关键词:
神经嵴
尼克酰胺
诱导分化
人胚胎干细胞
摘要:
目的探讨尼克酰胺(NIC)在人胚胎干细胞(hESCs)诱导分化为神经嵴细胞过程中的作用,为hESCs进一步分化为角膜内皮细胞提供实验基础。方法取培养5~7 d的hESCs细胞系H1进行诱导,根据诱导培养基中干预组分的不同分为未添加NIC组(仅使用诱导培养基)、NIC添加组(含10 mmol/L NIC的诱导培养基)、NIC+白藜芦醇(Res)组(含10 mmol/L NIC、10μmol/L Res的诱导培养基)和Sirtinol组(含10μmol/L Sirtinol的诱导培养基),其中Res和Sirtinol分别为SIRT1活性激动剂和抑制剂,各组连续诱导7 d。采用实时荧光定量PCR法检测诱导1、3、5、7 d hESCs及神经嵴细胞标志物mRNA相对表达量;诱导后7 d,采用免疫荧光染色法测定hESCs来源神经嵴细胞相关标志蛋白的表达,采用流式细胞术分析hESCs来源神经嵴细胞表面标志物神经生长因子受体(P75)和人自然杀伤因子1(HNK-1)阳性细胞比率,以评价NIC诱导效率及调控SIRT1对HNK-1^(+)表达的影响。结果与未添加NIC组相比,NIC添加组处理5 d后全能性基因八聚体结合转录因子4(OCT4)和同源域蛋白(NANOG)mRNA相对表达量显著降低,神经嵴细胞标志物P75、HNK-1、SRY相关HMG盒9(SOX9)和SOX10 mRNA相对表达量升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,未添加NIC组神经嵴细胞标志物P75表达较弱,HNK-1仅有零星表达,转录因子激活蛋白2β(AP-2β)及成对样同源域转录因子2(PITX2)均未见阳性着色;NIC添加组细胞中P75、HNK-1、AP-2β及PITX2均呈广泛的强阳性表达。NIC添加组P75+HNK-1+和P75+细胞比率高于未添加NIC组,差异均有统计学意义(t=8.481,P=0.001;t=2.987,P=0.041)。未添加NIC组、NIC添加组、NIC+Res组和Sirtinol组HNK-1^(+)细胞比率分别为(34.267±12.522)%、(89.633±1.358)%、(64.667±6.429)%和(86.300±3.460)%,总体比较差异有统计学意义(F=36.799,P<0.001),其中,NIC+Res组HNK-1^(+)细胞比率均低于NIC添加组和Sirtinol组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论NIC可通过抑制SIRT1的活性促进HNK-1表达,提高hESCs来源神经嵴细胞的分化效率,为神经嵴细胞相关疾病的治疗,如角膜内皮移植提供新的种子细胞来源。