关键词:
纳米孔测序
游离DNA
病原检测
感染性疾病
滚环扩增
摘要:
感染性疾病对人类健康和全球公共卫生安全造成重大威胁,识别病原是实现精准防控的前提。目前,临床上对于病原体的识别主要采用分离培养和分子生物学检测,其中病原分离培养检测周期长,耗时3~5天,而且多数病原体无法在体外培养,PCR等分子生物学检测需要已知病原信息,并且只能检测单一或有限病原。宏基因组测序无需先验知识,一次测序可以检测样本中全部微生物,并可对病原的变异、耐药基因、毒力基因等同时进行检测。目前二代和三代测序平台在宏基因组测序中各有优势,二代测序通量高,准确度高,三代测序具有实时性,长读长,可以获得更加完整的基因序列信息。在宏基因组测序中,高背景的宿主核酸水平是影响病原检测灵敏度的关键,游离DNA(cell-free DNA,cf DNA)是游离于细胞外的部分降解了的DNA,与组织样本或其它体液样本相比,宿主核酸水平明显降低,因此基于cf DNA进行病原检测引起了广泛关注。本研究探索了基于cf DNA的宏基因组测序病原检测技术,并将滚环扩增(RCA)与cf DNA结合起来,构建包含8种微生物的DNA片段(80 bp)与人基因组DNA片段(170 bp)的模拟样本,经RCA扩增后形成4334 bp的长片段,实现了短片段cf DNA序列延伸,并采用纳米孔测序,对模拟样本目标微生物达到100%检出率,表明RCA扩增后的cf DNA测序可以实现病原的有效检测。针对一例呼吸道感染患者的血液样本,同时进行cf DNA的二代测序以及RCA扩增后三代实时纳米孔测序,并进行血液微生物分离培养,结果表明二代测序与纳米孔测序均可以有效检出肺炎克雷伯菌序列,其在总微生物序列中占比分别为83.5%,85.6%,序列数在检出的所有微生物中均位列第一,与病原培养结果一致。其中二代测序、纳米孔测序和分离培养所需检测时间分别约为54 h、17.5 h、50 h。这表明结合cf DNA和RCA扩增的三代纳米孔测序可以有效检出病原,相对其它两种方案具有更短的检测周期。为进一步评估基于cf DNA和RCA扩增的纳米孔测序技术在临床感染性疾病中的应用价值,本研究进一步收集了137例不同类型的临床体液样本进行了微生物分离培养与测序。137例样本的分离培养结果均为阳性,共培养出33种微生物,其中包括临床上常见的污染性微生物,但未进行病毒分离培养。基于cf DNA的二代测序在137例样本中检出24种微生物,阳性率为75.2%,并在6例样本中检出3种不同类型的疱疹病毒。其中,还有9种病原体至少在三例样本中检出阳性,其中包括肺炎克雷伯菌,铜绿假单胞菌,鲍曼不动杆菌等。分离培养结果与二代测序检出的一致性为41%。考虑血液样本采集相对微创,能够降低对危重患者感染部位采样造成的伤害,我们选取其中的血液样本进行RCA扩增并采用纳米孔测序,发现28例血液样本的分离培养结果与二代测序的一致性为89.3%,与基于RCA的纳米孔测序的一致性为78.6%,二代测序与基于RCA的纳米孔测序检出病原的一致性为81.5%,提示三者在病原检出中具有较好的互补性。综上,本研究建立了基于病原cf DNA和RCA扩增的纳米孔测序技术,并评估了应用于感染性疾病病原体识别的效率,为cf DNA短序列更好的应用于纳米孔测序提供了方向,相比基于cf DNA的二代测序进一步缩短了检测周期,证实了基于血液样本的cf DNA可以用于识别感染性疾病的病原体,探索了感染性疾病病原现场快速微创诊断的可能性,为后续感染性疾病的快速判定提供了重要依据。