教学课程资源库 更多>>

关键词： 酿酒酵母   S-腺苷-L-蛋氨酸   紫外诱变   转录组分析   基因工程  

摘要： S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)是生物体内重要的生理活性物质，其临床应用十分广泛，可作为一种治疗酒精性肝病的化疗药物，同时对抑郁症，阿尔茨海默病，骨关节炎，结直肠癌，艾滋病都具有一定效果。SAM主要由酿酒酵母发酵产生，作为代谢中间产物，起到转甲基、转硫、转氨基等作用。目前SAM生产的主要限制因素是酿酒酵母的SAM生物合成能力不高。本研究对SAM生产菌株616-15-33进行复合诱变和筛选，获得初步高产SAM菌株616-21-7，通过转录组学分析影响SAM积累的代谢途径并通过基因工程改造强化酿酒酵母中SAM的生物合成，最终获得一个高产SAM改造菌株。主要研究结果如下：　　首先，利用硫代谢与SAM合成的关联，成功建立一个高通量筛选高产SAM菌株的方法，以616-15-33为初始菌株，利用紫外诱变技术，采用西奈芬净、5-硫代-D-葡萄糖作为抗性筛选剂对菌株诱变。经过多轮诱变，利用高通量方法筛选出高产SAM阳性突变株616-21-7。经过多次传代检验，该菌株具有良好遗传稳定性。在5L发酵罐中发酵单位达到9.8±0.2g/L，比亲本菌株提高20.9％。　　其次，利用比较转录组分析不同SAM产量菌株的基因表达水平，获得与SAM产量有关联的差异基因聚类。通过GO、KEGG分析发现菌株SAM产量提高的原因可能是：（1）糖酵解/糖异生途径强化降低乙醇的产生，促进了细胞的生长并提高ATP的供给;（2）甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢促进了甲硫氨酸的生物合成;（3）氧化磷酸化的提高促进了ATP的生成，为后续SAM的生物合成反应提供了充足的底物;（4）磷脂酰胆碱合成消耗SAM的反应被抑制最终导致了SAM的积累。　　最终，根据转录组分析结果，通过CRISPR/Cas9技术分别敲除基因CHO2、CYS4以及过表达SAM2和CYB5以改造代谢通路。通过整合协调代谢通路，同时过表达SAM2与CYB5基因构建高产工程菌616-21-7E，在5L发酵罐中的最高SAM体积产量达到11.1±0.3g/L，较出发菌株616-21-7（9.8±0.1g/L）提高了13.2％，较原始菌株616-15-33更是提高了37.0％。　　本研究利用代谢工程相关技术选育了高产酿酒酵母菌株，并将SAM生产相关代谢网络具体分析改造，大幅度提高了酿酒酵母工程菌的SAM产量，为SAM的产业化生产提供了良好的基础。

关键词： 木霉菌素   紫杉木霉   基因工程  

摘要： 木霉菌素作为木霉菌剂的一种,具有卓越的生物防治作用,在防治植物病虫害的生物菌剂中扮演着关键角色,主要应用于抗肿瘤药物的研发和生物防治,具有良好的市场前景。紫杉木霉中最主要的生物防治因子便是木霉菌素,为了能够开发出高效生产木霉菌素且能够稳定遗传的紫杉木霉菌株,本论文研究内容如下: (1)以紫杉木霉S1961为出发菌株,首先对S1961的潮霉素和G-418抗生素的耐受浓度进行了摸索,得到紫杉木霉野生型菌株S1961对潮霉素的最高耐受浓度为40μg/m L,对G-418的最高耐受浓度为200μg/m L;然后对紫杉木霉原生质体的制备过程进行了条件优化,确立了紫杉木霉原生质体制备的方法;进而对外源DNA片段转化进入紫杉木霉原生质体的方法进行了摸索实验,通过对电击转化法和PEG介导法进行比较得出,PEG介导法可以成功将外源DNA片段成功转化进入紫杉木霉原生质体内,成功筛选获得了含有hph基因的重组子,最终成功建立了紫杉木霉遗传操作方法。然后在紫杉木霉菌株S1961的基础上,建立了以Tet-on::Cre-lox P为基础的筛选标记重复利用系统,得到了紫杉木霉底盘细胞S2530,能够通过强力霉素诱导Tet-on调控Cre重组酶的表达过程,完成对lox P-hph-lox P标记基因的诱导消除,从而实现应用一个筛选标记hph基因多次重复使用。 (2)强化紫杉木霉对木霉菌素的合成能力,提高木霉菌素的积累。在紫杉木霉基因组上,tri3编码的乙酰基转移酶负责将木霉菌醇乙酰化为木霉菌素,tri11编码的细胞色素P450加氧酶负责将12,13-epoxytrichothec-9-ene(EPT)氧化为木霉菌醇,tri4编码的细胞色素P450加氧酶负责将trichodiene氧化为isotrichodiol,;tri5编码的单端孢霉烯合成酶负责将法尼基焦磷酸(FPP)环化为trichodiene,它们是木霉菌素合成途径中的关键基因。本研究在底盘细胞S2530中依次过量表达了tri3、tri11、tri4和tri5。依次得到tri3过表达菌株S2729、tri3和tri11过表达菌株S3042以及tri3、tri11、tri4和tri5过表达菌S3190。S2729和S3042菌株的摇瓶发酵木霉菌素产量分别为1.2 g/L和1.5 g/L,较上一代的改造菌株木霉菌素产量均提高了33.3%,说明tri3和tri11基因为合成通路的关键基因,对其进行过量表达有利于木霉菌素产量的提升;tri3、tri11、tri4和tri5过表达菌株S3190的木霉菌素产量达到1.58 g/L,基本与上一代改造菌株S3042的产量相持平。通过摇瓶发酵数据分析,菌株S3190的7天木霉菌素的产量相对于出发菌株S1961提高了163%。 综上,本课题建立了紫杉木霉原生质体制备以及PEG介导的转化方法,并在紫杉木霉菌株S1961的基础上,建立了以Tet-on::Cre-lox P为基础的抗性标记重复利用系统,得到了紫杉木霉底盘细胞S2530;在紫杉木霉底盘细胞S2530中依次过量表达了自身来源的tri3、tri11、tri4和tri5,最终得到了tri3、tri11、tri4和tri5共过表达菌株S3190,木霉菌素产量达到1.58 g/L,相较于出发菌株S1961提高了163%。具有遗传稳定、木霉菌素产量高等工业化发展潜力,其构建流程为工业生产中构建高效生产木霉菌素的紫杉木霉菌株提供一定的参考价值,为以后实现木霉菌素高效生产奠定了基础。

关键词： α-亚麻酸   亚麻荠   单株选择   基因改良   遗传转化  

摘要： 亚麻荠是一种十字花科新型油料作物,具有丰产抗逆的优良栽培特性。亚麻荠籽油富含人体必须的α-亚麻酸(18:3),是一种预防心脑血管疾病的功能性食用油。植物种子中油酸在脂肪酸脱氢酶2(FAD2)作用下脱氢形成亚油酸,进一步经脂肪酸脱氢酶3(FAD3)脱氢形成18:3。油酸也可由脂肪酸延长酶1(FAE1)催化形成对人体不利的超长链脂肪酸,并且还会分流油酸底物。本研究以基因编辑获得的fae1亚麻荠突变体为材料,对18:3含量和含油量等性状进行单株选择筛选。同时,采用基因工程手段对亚麻荠脂肪酸组分进行改良,以期获得超高18:3含量的亚麻荠材料。本研究主要获得以下结果:(1)本试验通过对fae1三重突变体亚麻荠试验材料单株选择、后代株系鉴定的方式,筛选出高18:3和高含油量的株系,兼具优良农艺性状。起始fae1群体的18:3相对含量为45.4%,含油量36.3%,18:3单粒含量为205.6μg,单株产量平均值为2.5 g。第一代田间筛选出100个农艺性状良好的株系,筛选出10个18:3含量和含油量优异的单株。第二代株系种植筛选鉴定,获得的3号、26号、70号3个株系18:3相对含量均在47%以上,f 86-12α-亚麻酸相对含量达到50.6%;f 37-9相对含油量高达48.1%,其单粒18:3含量高达296.8μg;f 82-5单株18:3含量高达1.8 g。这些株系的单株平均产量也提高到4.2 g。这些结果表明,采用单株选择育种对于综合筛选高α-亚麻酸优良种质材料是有效的。(2)采用2A肽策略构建的AtFAD2NEW-BnaFAD3联合表达载体,在拟南芥中检验对种子脂肪酸的影响:在拟南芥Col-0和fae1突变体中,T代和T代阳性种子脂肪酸组分变化一致,测定的T代18:3相对含量降低。在T代中10%株系18:3相对含量分别提升4-12.9%,超过90%株系18:3相对含量降低,推测FAD3发生了共抑制现象。因此在rdr6-11突变体中过表达该载体,T代和T代18:3相对含量升高1.25倍,表明该载体构建正确,FAD2和FAD3均有效过表达,同时说明Col-0背景和fae1突变体背景下的转基因系中确实发生了共抑制。将AtFAD2NEW-BnaFAD3与ami RDR6双重转化拟南芥fae1突变体,T代株系18:3相对含量相比对照组高13%,达到34%。说明ami RDR6能够解除植株的FAD3共抑制,并能进一步提高18:3相对含量。证明了双重转化AtFAD2NEW-BnaFAD3与ami RDR6抑制共抑制结合,可以有效提高18:3相对含量。(3)FISET2和FISET3单独过表达对亚麻荠种子脂肪酸的影响:FISET2转化fae1突变体亚麻荠,T代10个株系中40%株系18:3相对含量升高,其中8号株系18:3相对含量相比对照组升高9%,达到50%,并且该株系相对含油量相比对照升高7%。FISET3转化fae1突变体亚麻荠,T代18个株系中,5号株系18:3相对含量相比对照升高2.5%,相对含油量相比对照升高23.8%,达到44.5%。这一结果表明,分别过表达FISET2和FISET3可以提高fae1突变体亚麻荠18:3相对含量,可用来创制高α-亚麻酸亚麻荠种质。(4)联合表达AtFAD2NEW、BnaFAD3和FISET2对种子脂肪酸的影响:在拟南芥Col-0和fae1突变体中过表达AtFAD2NEW-BnaFAD3-FISET2,T代种子18:3相对含量降低,FAD3发生了共抑制。在rdr6-11突变体中18:3相对含量升幅仅2.6%。该载体在fae1突变体亚麻荠中过表达,18:3相对含量升幅3.3%-8.4%,未能大幅度提高18:3相对含量,并且低于AtFAD2NEW和BnaFAD3的双基因表达,说明FISET2不适宜与FAD2和FAD3联合表达以提高α-亚麻酸。(5)联合表达AtFAD2NEW、BnaFAD3和FISET3对种子脂肪酸的影响:在拟南芥Col-0和fae1突变体中过表达,T代18:3相对含量分别升高18%和4-6%,在rdr6-11突变体背景下,T代种子中90%株系18:3相对含量升高18.2%。T代所有株系18:3相对含量大幅升高,最高升至44.9%,其所对应的18:1和18:2含量下降。表明该载体构建正确,基因能够有效表达。这一结果比FAD2和FAD3串联载体在rdr6-11背景下过表达株系18:3相对含量高0.6%。这些结果表明,FISET3与FAD2和FAD3联合表达可以提高α-亚麻酸。进一步将该串联载体转化至亚麻荠fae1突变体中,结果表明,T代阳性株系中18:3相对含量升高2.5%,相对含油量相比对照升高23.8%,达到44.5%。为克服亚麻荠中的共抑制,尝试利用人工mi RNA沉默RDR6(ami

关键词： Bdh2   ASCs   中胚层   原始红细胞(EryPs)  

摘要： β-羟丁酸脱氢酶2(β-hydroxybutyrate dehydrogenase 2,Bdh2)是短链脱氢酶/还原酶家族成员,催化哺乳动物铁载体生物发生中的限速步骤。在培养的小鼠造血细胞、酵母和斑马鱼胚胎中,Bdh2敲除会导致铁载体的大量减少和细胞内铁的过渡积累,以及线粒体中铁的缺少,使得血红素生物合成减少,这表明Bdh2参与铁运输,并在细胞内铁稳态中起重要作用。由于铁在血红素生物合成中具有重要作用,而血细胞又自中胚层分化而来。因此,本实验将研究重点放在Bdh2对体外中胚层分化和红细胞产生的影响。具体结果如下:***2敲除ASCs细胞系的中胚层转录组分析我们对Bdh2基因敲除胚胎干细胞系ASCs(Advanced Stem Cells)的RNA-seq数据进行了中胚层、胚外中胚层和造血相关基因的转录组差异分析。结果显示,与对照组相比,Bdh2敲除后中胚层标记基因Eomes、Evx1、Pdgfra、Adrb3、Kdr和Mest;胚外中胚层标记Runx1、Tbx3、Ihh和Flt1以及造血相关基因Pdlim7、Cited2、Mybbpla、Rcor2、Klf2表达均明显上调。***2敲除ASCs向中胚层诱导接下来,我们将Bdh2敲除ASCs进行体外诱导分化形成了中胚层细胞。发现Bdh2敲除可以促进中胚层的分化,与对照组相比,Bdh2敲除组的中胚层标记基因T、Hand1、Evx1和Wnt3a的m RNA水平显著提高,同时免疫荧光实验发现中胚层标记基因T的蛋白水平发生了上调。另外,我们还检测到Bdh2敲除ASCs向中胚层分化过程中,DNA甲基酶Dnmt3a的表达发生了下调,而Bdh2敲除后ASCs的H3K27me3的修饰水平发生了上调。***2基因敲除ASCs向原始红细胞诱导在这里Bdh2基因敲除ASCs和对照组都可以从特殊分化处理的胚状体中生成原始红细胞。但是与对照组相比,Bdh2敲除ASCs向原始红细胞诱导分化的q PCR结果显示,Bdh2敲除ASCs的原始红细胞谱系(Ery Ps)标记基因CD71、Klf、βH1、Pbx1和Cited2的表达均明显下调。说明Bdh2敲除显著影响了小鼠胚胎干细胞向红细胞的发育。综上所述,Bdh2基因敲除对胚胎干细胞系ASCs向中胚层分化有促进作用,而阻滞从中胚层向原始红细胞的进一步分化。具体的作用机制还有待于进一步探讨。

关键词： 小鼠胚胎干细胞   DPF2因子   神经外胚层   Wnt/β-catenin信号通路   TGF-β/Nodal信号通路  

摘要： 小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Cells,mESCs)在适当的培养条件下,可以在体外定向分化成神经干细胞。BAF染色质重塑复合物DPF2因子在早期神经发生过程中发挥重要作用,但具体的分子机制还不明确。为了解决这一问题,本课题利用Dpf2条件性敲除的mESCs,通过改进一种体外定向诱导神经分化的无血清培养体系,并结合拟胚体分化实验,验证Dpf2缺失会促进mESCs向神经外胚层进行分化。我们发现 Dpf2 缺失导致Bmp4(Bone morphogenetic protein 4,Bmp4)和Rest(Repressor element 1 silencing transcription factor,Rest)的下调是Dpf2缺失引起神经分化的必要条件;进一步研究发现在分化的mESCs中,诱导敲除Dpf2会导致β-catenin与SMAD2在神经外胚层标志基因启动子位点的结合增加,在Dpf2 KO mESCs分别过表达Bmp4与Rest会导致β-catenin与SMAD2在神经外胚层标志基因位点的结合减少;此外,我们发现在Dpf2 KO mESCs和分化的Dpf2 KO mESCs中TGF-β/Nodal信号通路的靶基因及编码TGF-β(Transforming growth factor-β)配体与受体基因的表达显著上调,说明Dpf2缺失通过调控TGF-β/Nodal信号通路促进神经分化;最后,本研究发现,Dpf2缺失会上调神经源性因子Oct6(Octamer-binding transcription factor 6,Oct6)的表达,进一步研究,我们发现Oct6通过调控Wnt/β-catenin信号通路活性促进神经发生。总之,该研究证明,DPF2与BAF复合物的核心亚基BRG1、神经因子REST、OCT6 及 Wnt/β-catenin 信号通路关键指标β-catenin、TGF-β/Nodal 信号通路的 SMAD2形成一个复合物,共同调控mESCs的神经分化;同时,这些组分之间也可以形成环路相互调控。例如,当敲除Dpf2后,可以通过直接调控Wnt/β-catenin与TGF-β/Nodal信号通路,促进mESCs向神经外胚层进行分化;此外,通过间接调控下调Bmp4、Rest的表达进而调控上述通路促进神经分化;最后,当敲除Dpf2后,通过上调Oct6的表达,也可以调控Wnt/β-catenin信号通路,从而促进mESCs的神经分化。该研究揭示了 BAF染色质重塑复合物DPF2因子调控mESCs向神经外胚层进行分化的分子机理,阐述了细胞内早期神经发生过程中信号通路参与的复杂网络调控,为了解早期神经发生过程中的分子机制提供了新的视角。

摘要： 首席专家李飞武(1982-),男,汉族,博士,研究员。现任农业质量标准与检测技术研究所所长、农业农村部农产品及加工品质量监督检验测试中心(长春)常务副主任。全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会副主任委员、中国植保学会生物安全专业委员会副主任委员、吉林省农产品质量安全学会副理事长兼秘书长。获“吉林省青年科技奖”“吉林省有突出贡献中青年专业技术人才”“吉林省拔尖创新人才”等荣誉称号。2006年工作以来,一直从事农业转基因生物安全评价与分子检测技术及标准化研究工作,主持国家转基因重大专项、生物育种重大项目、吉林省杰出青年人才项目等40余项,获省部级科技进步二等奖4项,

关键词： 高粱淀粉   多尺度结构   淀粉合成与代谢通路   基因工程  

摘要： 淀粉,除了作为人类主要能量来源之外,在非食品领域,如造纸、纺织、粘合剂、可生物降解塑料、制药和护肤品等应用广泛。其在各领域中的应用与理化特性直接相关,而理化特性是由淀粉来源和多尺度结构决定,因此,明确淀粉多尺度结构是实现各类型淀粉精准应用的前提。目前,针对天然淀粉在溶解性、凝胶性能和粘弹性、重结晶和消化性等方面存在的诸多不足,多采用化学、物理和生物学方法改性淀粉以赋予其新功能。生物学方法作为“绿色改性”方法之一可以在上游调控淀粉合成,以生产更多符合工业和社会需求的淀粉类型,是国内外研究人员共同关注的热点问题。高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)作为C4植物,因其抗盐碱、干旱、热胁迫等恶劣环境的能力强,被广泛种植于热带、亚热带和温带地区,是世界上仅次于小麦、玉米、水稻和大麦的第五大重要谷物作物。淀粉是高粱籽粒的主要成分(65%-70%),充分深入研究高粱淀粉的结构性质对拓宽高粱、高粱淀粉及淀粉产业具有重要意义。然而,针对“从高粱淀粉的合成源头调控淀粉结构”的研究鲜有报道。在现阶段高粱种质资源的基础上,明确如何通过遗传转化的方式获取新型高粱淀粉类型对扩展淀粉应用有重要意义。本研究以不同直链淀粉含量高粱淀粉理化特性差异为基础,采用“倒序的方式”,探究不同品系不同生长阶段高粱胚乳中淀粉颗粒多尺度结构生长演变规律;通过转录组测序深入探讨调控淀粉多尺度结构合成基因的种类及功能;通过基因工程技术获取了多种类型高粱淀粉并在体外纯化获取了调控高粱淀粉合成的三种关键基因,进一步构建了淀粉合成关键基因-结构-性质的关系网络,为实现在高粱淀粉合成的源头精准调控淀粉结构提供了参考依据。主要研究内容如下:(1)不同品系不同生长阶段高粱淀粉多尺度结构与理化特性分析。结果显示发育过程中糯高粱、粘高粱和H37高粱中直链淀粉含量分布范围分别为4.80%-6.25%、5.82%-9.76%和17.87%-27.47%。中间级分在淀粉生成初期即存在,在蜡质高粱发育后期直链淀粉通过中间级分转化为支链淀粉;发育19天糯高粱支链淀粉中B1链含量最高,而粘高粱与之相反。通过分析支链淀粉内链发现,H37高粱淀粉内链聚合度高于蜡质高粱淀粉。高粱淀粉颗粒半结晶层状结构厚度介于9.4-10.7nm,且属于典型的A型结晶结构,其相对结晶度随发育时间延长增加。不同发育阶段糯、粘和H37高粱淀粉的C CP/MAS NMR图谱均在100-106ppm(C1)处出现了三个独立峰。发育10-19天高粱淀粉颗粒大小和光滑程度不均一,但是呈现规则形状,且颗粒表面存在孔径为178-298nm的微孔。随着发育时间延长,颗粒表面因受挤压成为不规则多边形,且微孔通道深度加深。此外,淀粉的焓值和抗水解能力均随着生长期延长而增长,但是蜡质高粱淀粉颗粒的水解速率显著高于H37高粱淀粉。(2)通过转录组测序分析明确了高粱胚乳中淀粉与蔗糖合成代谢通路:Ko00500。该通路共涉及184个基因,在高粱淀粉合成过程中发挥生理功能的基因有22个,但是在糯、粘和H37高粱中与淀粉合成相关酶直接相关且具有高表达量的基因共13个。基因的功能总结为如下:(1)AGPLS1决定籽粒产量;(2)GBSSI主要负责直链淀粉合成,参与支链淀粉长B链合成;(3)SSSI是支链淀粉合成必不可少的酶,SSSIIa和SSSIIIa分别负责DP>25和12对照组>敲除样本。转基因受体Wheatland高粱淀粉中直链淀粉含量为25.6%,GBSSⅠ敲除高粱籽粒淀粉中直链淀粉含量为1.1%-3.5%;GBSSⅠ过表达高粱籽粒淀粉中直链淀粉含量为33.3%-45.1%。GBSSⅠ基因敲除直接减少了B1链合成,而GBSSⅠ基因过表达淀粉中B2+B3链含量显著增加。转基因淀粉的糊化温度和糊化黏度顺序为:GBSSⅠ-敲除<对照对照>GBSSⅠ-过表达。因此,GBSSⅠ基因的主要功能是合成直链淀粉和延长支链淀粉的A链至B1链。(4)通过转基因手段获取了分别含有SSSⅡa、SBEⅡb和GBSSⅠ的基因工程菌p ET-28a(+)。经过诱导纯化获取了具有活性的上述三种酶。将上述三种酶应用于淀粉改性,淀粉的链长分布、结晶结构、热力学以及消化性均发生了显著变化,判断出上述三种酶的主要功能:SBEⅡb水解不同聚合度长侧链形成短侧链A;SSSⅡa以ADPG为底物延长不同聚合度B链链长,以B1链为主;GBSSⅠ以AD

关键词： ESRG   NPM1   人胚胎干细胞   自我更新   TGF-β信号通路  

摘要： 研究背景与目的:人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)是一种来源于人囊胚内细胞团,经体外分离、培养而获得的原始多能干细胞。它具有无限增殖、自我更新和多向分化潜能的特性。近年来,h ESCs在疾病治疗、组织工程、再生医学、药物研发与筛选和组织器官的修复等医学领域具有重要的研究价值和应用前景,阐明h ESCs自我更新的分子机制对于了解干细胞定向分化以及胚胎发育等具有独特意义。胚胎干细胞相关基因(embryonic stem cell related gene,ESRG)是本课题组首次克隆的新基因,编码长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA),在h ESCs中特异性高表达,并且敲低ESRG后h ESCs的增殖减缓,提示ESRG可能对维持h ESCs自我更新有重要影响。采用RNA pull-down联合质谱技术筛选与ESRG相互作用蛋白时,发现ESRG可能与核仁磷酸化蛋白(nucleophosmin,NPM1)存在互作关系,提示ESRG很可能与NPM1共同参与h ESCs自我更新的维持。本研究主要明确ESRG与NPM1的相互作用,探讨ESRG通过与NPM1相互作用维持h ESCs自我更新的作用机制。研究方法:(1)通过细胞间接免疫荧光、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测ESRG和NPM1在h ESCs中的亚细胞定位;(2)在h ESCs中通过RNA pull-down联合Western blot实验以及RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)技术证实ESRG与NPM1相互结合;(3)构建NPM1截短体,在h ESCs中采用RNA pull-down和RIP实验确定ESRG与NPM1结合的具体区域;(4)用RNAi方法敲低h ESCs中ESRG、NPM1的表达,观察细胞形态,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色检测细胞AP活性,Western blot检测NPM1以及干性因子(OCT4、NANOG、SOX2)蛋白表达,通过流式细胞仪对细胞增殖进行检测;(5)在h ESCs中敲低ESRG,同时过表达NPM1,进行回复实验,观察细胞形态,检测AP活性、NPM1、干性因子(OCT4、NANOG、SOX2)蛋白表达和细胞增殖情况,分析NPM1对ESRG在h ESCs中发挥作用的影响;(6)使用蛋白质合成抑制剂和蛋白酶体抑制剂处理细胞,分析ESRG敲低前后NPM1的稳定性和泛素化情况,通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)实验检测与泛素化酶结合的情况;(7)分别敲低h ESCs中ESRG和NPM1的表达,用Western blot检测TGF-β信号通路相关蛋白Smad2、磷酸化Smad2(phospho-Smad2,p-Smad2)、Smad3和TGF-β1的表达;(8)在h ESCs中敲低ESRG,同时过表达NPM1,进行回复实验,用Western blot检测TGF-β信号通路相关蛋白(Smad2、p-Smad2、Smad3、TGF-β1)的表达;(9)敲低ESRG或NPM1同时用TGF-β激活剂处理细胞,Western blot实验检测TGF-β信号通路相关蛋白(TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3)的表达并且观察细胞形态变化。研究结果:(1)ESRG主要定位在细胞核,NPM1主要定位在细胞核的核仁,FISH和细胞间接免疫荧光实验显示二者存在共定位现象;(2)RNA pull-down联合Western blot实验和RIP实验均证实ESRG与NPM1相互结合;(3)构建NPM1不同结构域的载体,通过RNA pull-down以及RIP实验发现ESRG与NPM1的D1-2结构域结合;(4)分别敲低ESRG和NPM1后,细胞拉长呈纤维状,细胞AP活性降低,Western blot结果显示NPM1以及干性因子OCT4、NANOG、SOX2等蛋白水平均明显下调,细胞出现增殖减缓;(5)敲低ESRG同时过表达NPM1可以使细胞形态,NPM1以及干性因子OCT4、NANOG、SOX2等蛋白水平均得到回复,细胞增殖抑制减轻;(6)敲低ESRG后,NPM1蛋白表达明显下调,敲低ESRG促进NPM1与泛素连接酶HDM2结合从而发生泛素化降解;(7)敲低ESRG或者NPM1后,TGF-β信号通路相关蛋白Smad2、p-Smad2、Smad3以及TGF-β1表达均明显下调;(8)敲低ESRG同时过表达NPM1,TGF-β信号通路相关蛋白Smad2、p-Smad2、Smad