显高于在 HBeag（-）组的47.69%，具有显著性差异（χ2=23.18，P <0.01）。结论 Pres1-ag 能反映 HBV 的复制情况和传染性，对 HBV 感染的早期诊断和判断治疗效果具有重要的意义。

关键词： 尖锐湿疣   人乳头瘤病毒   荧光定量聚合酶链式反应  

摘要： 目的:对于尖锐湿疣(CA)患者进行人乳头瘤病毒(HPV)分型,以及DNA定量检测。方法:以荧光定量聚合酶链式反应(FQPCR)对146例患者的疣体处进行DNA检测与HPV分型。(标本从我院取材,由广州市金域医学检验中心得出测验与分型结果。)结果:146例尖锐湿疣患者经过治疗,102例痊愈,44例复发。HPV分型表明,阳性DNA为140例;126例基因型表现为6/11;15例基因型表现为16/18;8例基因型表现为6/11与16/18的合并。结论:HPV测定可以有效预测尖锐湿疣人乳头瘤病毒患者CA复发与癌变的可能性。

关键词： 高危型人乳头瘤病毒   检测   宫颈癌   HC2法   多重实时PCR  

摘要： 目的观察多重实时PCR技术对高危型人乳头瘤病毒感染检测的临床意义。方法疑似宫颈病变以及感染HPV病例120例,分别采用HC2检测法以及多重实时PCR技术对高危型HPV感染情况进行检测,同时检测其亚型感染情况。结果在检测高危型HPV方面,两种检测方法效能近似,差异无统计学意义(P>0.05);而与湿疣以及宫颈炎相比,鳞状细胞癌、低度鳞状上皮内病变(LSIL)以及高度鳞状上皮内病变(HSIL)阳性检出率更高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论多重实时PCR检测方法适用监测高危型HPV持续感染以及大规模筛查。