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关键词： 非洲猪瘟病毒   分子内佐剂   重组蛋白   抗原免疫效果  

摘要： 非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus，ASFV）可感染所有品种和年龄的猪，死亡率达100%，疫苗是有效的防控策略且目前尚无有效疫苗，因此国内外各界对非洲猪瘟疫苗的需求愈发迫切，我国政府更是出台多项政策，重点推进非洲猪瘟疫苗研制。亚单位疫苗由于其安全性高而成为研究热点，但其免疫原性较弱，佐剂可以增强抗原诱导的体液和细胞免疫反应，其中分子内佐剂能够显著提升抗原诱导的免疫应答，因此利用分子内佐剂提升ASFV亚单位候选疫苗免疫效果的研究具有重要意义。　　本课题旨在探究分子内佐剂促吞噬肽tuftsin单独作用及联合破伤风毒素肽TT-P2作用ASFV重组蛋白p753对抗原诱导产生的体液和细胞免疫效果的影响。利用生物信息学软件分析并设计ASFV重组蛋白p753、p753-Tuftsin和p753-Tuftsin-TT序列。通过大肠杆菌表达系统表达重组蛋白;通过DEAESepharoseFastFlow和Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白;透析法复性重组蛋白并用TritonX-114液相萃取法去除内毒素;采用westernblotting和Dot-ELISA试验鉴定抗原性。在小鼠模型上筛选p753的适配佐剂和免疫剂量。不同抗原的免疫效果通过免疫小鼠产生的特异性IgG和IgG1/IgG2a型抗体水平、淋巴细胞增殖情况、细胞因子IL-2、IL4和IFN-γ含量及T淋巴细胞亚群分化情况综合分析，抗原的安全性采用组织病理检查法进行评价。　　确定p753、p753-Tuftsin和p753-Tuftsin-TT的序列分别为p72（217-414aa）-p54（5-29aa）-p30（137-174aa）、p753-Tuftsin（289-292aa）和p753-Tuftsin-TT（830-843aa）。三种重组蛋白均以包涵体形式表达，均在37℃、0.5mmol/LIPTG条件下诱导表达4h时表达量最高;均达到90%以上纯度和80%以上复性回收率，且内毒素残留量均不高于50EU/mL;westernblot和Dot-ELISA结果显示三种蛋白均具有抗原性。通过小鼠模型确定的免疫佐剂和剂量为ISA61VG和60μg;检测的p753、p753-Tuftsin和p753-Tuftsin-TT抗体效价分别为1∶64000、1∶128000和1∶204800;p753-Tuftsin组和p753-Tuftsin-TT组平台期IgG1和IgG2a抗体水平、抗原刺激指数、脾脏淋巴细胞细胞因子IL-2、IL4、IFN-γ含量及CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞相对百分比均显著高于p753组，且p753-Tuftsin-TT组最高。　　制备出三种纯度高、符合内毒素残留标准且能与高免血清反应的重组蛋白;三种抗原经免疫效果评价显示分子内佐剂tuftsin对p753诱导产生的免疫应答有提升作用，且TT联合tuftsin的提升作用更佳，p753-Tuftsin-TT具有成为候选疫苗的潜力。本研究为ASFV亚单位疫苗及其他亚单位疫苗的开发提供一种新思路。

关键词： 肺癌   肿瘤相关抗原   自身抗体   基因工程   PD-1/PD-L1抑制剂  

摘要： 目的:探讨诊断精确度高的,更加适用于中国肺癌人群诊断和伴随诊断的自身抗体指标。探索这些血清自身抗体的表达与PD-1/PD-L1抑制剂治疗疗效的相关性,旨在探索出以液体活检为基础、以自身抗体为靶标的PD-1/PD-L1抑制剂疗效预测标志物,针对当前缺乏有效PD-1/PD-L1疗效预测、监测标志物的现状,为发现新的标志物提供新的思路。方法:首先采用最大规模的人全蛋白质芯片(包含～20000个重组蛋白,涵盖～75%的人类蛋白质组)从33例不同类型的肺癌患者,8例健康人,22例非肺癌的其他肺部疾病患者血浆中筛选出能与Ig G/Ig M特异性结合且符合筛选条件的肿瘤相关抗原。然后采用基因克隆表达方法,筛选制备出上述肿瘤相关抗原。并通过固相包被法将得到的抗原包被于微孔板的聚苯乙烯底面。采集不同类型的肺癌患者血清49例,健康人血清33例,非肺癌的其他肺部疾病患者血清17例,采用“酶联免疫吸附试验ELISA”对筛选出的自身抗体进行验证。最后收集132例晚期NSCLC患者血标本,采用“酶联免疫吸附试验ELISA”探索血清自身抗体的表达与PD-1/PD-L1抑制剂治疗疗效的相关性。结果:通过蛋白质芯片技术,筛选获得56种能与Ig G/Ig M特异性结合的肿瘤相关抗原。再根据筛选条件和生物信息学分析最终确立2种候选肿瘤抗原XAGE3(X抗原家族蛋白3)和DNAJC12(DNAJC12热休克家族蛋白)。通过基因克隆筛选制备出XAGE3和DNAJC12的肿瘤相关抗原并将其包被在微孔板的聚苯乙烯底面。Elisa结果显示,单独检测抗-DNAJC12(敏感性0.49,特异性0.94)其AUC(95%CI)为0.732(0.632-0.831),抗-XAGE3(敏感性0.796,特异性0.88)其AUC(95%CI)为0.902(0.845-0.958),并与目前肺癌公认的自身抗体之一NY-ESO-1(敏感性0.714,特异性0.54)其AUC(95%CI)为0.601(0.487-0.715)做对比。发现联合检测抗-DNAJC12和抗-XAGE3(不含Anti-NY-ESO-1)2种自身抗体时,敏感性和特异性大大提升(敏感性0.755,特异性0.96)其AUC(95%CI)为0.923(0.873-0.972)。联合检测3种自身抗体时,抗-DNAJC12,抗-XAGE3和抗-NY-ESO-1时,敏感性和特异性最佳(敏感性0.816,特异性0.90)其AUC(95%CI)为0.924(0.876-0.973)。且肺癌中筛选到的两种自身抗体表达水平普遍比非肺癌组高,p<=0.001上述结果证明该两种肺癌外周血自身抗体可用于肺癌的诊断和伴随诊断。最后采用“酶联免疫吸附试验ELISA”探索132例晚期NSCLC患者血清自身抗体的表达与PD-1/PD-L1抑制剂治疗疗效的相关性。就目前完成的50例病人后期随访信息和免疫治疗前后抗-DNAJC12,抗-XAGE3自身抗体含量变化,说明血清自身抗体抗-XAGE3,抗-DNAJC12对晚期NSCLC患者PD-1抗体疗效有一定预测作用。结论:联合检测抗-DNAJC12,抗-XAGE3和抗-NY-ESO-1三种自身抗体时敏感性和特异性大大提升,可用于肺癌的诊断和伴随诊断。抗-DNAJC12和抗-XAGE3两种自身抗体对晚期NSCLC患者PD-1/PD-L1抑制剂疗效有一定预测作用。

关键词： 串联重复序列   CelI15   集胞藻PCC6803   同源重组  

摘要： 蓝藻是一种光合自养生物,常作为生物制产品生产的底盘生物。本论文所选择隶属于蓝藻门的集胞藻PCC6803作为宿主细胞,构建产纤维素内切酶CelI15光合蓝藻表达体系。为了提高外源基因在集胞藻PCC6803基因组中的重组成功率,以集胞藻PCC6803基因组中存在的串联重复序列(Tandem Repeat)为同源重组位点,将来自枯草芽孢杆菌的纤维素内切酶基因CelI15(Gen Bank Accession No:AY044252)重组至集胞藻PCC6803基因组,并对重组藻的生理特性、培养条件、产酶性能进行了研究,主要研究结果如下: 通过以集胞藻PCC6803中串联重复序列(Gen Bank Accession No:CP003265.1)部分单次重复片段为同源重组的上、下游同源臂(上下游同源臂各为444 bp),选择氯霉素抗性基因,T7启动子,T1T2终止子,以p Bluescript II SK(+)为出发质粒构建了以集胞藻PCC6803基因组中串联重复序列为重组位点的重组质粒P5S-MRSCelI15。通过自然转化法将重组质粒转化至集胞藻PCC6803,获得了基因工程藻株CelI15-1、CelI15-2及CelI15-3。与以Psb A2为单重组位点目的基因转化方法相比,以串联重复序列为重组位点的目的基因转化阳性转化子数量提高100倍。 对获得的工程藻株利用CMC-Na为底物,测定了其细胞破碎液的纤维素内切酶活性。结果显示:以串联重复序列为重组位点构建的工程藻株CelI15-3的纤维素内切酶酶活性最高,为野生型藻株的6.1倍。 通过对三株工程藻株CelI15-1、CelI15-2、CelI15-3的生长曲线,叶绿素a和总类胡罗素以及藻蓝蛋白进行了测定,探究了外源基因的导入对集胞藻PCC6803的生理影响。结果显示工程藻株的各项生理指标与野生型藻株无明显差异,说明外源基因的插入对集胞藻PCC6803的生长没有明显的影响。 以温度、pH和光照强度为指标,对筛选出来的三株工程藻株进行了培养条件的优化,确定了三株工程藻株的最佳培养条件。结果显示三株藻株培养最佳生长条件:光照强度为1400 Lux,温度为28℃,p H依次为9、5、7。 串联重复序列在基因组注释中标注为未知蛋白(Protein＿ID:AGF52383.1),其功能未知,为了考察其功能,对其基因序列在细菌库中进行Blast基因序列比对,发现与其同源度最高的非集胞藻属的功能基因为可以水解海藻多糖的海洋杆菌属独岛海洋杆菌Maribacter dokdonensis,其同源度(Identity)为52%,然而通过实验发现其并未显示水解海藻多糖的功能,所以其功能有待进一步验证。 总之,本研究成功利用集胞藻PCC6803的串联重复序列作为同源重组位点将纤维素内切酶基因CelI15整合至集胞藻PCC6803基因组上,相较以Psb A2作为同源重组位点有效提高了阳性转化子数目,并实现纤维素内切酶基因CelI15在集胞藻PCC6803中的成功表达。

关键词： 不明原因反复种植失败   冷冻胚胎移植   促性腺激素释放激素激动剂   胚胎干细胞   氧化应激  

摘要： 目的:探讨冷冻胚胎移植(frozen embryo transfer,FET)过程中添加促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormone agonist,GnRH-a)对不明原因反复种植失败(recurrent implantation failure,RIF)患者的妊娠结局的影响以及GnRH-a对胚胎干细胞的生物效应。方法:本研究为单中心队列研究,纳入华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖中心于2018年4月到2022年12月期间诊断的不明原因RIF患者。倾向性得分匹配(propensity score matching,PSM)用来平衡队列的混杂因素。体外GnRH-a干预胚胎干细胞的模型被用来模拟GnRH-a可能对胚胎内细胞团产生的影响,分别评估了GnRH-a对胚胎干细胞的分化潜能、增殖能力和抗氧化应激能力的影响。结果:一共有761个FET周期符合本研究设置的纳入和排除标准。PSM后,GnRH-a组(n=27)与对照组(n=77)成功匹配。两组之间匹配的指标P值均大于0.05。GnRH-a组的着床率显著高于对照组(GnRH-a组,54.05%;对照组,28.97%;P<0.05),临床妊娠率也显示出差异(GnRH-a组,62.96%;对照组,35.06%;P<0.05)。两组的持续妊娠率没有差异。体外模型表明GnRH-a可以增强胚胎干细胞的抗氧化应激能力,但不影响的胚胎干细胞的增殖能力和分化潜能。结论:与常规使用孕激素相比,额外使用GnRH-a可以改善FET周期不明原因RIF患者的妊娠结局。此外,GnRH-a可能通过内细胞团发挥作用。第一部分:不明原因反复种植失败患者冷冻周期添加GnRH激动剂临床结局研究目的:探讨FET过程中添加GnRH-a对不明原因RIF患者的妊娠结局的影响。方法:所有入选患者分为两组,对照组和GnRH-a组。对照组仅接受孕激素作为黄体支持。GnRH-a组在使用孕激素的同时,在胚胎移植移植前第3天,胚胎移植当天,胚胎移植后第3天分别皮下注射0.1mg曲普瑞林。使用PSM平衡队列的混杂因素,包括取卵时年龄、体重指数、新鲜周期的卵泡刺激素、新鲜周期获卵数、新鲜周期冷冻囊胚数、FET周期的子宫内膜厚度、FET胚胎年龄和FET胚胎数量。结果:GnRH-a组的着床率和临床妊娠率显著高于对照组。两组的持续妊娠率没有差异。结论:与常规使用孕激素相比,额外使用GnRH-a可以改善FET周期不明原因RIF患者的妊娠结局。第二部分:GnRH激动剂对胚胎干细胞的效应研究目的:探索GnRH-a对胚胎干细胞的生物学效应。方法:体外GnRH-a干预胚胎干细胞的模型被用来模拟GnRH-a可能对胚胎内细胞团产生的影响。结果:体外模型表明GnRH-a可以增强胚胎干细胞的抗氧化应激能力,但不影响的胚胎干细胞的增殖能力和分化潜能。结论:GnRH-a可能通过内细胞团发挥作用。

关键词： SARS-CoV-2   COVID-19预防   基因工程红细胞SARS-CoV-2疫苗   慢病毒载体   CpG ODN   二氢槲皮素  

摘要： 严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的新冠病毒肺炎(COVID-19)具有高度传染性,已在全球范围内传播,对人类健康、社会卫生、全球经济及治理造成了巨大威胁。新冠疫情形势表明COVID-19的预防已成为全世界共同关注的问题。因此,本研究旨在开发新的COVID-19预防策略,基于疫苗预防和药物预防开展两个工作,构建基因工程红细胞SARS-CoV-2疫苗和探索二氢槲皮素对SARS-CoV-2感染的叙利亚仓鼠模型的预防效果,为COVID-19预防提供新的选择。SARS-CoV-2表面的刺突蛋白中受体结合结构域(RBD)含有丰富的抗原表位,是疫苗开发的重点关注靶点。CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)是一种具有免疫刺激效应的佐剂,含有非甲基化的DNA寡聚核苷酸序列。为了有效引起机体体液免疫应答和细胞免疫应答,本研究利用红细胞作为疫苗载体,利用基因工程技术表达RBD作为免疫原,进一步结合CpG ODN佐剂,构建了一种基因工程红细胞SARS-CoV-2疫苗。首先制备了表达RBD慢病毒载体(RBD-LVs),通过流式细胞术和荧光显微镜等技术验证RBD-LVs的成功构建,并且RBD-LVs可成功表达RBD。进一步使用RBD-LVs成功转染红系祖细胞,最后脱核成熟的红细胞结合CpG ODN佐剂获得基因工程红细胞SARS-CoV-2疫苗。流式细胞术的结果显示RBD-LVs成功转染红系祖细胞,RBD-LVs转染效率为10%,并且红细胞与CpG ODN的结合率为100%,这些结果表明基因工程红细胞SARS-CoV-2疫苗的成功构建。二氢槲皮素是从高寒地带松科落叶松根部提取得到的一种生物活性化合物,可有效清除体内自由基和毒素,具有抗过敏、抗炎、抗癌和抗病毒等多种生物学活性。研究表明二氢槲皮素具有抗SARS-CoV-2的潜力,目前没有在体内或者体外实验进行验证的研究。本课题首次通过新冠病毒感染的叙利亚仓鼠模型探索二氢槲皮素对SARS-CoV-2感染的预防效果。实验结果显示,与感染组相比,二氢槲皮素降低了仓鼠的鼻、咽、肺组织和肺淋巴的病毒载量。炎症因子水平和H&E染色病理分析结果证实二氢槲皮素减轻了SARS-CoV-2感染引发的炎症反应。这些结果表明二氢槲皮素对于SARS-CoV-2感染有良好的预防作用。本研究为COVID-19预防提供了两种策略,首先构建了基因工程红细胞SARS-CoV-2疫苗平台,为应对SARS-CoV-2的突变提供新平台。其次首次在体内验证了二氢槲皮素对SARS-CoV-2感染的预防效果。这两种策略为研制COVID-19预防药物提供了新的可能,对于COVID-19预防具有重要的科学意义和广泛的应用价值。

关键词： 微小RNA   胚胎干细胞   胰岛素分泌细胞  

摘要： 目的 探讨人胚胎干细胞（hESCs）向胰岛素分泌细胞（IPCs）诱导分化过程中基因表达的差异，并构建miRNA-mRNA调控网络。方法 选择GEO数据库内的GSE42094数据集作为研究对象，应用GEO2R分析差异表达基因，对其进行GO功能和KEGG路径以及蛋白互作网络分析，选用miRTarBase数据库预测其靶miRNA，对miRNA-mRNA调控网络进行可视化，并采用文献数据验证。结果 共得到差异表达基因188个，选取诱导后显著下调基因共21个，分析发现POU5F1、DNMT3B和NANOG 3个基因集中在“基因表达调控”，且下调基因在“胞核内”比较集中；通过查找靶miRNA，发现miR-335-5p能够调控POU5F1、DNMT3B、NANOG、FAM124B和LECT1 5个基因的表达；验证发现有24个miRNA能够被文献数据验证。结论 基于显著下调基因构建的miRNA-mRNA调控网络参与干细胞诱导分化进程并发挥重要作用。

关键词： 氢氧化铝   背侧皮层类脑   神经发生   社交异常   认知障碍  

摘要： 研究背景:神经系统发育异常会导致多种神经系统发育障碍,如智力障碍、自闭症谱系障碍、注意力缺陷障碍等。由于胎儿和新生儿大脑对于有毒物质异常敏感,环境有毒金属暴露干扰正常大脑发育过程并可能导致儿童期神经系统发育缺陷和相关发育障碍疾病,影响其成年后的认知和行为功能。铝是自然环境中广泛存在的有神经毒性的金属之一,大量的研究表明铝暴露与多种神经系统疾病相关,如阿尔兹海默症(AD)、帕金森症(PD)、自闭症谱系障碍(ASD)。铝可穿透血脑屏障在大脑中长期蓄积继而产生神经毒性。在大量的人群流行病学调查报告中表明职业铝暴露会损害工人的反应时间、记忆力、注意力和定向力等进而引发职业铝暴露所导致的认知功能障碍。此外,对人类生物样本的分析显示,母体中血铝含量与她们的新生儿血铝含量几乎相同,长期静脉注射含铝溶液的早产儿大脑发育受损明显。铝暴露的形式和途径多样,在儿童成长过程中,铝暴露的主要来源是疫苗佐剂,氢氧化铝(Al(OH))是最常用的疫苗佐剂之一。尽管单一疫苗可能只含有少量的铝(通常少于0.5毫克的铝佐剂化合物),但含有铝佐剂的多种疫苗可以大大增加人体的总体铝负担。多国儿童疫苗免疫规划显示,儿童在出生后至6岁时将接受20-30支疫苗,其中许多疫苗都含有铝基佐剂,如乙肝疫苗、百白破疫苗等。在动物模型试验中,新生小鼠在出生后暴露于100μg Al/kg的疫苗佐剂后,会出现一系列行为异常和相关的运动神经元死亡。同样,绵羊在反复注射含铝疫苗后,也有神经炎症/退行性综合症的表现。近年来有人指出,疫苗中的铝与自闭症谱系障碍(ASD)发病率的上升之间存在关联。鉴于儿童经常从疫苗中接触到大量的铝,铝佐剂对发育中的人类中枢神经系统的不利影响需要关注。然而,由于严格的伦理限制和实际问题,铝暴露对人类神经系统发育及认知等功能的影响还尚不明确。类脑模型是一种理想的体外细胞模型,它来自于人类胚胎干细胞(h ESCs)或人类诱导多能干细胞(hi PSCs),在很大程度上再现了人类早期大脑发育的分子、细胞和解剖学特征。随着类脑培育技术的发展,目前类脑模型已被广泛用作研究人类神经发育障碍和各种药物或环境污染物诱导的神经发育毒性实验模型。由于其在体外形成的皮层样结构能够重演人的大脑皮层的动态发育过程,且可以检测到含有外向放射状胶质细胞o RGCs的o SVZ区域,从而为研究Al(OH)暴露参与神经系统发育障碍的发生提供了良好的体外研究模型。研究方法:1.本研究根据背侧皮层诱导的方法结合三维悬浮培养技术,使h ESCs在体外自发形成具有典型皮层样结构的皮层类脑模型。利用免疫荧光染色方法明确不同发育时间点皮层类脑的组织学特征。建立类脑发育早期慢性和发育晚期慢性Al(OH)暴露模型,利用形态学测量方法,明确不同剂量Al(OH)暴露对不同发育阶段的皮层类脑形态和大小的影响。利用免疫荧光染色方法检测D28皮层类脑中放射状胶质细胞(RGCs)标记物SOX2的表达情况,并统计SOX2所在的VZ区厚度,利用Ki67、Ed U及TUNEL染色检测皮层类脑VZ区SOX2的增殖及凋亡情况,明确早期Al(OH)暴露对皮层类脑发育的影响。利用免疫荧光染色检测D56皮层类脑中SOX2、IPCs标记物(TBR2)、深层神经元标记物(CTIP2)以及成熟神经元标记物(Neu N)的分布并统计VZ、SVZ、CP区域厚度,利用实时定量荧光聚合酶链式反应(q RT-PCR)检测D56皮层类脑中NESTIN、SOX2、Ctip2、TBR2的m RNA的表达情况,明确Al(OH)暴露后对皮层类脑神经元分化的影响。利用免疫荧光染色方法检测D96皮层类脑中SOX2、o RGCs标记物(HOPX)、神经元标记物(MAP2)、星形胶质细胞标记物(S100β)的表达情况,明确发育晚期Al(OH)慢性暴露对类脑中o RGCs和星形胶质细胞分化的影响。2.利用转录组测序技术对第28天的Al(OH)暴露类脑模型进行测序,通过DEseq2方法筛选出差异基因,对差异基因进行基因本体(Gene ontology,GO)通路富集、KEGG富集以及蛋白互作网络(Protein-Protein Interaction Networks,PPI)分析,揭示Al(OH)暴露导致类脑神经发生异常的潜在机制。利用免疫荧光技术检测Al(OH)暴露皮层类脑中YAP的表达和分布,并利用免疫印迹技术检测YAP和LATS1/2的蛋白表达水平,明确Hippo信号通路的异常抑制是Al(OH)暴露导致皮层类脑中神经祖细胞库衰竭并促进神经细胞分化的主要作用途径。3.利用旷场、高架十字迷宫、明暗箱行为学测试检测新生期Al(OH)暴露对小鼠成年后的运动能力和焦虑样行为的影响;利用三箱社交实验、理毛实验、埋珠实验检测小鼠的社交行为和重复刻板样行为;利用Y迷宫实验、新物体识别实验和

摘要： “女娲”中国人群基因组计划发布第三项成果中国科学院生物物理研究所徐涛院士团队和何顺民研究员团队解析中国人群基因组微卫星变异图谱。相关成果发表于《自然·通讯》（Nature Communications）。“女娲”中国人群基因组计划旨在构建中国人群的全基因组数据资源，并全面解析中国人群基因组遗传变异。在此之前，

关键词： 红色基因  

摘要： 大力推进红色基因传承，求变就是要加快推进传统媒体与现代媒体融合，创新传播载体，用青少年喜闻乐见的方式传承红色精神。求新就是要紧扣时代脉搏、赋予其新的内涵，将红色基因融入我们开展的各项活动中，不断孕育和锤炼出新的具有时代特征的“红色精神”，从而推动社会不断前进。