教学课程资源库 更多>>

关键词： 巨噬细胞   基因工程   细胞过继疗法   纳米前药   实体瘤  

摘要： 缺乏明确的免疫治疗靶点和非特异性全身化疗导致的严重副作用是各类实体瘤临床药物治疗所面临的严峻挑战。高毒性,低免疫原性以及易转移的肿瘤特征使得传统化疗和新兴的免疫疗法对实体瘤的临床治疗预后较差,有鉴于此,我们开发了一种以巨噬细胞为基体的智能前药靶向递送-激活系统。利用精氨酸酶1(Argnase-1)启动子调控下的酪氨酸酶(Tyrosinase)质粒对巨噬细胞进行体外基因改造,工程化改造后的巨噬细胞具备在肿瘤微环境中特异性表达外源酪氨酸酶的能力,装载了对乙酰氨基酚(APAP)前药的介孔硅纳米颗粒(MSNs)通过胞吞被负载到工程化细胞内部,跟随其一起靶向到肿瘤微环境(TME)中。在实体肿瘤的免疫抑制肿瘤微环境下,工程化巨噬细胞会逐渐向M2型极化,这一极化过程伴随着Argnase-1启动子的激活,此时外源导入的质粒开始大量表达酪氨酸酶,随着酪氨酸酶的表达被TME激活,肿瘤内外源酪氨酸酶的表达量在逐渐升高的同时将跟随工程化巨噬细胞到达肿瘤微环境中的APAP纳米前药催化为高毒性化疗药物苯醌代谢物(AOBQ),从而对实体肿瘤进行原位化疗。这一策略在体外和体内表现出对4T1三阴性乳腺癌模型优异的治疗效果和良好的生物安全性,因此智能前药靶向递送-激活系统可以作为一种潜在的三阴性乳腺癌以及类似肿瘤特性的实体瘤临床治疗替代方案。

关键词： 天麻   蜜环菌   4-羟基苯甲醇   天麻素   细胞色素P450   葡糖基转移酶  

摘要： 天麻(Gastrodia elata)是我国传统中药材,可以药食两用,有抗癫痫、抗疲劳、改善学习记忆等多种药理作用。天麻的主要成分是天麻素和4-羟基苯甲醇,根据药典,它们的含量不应低于0.25%。天麻素从天麻中提取获得,但是天麻中天麻素含量低生长周期长,提取较为不便;如果通过化学合成获得,则副产物多毒性大,易造成环境污染,因此生物提取法优势更为明显。运用工程菌生产天麻素可以使生产获得天麻素的周期缩短并且可以减少对环境的污染。蜜环菌(Armillaria mellea)为蜜环菌属真菌,能有效的降解植物细胞壁的成分(如木质素、纤维素等),其降解产物作为土壤的腐殖质为植物提供营养物质。蜜环菌不仅可以为天麻、猪苓等提供营养且其本身也具有药用价值。构建产天麻素的基因工程蜜环菌,使蜜环菌不仅仅可以有自身的价值,同时还具有了天麻素的药理活性,或可能为减轻天麻生产经济压力提供一定的条件。本文通过查阅文献和天麻转录组分析解析在天麻中天麻素可能的合成途径,筛选天麻转录组获得差异表达基因细胞色素CYP450(CYP450)和葡糖基转移酶基因(UGT),并对其进行克隆与功能鉴定,并将这两个基因转入蜜环菌中,在蜜环菌中构建一条生产天麻素的途径。获得的主要结果如下所示:1、基于前期实验室前期的转录组数据及查阅的文献,从天麻转录组数据中获得筛选获得差异基因细胞色素CYP450(CYP450),扩增获得基因全长序列,有2094bp,编码了697个氨基酸残基,分子量为76.78 k Da。生物信息学分析表明其蛋白二级结构主要元件为α螺旋和无规则卷曲,三级结构为寡核苷酸单体,并非信号肽是跨膜蛋白,是具有68个磷酸化位点的亲水蛋白。构建原核表达载体p EGX-4T-CYP450,诱导蛋白表达,分析表明该蛋白为包涵体蛋白。构建确保表达GFP的亚细胞过表达载体p RI101-35s-GFP-CYP450,瞬转烟草,发现其定位在内质网和细胞核上。2、基于前期实验室前期的转录组数据及查阅的文献,从天麻转录组中获得筛选获得差异基因UDP葡萄糖基转移酶基因(UGT),扩增获得基因全长序列,有1419bp,编码了472个氨基酸残基,分子量为52.03 k Da。生物信息学分析表明其蛋白二级结构主要元件为α螺旋和无规则卷曲,三级结构为寡核苷酸单体,并非信号肽也没有跨膜区域,是具有40个磷酸化位点的亲水蛋白。构建原核表达载体p ET-32a-UGT,诱导蛋白表达,获得UGT酶蛋白。构建确保表达GFP的亚细胞过表达载体p RI101-35s-GFP-UGT,瞬转烟草,发现其定位在细胞膜上。3、转基因蜜环菌的构建:构建真核过表达载体p H2GW7-35s-CYP450和p H2GW7-35s-UGT,通过农杆菌转染法将CYP450和UGT基因分别转入蜜环菌中,通过筛选标记基因筛选获得蜜环菌菌株,提取其DNA进行PCR鉴定,确定蜜环菌已转入目的基因,获得单转CYP450、单转UGT基因工程蜜环菌,并从转UGT的的蜜环菌出发,通过农杆菌转染法将p RI101-35s-GFP-CYP450转入蜜环菌从而获得双转CYP450和UGT的工程蜜环菌。同时,为证明工程蜜环菌具有将底物转化为4-羟基苯甲醇和天麻素的功能,在培养一段时间的液体培养基中加入底物,运用HPLC法检测工程菌转化底物为产物的效率。利用天麻素合成关键的基因在蜜环菌中构建获得一条合成天麻素的途径,对天麻素的生产具有一定意义。

关键词： 甲基酮   酿酒酵母   基因工程   转录因子  

摘要： 甲基酮（Methyl Ketone,MK）是一类甲基直接与羰基相连的化合物,在微生物、植物、昆虫和哺乳动物细胞中普遍存在,具有多种重要的天然和商业应用价值,包括在动植物中充当信息素和天然杀虫剂,在香精油中提供香味,在奶酪和其他乳制品中充当调味剂。本研究以生产甲基酮的酿酒酵母重组菌株为底盘细胞,通过进一步代谢工程改造,提高重组菌株的甲基酮生产水平。具体研究内容如下: 第一,利用基因工程技术过表达了甲基酮的前体脂酰基辅酶A的合成基因,包括乙酰辅酶A羧化酶ACC1和脂肪酸合酶FAS1、FAS2,甲基酮的产量提高至79 mg/L。第二,通过敲除甲基酮合成竞争途径的脂肪酸代谢途径以及增强细胞内游离脂肪酸的吸收利用来强化脂酰基辅酶A的供给。在酿酒酵母基因组上分别敲除贮存脂质合成的关键基因,包括编码二酰基甘油酰基转移酶的DGA1;编码磷脂二酰基甘油酰基转移酶的LRO1;编码甾醇酰基转移酶的ARE1和ARE2;以及编码磷脂酰磷酸酶的PAH1。通过优化组合,甲基酮的产量进一步提高,达136 mg/L。在此基础上,过表达编码脂肪酸转运蛋白基因FAT1和编码酰基辅酶A合成酶的基因FAA1、FAA2、FAA4,使甲基酮的产量达到144 mg/L。第三,利用转录因子工程,通过全局调控的方式来提高甲基酮的生物合成。利用PTEF1过表达突变体ADR1S230A,模拟油酸激活过程,促进过氧化物体的生物发生和增殖,获得甲基酮的最高产量为178.6 mg/L。第四,在7.5 L发酵罐中进行补料发酵,经过条件探索和优化,最终以最小盐培养基为发酵培养基,以葡萄糖为碳源进行补料,最终获得总甲基酮产量为845 mg/L。 综上所述,本研究通过强化胞内酰基辅酶A生物合成途径,减少用于脂质储存的酰基辅酶A的消耗,以及增强游离脂肪酸转化为酰基辅酶A等手段增加了合成甲基酮的碳通量。对菌株进行转录因子工程改造,通过表达ADR1S230A模拟油酸激活过程,促进过氧化物酶体的代谢过程,使甲基酮产量进一步提高。在分批补料发酵过程中,以葡萄糖为碳源,甲基酮的最高产量达845 mg/L。

关键词： 管道滞留水体   真菌有机物   生物稳定性   DNA测序   结构方程模型  

摘要： 室内管道饮用水水质与人体健康息息相关。由于室内饮用水管网不可避免的滞留等问题,导致水质恶化、细菌大量滋生、生物稳定性受损等事件屡有发生。因此,饮用水水质安全问题备受关注。然而,真菌作为水体微生物的重要组成部分,当水源水库真菌暴发时,由于现有的水处理工艺无法完全去除,导致真菌进入饮用水管网。探究饮用水滞留期间真菌的增殖特性及其对管网饮用水水质和微生物稳定性的影响具有实际应用价值。本研究以室内管道饮用水为研究对象,结合不同滞留时间,研究水源水库真菌暴发对管道饮用水水质及原有微生物生态的影响。探究了实际饮用水管道中过夜滞留诱导饮用水水质以及真菌增殖的季相演替特征;揭示了水源水库突发真菌污染对管道饮用水水质、细菌数、细菌活性以及种群结构等微生态的影响,为饮用水安全保障提供了理论基础和科学依据。本研究主要结论如下:(1)探究了不同季节实际饮用水管道过夜滞留水体中真菌的增殖特征,结果表明:过夜滞留导致饮用水温度升高,自由氯浓度出现低于《饮用水卫生标准》(GB 5749-2022)的现象,并且水体氨氮浓度明显升高。随季节变化,水中总氮、硝态氮和总有机碳浓度均表现为先增高后下降,而氨氮平均浓度的季相差异不显著。Fe浓度在滞留后显著增加,部分采样点因管道老化使滞留水总铁浓度超过国家标准限值,最高达到了0.715 mg/L。滞留后水体真菌含量显著增加,其中冬季差异最大,春季差异最小,各季度滞留水较新鲜水中真菌群落数分别增长了2、2.6、5.3和10.8倍。相关性分析表明温度与氯浓度始终呈负相关,而温度与真菌群落数在新鲜水中呈负相关,在滞留水中为正相关。该研究结果为探明过夜滞留诱导饮用水管道水质的时空变化规律和真菌的季相增殖特征提供了理论基础。(2)探讨了外源真菌在不同滞留时间下对管道饮用水水质及微生物生态的影响,研究结果表明:真菌孢子液的加入(10 cells/m L)加速了水中氯浓度的衰减,总氮、硝态氮与总有机碳浓度随滞留时间呈下降趋势,而亚硝氮浓度明显增长,链格孢菌组(Alternaria group,AG)与产黄青霉菌组(Penicillium group,PG)分别增加了49和75倍。此外,AG与PG中细菌总细胞数明显增加,在滞留48 h后分别达到峰值,分别为1.83×10和1.79×10 cells/m L。添加真菌孢子液后提升了细菌的碳源代谢活性,其中AG的促进效果更显著。AG对氨基酸类、酯类和胺类的利用能力较强,PG中丙酮酸甲酯等酯类易被利用,而不易利用单糖。变形菌门(Proteobacteria)为AG的优势物种,而PG以拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)为主。SEM结果表明AG与水质、细菌数和细胞活性均为正相关,而与金属为负相关;PG中除水质外均为负相关。该研究结果为探明微生物生态对突发真菌入侵的响应机制提供了科学依据。(3)进一步探究了不同滞留条件下外源真菌有机物诱导管道饮用水水质与微生物生态的变化规律。结果表明:在真菌有机物作用下,水体总氮与硝态氮浓度随滞留时间呈下降趋势,而亚硝氮浓度在滞留后分别增加了160和75倍。有机物成分更加多样,绿木霉菌组(Trichoderma group,TG)中包含富里酸及类腐殖质等,腐皮镰孢菌组(Fusarium group,FG)包含了腐殖质类、富里酸等。同时,流式细胞术结果表明,TG与FG中细菌总细胞数随滞留时间均表现为先增加后减少,并分别达到了1.54×10和1.77×10 cells/m L的峰值。不同真菌有机物对滞留水中细菌代谢活性的作用不同,TG能够促进细菌的碳源代谢能力,而FG有一定的抑制作用。TG中苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)和不动杆菌属(Acinetobacter sp.)为丰富度较高的种群,而FG中短根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)和固氮弧菌属(Azonexus sp.)为优势种属。多元统计分析结果表明真菌有机物的加入改变了金属对细菌群落结构的影响,并对细菌数的影响由正相关变为负相关。本研究结果为突发真菌有机物污染下饮用水中微生物生态的变化规律提供了理论依据。

关键词： 动物遗传资源   胚胎干细胞   自我更新   多能性   小分子Danofloxacin  

摘要： 动物遗传资源是基因多样性和生物多样性的重要组分，其对人类生存、人类文明和人类社会的发展都有重要的意义。目前动物遗传资源面临严峻问题，尤其是由于物种特化或者遗传信息衰竭等物种自身原因，引起动物遗传资源耗竭或可传递效率低，这将直接或间接导致遗传资源的完全丢失。胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells,ESCs）因可以在体外实现大量的均一化复制（自我更新），同时保持着分化成不同类型的组织细胞（多能性）的能力，使其可以作为获取、储存和改良动物遗传资源的模式细胞。但是目前只有小鼠和大鼠ESCs能够形成的嵌合体动物，且具有生殖遗传的能力。小鼠胚胎干细胞于1981年被Evans等人建立，生长在小鼠早期胚胎的成纤维细胞上。到1988年，Smith和Williams提出了白血病抑制因子（LIF）以可替代成纤维细胞。之后Smith又报道添加BMP4可以替代血清作用。到2008年，Ying等发明了小鼠ESCs的无血清培养2i,即GSK3β和MEK的抑制剂CHIR99021和PD0325901,随后证明此条件也可用于大鼠ESCs的体外长期培养，但是并不适用于包括人在内的其他类型动物ESCs的体外建系。因此干细胞自我更新和多能性的维持机制一直是当前研究的热点和难点。　　为了优化当前ESCs的培养条件，本实验首先将1383个化学小分子分别添加到接种低密度小鼠ESCs的培养基中，无LIF培养7天后，发现小分子Danofloxacin与MK2-IN-1可以短暂维持ESCs的未分化状态。MK2-IN-1是MK2特异性的抑制剂，前期本团队在体外已证明MK2通过磷酸化Tfcp211蛋白第393和397位丝氨酸的磷酸化，进而促进其降解，本研究通过CRISPR/CAS9系统在小鼠ESCs中将这两个丝氨酸位点突变为丙氨酸，发现此细胞的自我更新能力增强，Tfcp2l1蛋白的半衰期也延长了。接着，本研究聚焦于小分子Danofloxacin,该分子促进小鼠mESCs未分化状态的最适浓度为5μM,与小分子PD0325901搭配能够实现小鼠ESCs在体外的稳定维持，在此条件下培养的小鼠ESCs还具有分化成神经元和心肌等细胞以及产生嵌合体动物的能力。通过转录组的高通量测序，本研究发现Danofloxacin调控端粒逆转录酶基因Tert表达的显著上调。将Tert基因在小鼠ESCs里过量表达后，低密度接种该细胞，撤LIF培养7天，部分细胞克隆依然维持干细胞的标志:碱性磷酸酶活性和高水平的多能性标志基因Sox2,而且端粒酶活跃且端粒长度被延伸。相反，利用RNA干扰技术下调Tert的转录能够削弱Danofloxacin维持ESCs自我更新的能力。以上数据说明Tert对于Danofloxacin维持小鼠ESCs的干性是重要的。　　为了寻找Danofloxacin的靶点，本研究利用Swiss TargetPrediction数据库预测到了100个Danofloxacin潜在的靶蛋白。因敲低组蛋白去乙酰化酶HDAC1可以在不添加LIF的条件下促进小鼠mESCs的自我更新，所以本实验聚焦HDAC1。分子对接显示HDAC1蛋白上有多个Danofloxacin的结合位点，但是HDAC1蛋白活性体外检测显示Danofloxacin并不直接抑制其酶的活性。可是在Danofloxacin处理的细胞中，HDAC1的表达降低了，说明Danofloxacin主要通过下调HDAC1的转录来降低其活性。　　为了明确HDAC1是否调控Tert的表达，本研究进行了三个实验:首先，在HDAC1干扰的细胞中，检测Tert的表达，发现其转录被激活了;其次，由于HDAC1是组蛋白去乙酰化酶家族成员之一，所以本研究在添加Danofloxacin时检测了 H3组蛋白K9和K27的乙酰化水平，发现它们显著上调;最后，本研究进行了 CUT&Tag和ChIP实验，发现添加Danofloxacin可以提高H3K9和H3K27乙酰化的转录活性，使它们在Tert的启动子位点上存在更多的富集位点。以上数据说明Danofloxacin抑制HDAC1,进而提高H3组蛋白K9和K27的乙酰化，促进Tert的表达。　　综上，本研究中筛选到小分子Danofloxacin可以在体外促进ESCs自我更新和多能性的维持。Danofloxacin发挥作用的部分机制是通过解除HDAC1介导的H3K9和H3K27去乙酰化，最终通过诱导Tert的表达稳定端粒的长度。这些研究结果丰富了干细胞的调控网络，为优化ESCs的体外培养条件提供了有用的线索，有利于未来不同动物ESCs库的建立，从而为动物遗传资源的保护提供新策略，有助于生态系统的多样性的研究和保护。

关键词： primed   na(?)ve   胚胎干细胞   L型钙离子通道  

摘要： 小鼠胚胎干细胞（mouse Embryonic Stem Cell,m ESCs）是小鼠胚胎着床前晚期胚泡的内部细胞团中分离出来的,可以在体外培养,具有多能性及自我更新能力,即在体外具有无限自我复制的增殖能力和多向分化的能力的细胞。从内细胞团中分离出来并注射到囊胚内具有形成嵌合体细胞或组织的能力的ESCs,这类细胞发育状态被称为na（?）ve状态。而取自小鼠胚胎上胚层细胞的干细胞（mouse Epiblast Stem Cell,m Epi SCs）注射到囊胚后不能形成嵌合体细胞,这种小鼠胚胎发育状态称为primed状态。研究小鼠胚胎primed状态向na（?）ve状态的转变,筛选促进转变的条件,从而提高na（?）ve状态胚胎干细胞的获得效率,为人源胚胎干细胞的primed-na（?）ve转变打下基础。利用胚胎干细胞通过异种嵌合获得组织或器官,特别是人源的胚胎干细胞,能嵌合获得人源的组织或器官,为再生医学领域及人造器官医疗事业提供更多的选择。钙离子是细胞内重要的离子之一,高度参与细胞生长发育过程,维持细胞生理活动,对细胞具有重要意义。调节细胞内钙离子的方式之一就是通过钙离子通道,电压门控钙离子通道（Voltage-Gated Calcium Channel,VGCC）通过调节细胞内钙离子含量,对细胞生长发育过程中的增殖、分化及新陈代谢具有重要影响。VGCC中L型钙通道被广泛研究与应用,L型钙通道的拮抗剂被称为CCBs,是研究各类神经性,心血管类等疾病方面的重要药物;L型钙通道的常用激动剂是Bay K 8644,在研究中主要作为CCBs的对照组,对其在机制研究方面并没有过多相关报道。钙通道对细胞生长发育具有重要的调节作用,在维持胚胎干细胞多能性状态也有着重要的作用。但是,关于胚胎干细胞内Ca调节促进胚胎干细胞由primed状态向na（?）ve状态转变的分子机制,目前尚未有相关研究报道。L型钙通道对胚胎干细胞的状态转变的作用是什么,激活了哪些关键下游基因,通过哪些细胞通路来发挥作用?本课题组前期已建立过表达Klf4诱导prime向na（?）ve转变（PNT转变）的体系,为探究该问题,我们在此转变体系基础上进行研究。对Epi+Klf4细胞感染测Ca质粒XCa Mp-R,对PNT转变过程中的细胞钙离子变化进行监测,发现在PNT转变早期细胞内Ca含量随天数逐渐升高,随着转变成功,细胞内的Ca含量降低至钙稳定状态。我们进一步检测细胞质钙离子升高可能来自细胞钙库内质网,我们抑制内质网上钙离子释放通道能显著抑制细胞质钙离子的升高。Bay K 8644是L型钙通道的激动剂,通过增加通道开放来增加细胞外Ca向细胞的内流,通过流式细胞技术,对加入Bay K 8644的PNT体系进行转变效率的检测,结果显示,相比于对照组加入Bay K 8644对PNT转变有促进作用。为了探究L型钙通道在PNT中的作用,q RT-PCR初步检测编码L型钙通道α亚基基因的表达情况,结果显示,随着转变天数增加,Cacna1C,Cacna1D和Cacna1S表达量均有明显增加的趋势,进一步探究L型钙通道对PNT的影响,分别对编码L型钙通道亚基的基因进行过表达和敲低,检测其对PNT转变效率的影响,结果显示,过表达钙通道编码基因对PNT转变效率有明显促进作用,而在加入Bay K 8644的情况下对钙通道亚基进行敲低,对PNT转变效率也有明显的抑制效果。以上结果表明,L型钙通道对PNT转变效率具有调节作用,可通过激活L型钙通道促进PNT效率。为进一步研究L型钙通道调节PNT的机制,我们通过q RT-PCR检测已报道的能调控PNT转变的基因表达情况,相较于对照组,Bay K 8644处理组Sp5和Stat3基因在转变早期就有较高的表达且在转变后期表达有明显升高;Klf2,Esrrb以及Gbx2在转变早期加Bay K 8644处理组的表达量并没有对照组高,但转变后期表达量升高并超过对照组的表达量。这些数据表明L型钙通道可能通过Sp5和Stat3促进PNT转变,具体的机制还需要进一步的研究。之后通过蛋白质免疫印迹实验对L型钙通道调控的钙离子相关通路及其它钙离子通道进行研究,在Bay K 8644药物处理后,Ca MK2蛋白与ERK蛋白表达加药实验组与对照组并无明显差异,并且细胞膜钙离子外排通道蛋白ATP2B1的表达随着转变天数的增加逐渐增加,说明转变后期荧光克隆稳定形成,细胞内Ca开始外流,细胞内Ca恢复钙稳态,但L型钙通道导致胞质内钙离子升高影响PNT效率,可能并不通过Ca Mk2和ERK信号通路。综上所述,本课题揭示小鼠胚胎干细胞primed状态向na（?）ve状态转变中Ca变化情况,发现Bay K 8644可以促进小鼠胚胎干细胞primed状态向na（?）ve状态转变;Bay K

关键词： 牛胚胎干细胞   Pladienolide B   剪接体   多能性相关基因   细胞活力  

摘要： 【背景】牛胚胎干细胞(bovine embryonic stem cells,BESCs)因具备较高的多能性，在牛品种保存、品种选育及研究家畜胚胎发育调控机制方面具有重要的应用价值。然而，BESCs多能性维持及分化调控的研究相对缺乏，很多机制仍不清楚。【目的】探究不同浓度Pladienolide B(PlaB)对BESCs多能标记基因、全能标记基因、胚胎细胞谱系基因表达及细胞活力的影响，为提高BESCs多能性提供参考和理论依据。【方法】利用免疫荧光检测牛BESCs多能标记基因的表达，利用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测不同浓度PlaB对BESCs剪接体、全能标记基因及胚胎细胞谱系基因表达的影响，利用RT-qPCR和Western Blot分别检测不同浓度PlaB对BESCs多能标记基因mRNA和蛋白表达的影响，利用CCK8和EDU染色检测不同浓度PlaB对BESCs增殖的影响。【结果】RT-qPCR结果显示，PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L-1时显著下调EPSCM-BESCs中SF3B1和SF3B2的mRNA表达水平；PlaB浓度为1.5nmol·L-1时，CTFR-BESCs中SF3B1和SF3B2的mRNA表达下降；PlaB浓度范围为0.5—1.5 nmol·L-1时，CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs的SF3B4和SF3B5的mRNA表达水平呈剂量依赖性增加。此外，PlaB显著下调CTFR-BESCs中SF3B6的mRNA表达。PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L-1时，EPSCM-BESCs和CTFR-BESCs中剪接体LSM4的mRNA表达显著下调。PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L-1时，显著下调CTFR-BESCs的EFTUD2 mRNA表达水平；PlaB浓度为1—1.5 nmol·L-1时能显著下调BEPSCM-BESCs的EFTUD2 mRNA表达水平。浓度为0.5—1.5 nmol·L-1范围内，PlaB均以剂量依赖性上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能标记基因OCT4、SOX2及NANOG的mRNA表达水平和蛋白水平。在PlaB浓度为0.5—1.5 nmol·L-1范围内，PlaB以剂量依赖性上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中全能标记基因MDM2、PID1及BTG2的mRNA表达水平，而下调DDIT4和PDRG1的mRNA表达水平。CTFR-BESCs中添加PlaB均上调胚胎细胞谱系基因的表达，而EPSCM-BESCs中添加PlaB显著降低GATA4、GATA6、SOX7等胚胎细胞谱系基因的表达，但是对于ZIC1没有显著影响。随着PlaB剂量增加和处理时间延长，CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs细胞活力均呈下降趋势，但CTFR-BESCs比EPSCM-BESCs更敏感。【结论】PlaB显著上调CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能标记基因和部分全能标记基因的表达；降低EPSCM-BESCs中胚胎细胞谱系基因的表达和细胞活力。PlaB对两种BESCs发挥作用的浓度及对基因表达的影响并不完全一致。由于PlaB降低BESCs的细胞活力，仍需要进一步研究以优化培养体系。

关键词： Sall4   p53   DNA损伤   增强子干扰   小鼠胚胎干细胞  

摘要： p53通过调节靶基因的转录激活和抑制,在维持小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)的基因组稳定性方面起着关键作用。目前人们对p53在体细胞中的转录调控机制已经进行了深入的研究,然而对其在ESCs中的转录调控机制却知之甚少。本研究揭示了 Sall4(spalt like transcription factor 4,Sall4)通过募集p53与p53抑制基因(p53-repressed genes)增强子区域的结合,从而特异性调控DNA损伤诱导的mESCs细胞凋亡(DNA damage induced apoptosis,DIA)。在DNA损伤状态下,Sall4作为ESCs核心转录因子被p53抑制,并且在不影响p53表达和激活状态的情况下抑制p53介导的ESC细胞凋亡。进一步实验发现Sall4作为新的p53互作蛋白,并以p53依赖的方式抑制细胞凋亡。Sall4缺失后,一方面促进p53调控的促凋亡基因的转录激活,另一方面降低p53介导的对ESC核心转录因子的抑制。因此,Sall4通过将p53募集到ESC增强子区,平衡p53在激活基因和抑制基因之间的结合比例,从而参与p53对激活和抑制基因的转录调控。基于本研究,Sall4可能通过拮抗p53介导的细胞凋亡而促进癌细胞的恶性转化。