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关键词： L-5-甲基四氢叶酸   启动子   RBS序列   大肠杆菌Nissle 1917  

摘要： 叶酸(Folic acid)属于B族维生素,其代谢产物在DNA合成及甲基化、一碳单位代谢和蛋白质代谢等方面发挥重要作用,其中,L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)是叶酸经过多步酶促反应后生成的唯一可以穿过血脑屏障而发挥作用的物质,已被广泛用于各种疾病的预防和治疗,具有广阔的市场前景。目前,对L-5-MTHF生物合成法的研究主要集中在以乳酸菌和枯草芽孢杆菌为底盘细胞的代谢工程设计上,而以大肠杆菌(Escherichia coli)为底盘细胞生产L-5-MTHF的研究较少。本实验室前期通过引入Clostridium autoethanogenum DSM 10061的Wood-Ljungdahl途径(WLP途径)中三个酶编码的基因,甲酸-四氢叶酸连接酶(fhs)、甲酰四氢叶酸环水解酶(fchA)和亚甲基四氢叶酸脱氢酶(folD)并过表达大肠杆菌自身的二氢叶酸还原酶(folA)和亚甲基四氢叶酸还原酶(metF),成功地在*** BL21(DE3)中构建了一条新的L-5-MTHF合成途径,使其产量大幅提高。在此基础上,本论文通过替换关键酶、筛选启动子和优化RBS序列,调控外源基因的表达,以进一步提高L-5-MTHF的产量。同时,考虑到利用微生物生产L-5-MTHF包括发酵和纯化提取等多个步骤,制备过程繁琐,成本较高,故本论文也尝试将底盘细胞更换为能定植于肠道的益生菌*** Nissle 1917(EcN),以期实现不纯化目标产物而直接应用该工程化益生菌的目标。主要的研究成果如下:一、通过序列比对及酶活测定筛选关键酶并用于工程菌改造,替换亚甲基四氢叶酸脱氢酶(FolD)的工程菌BL21-D中L-5-MTHF产量高于出发菌株,说明提高FolD活性能够在一定程度上解除目标产物合成的限速步骤。利用质粒pET28b(+)在***21(DE3)中对来自Blautiaproducta的亚甲基四氢叶酸还原酶(BpMTHFR)和亚甲基四氢叶酸脱氢酶(BpFolD)进行异源表达和纯化,检测到BpMTHFR和BpFolD的特异性酶活(分别为37.791±3.95 U·mg-1和378.65±7.01 U·mg-1),说明这两个酶具有良好活性并可应用于工程菌的改造。以实验室前期构建的产L-5-MTHF的工程菌*** BL21-WL为出发菌株,用上述两个酶的编码基因替换出发菌株相应酶的基因,构建了三株工程菌,诱导发酵后采用高效液相色谱法检测L-5-MTHF的产量,替换还原酶的工程菌B L21-R产量为315.94 μg·L-1,替换脱氢酶的工程菌BL21-D产量为483.53 μg·L-1,两酶均替换的工程菌产量为363.26μg·L-1,其中BL21-D与出发菌株相比产量提高了 37.34%,选用高活性的FolD更有利于目标产物L-5-MTHF的合成。二、对工程菌*** BL21-WL中外源基因的表达进行了启动子筛选与RBS序列优化,对比出发菌株,工程菌BL21-RBS6产量提高了 60.85%,实现了 L-5-MTHF合成途径相关基因的精细化调控。以pETDuet-1质粒为骨架,选取lac和trc启动子替换质粒上原有的T7启动子起始基因fhs、fchA和folD转录,将构建的工程菌诱导发酵,测定L-5-MTHF的产量,发现与出发菌株相比工程菌BL21-99A的产量提高了 37.57%,确定trc启动子更适于目标基因的表达。进一步从MIT Registry of Biological Standard Parts数据库中选取三个不同强度的RBS序列,通过融合PCR技术将不同的RBS序列分别与基因fhs、fchA和folD相连,获得6株不同基因表达强度的工程菌,诱导发酵后通过分析工程菌粗酶液中蛋白表达情况判断外源基因的翻译水平,结合L-5-MTHF的产量选取最优RBS序列组合方式,发现利用强、弱、中RBS序列分别调控基因fhs、fchA和folD是比较理想的组合方式。三、通过基因组改造和质粒表达的方法,将L-5-MTHF合成途径引入益生菌EcN中,得到可合成L-5-MTHF的益生菌EcN-99A。以益生菌EcN为底盘细胞,将原本在pACYCDuet-1上过表达的基因metF和folA整合到基因组上进行表达,使用Red同源重组的方法将两基因的启动子替换为组成型强启动子Ptip以降低多质粒过表达给细胞带来的生长压力,同时将前期设计并优化的L-5-MTHF合成线路转入EcN中,诱导发酵后检测L-5-MTHF的产量,最终得到产L-5-MTHF的益生菌EcN,产量达到316.27μg·L-1。综上所述,本论文从关键酶、启动子和RBS序列等方面优化外源基因fhs、fchA和folD的表达,以筛选出最优的组合方式,创新性地将L-5-MT

关键词： DNA测序   生产动态监测   产液剖面   缝高监测   井间连通性研判  

摘要： 油田生产动态监测主要针对油水井地层压力、产量、产液剖面等而进行的监测工作,能够对后续方案开发及措施调整进行及时研判,为油田开发动态分析提供依据。油田生产动态监测包括产液剖面测试与解释、缝高监测、井间连通性分析,通常存在需要停止生产,作业步骤繁杂,耗时长,成本高,污染储层,不能长时间连续监测等问题。为了解决上述问题,海外已优先提出将DNA测序技术应用于油田生产动态监测应用中,然而国内却尚未起步。为填补国内空白,本文充分融合油藏工程、基因工程以及大数据分析三个领域内容对基于微生物DNA测序的生产动态监测方法与应用展开研究。本文主要从三方面入手,其一是建立基于微生物DNA测序的产液剖面测试与解释方法。通过对岩屑与产液取样并测序构建基于微生物特征的地下分层方法,得到高分辨率特征的微生物地层基线,通过比较朴素贝叶斯、随机森林、Bp神经网络三种聚类方法的五个评价指标优选并改进随机森林算法,构建基于PSO-随机森林算法的产液剖面解释模型,可耗时短、精度高的描述各地层产液剖面。其次建立了一种基于微生物DNA测序的缝高监测方法,通过分析产液剖面确定有效裂缝高度、最大裂缝高度与最小裂缝高度。最后建立了一种基于微生物DNA测序的井间连通关系判定方法,通过对比注采井产液的DNA测序结果,进行主成分分析等以此评价注采井间连通程度,比对传统示踪结果验证该方法的可行性。通过上述三方面应用的研究,最终实现基于微生物DNA测序的生产动态监测。本文通过对不同阶段产液取样并测序,获取基于时间的产液剖面、裂缝延伸高度与井间连通关系,实现低成本、无污染、操作简便、长期有效的生产动态监测的目的,并且可以将监测范围从单井迅速扩大至整个油田范围。

关键词： β-烟酰胺单核苷酸   酿酒酵母   基因工程   生物合成  

摘要： 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的前体分子β—烟酰胺单核苷酸（NMN）,因其被认为具有抗衰老的活性近年来备受关注。NMN天然存在于生物细胞中,但其含量极少且纯化困难。目前,合成NMN的方法有两种:化学合成和生物合成。化学合成的成本较高,同时存在副产物多、安全性低等问题。相比之下,生物合成法（酶法和发酵法）更为绿色和安全。酶法合成NMN的方法已经较为成熟,且具有较高的收率,但其所需的核糖和ATP等底物成本相对较高。相比之下,发酵法利用烟酰胺和葡萄糖等低成本底物合成NMN,具有工业化大规模合成的潜力。发酵法通常采用大肠杆菌作为生产菌株,但这种方法存在一定的安全隐患。使用酿酒酵母作为生产菌株是更加安全环保的生产方法。因此,本研究以酿酒酵母为生产菌株,采用基因工程策略改造酿酒酵母,使改造后的酵母具有一定的NMN生产能力,为生产更高质量的NMN产品提供有力支持。（1）首先,构建酵母单基因表达菌株。应用基因工程方法将密码子优化后的烟酰胺磷酸核糖转移酶基因（Nampt）和烟酰胺转运蛋白基因（Nia P）以及NMN转运蛋白基因（Pnu C）分别导入酿酒酵母,得到三个基因的酵母单基因表达菌株;摇瓶发酵结果显示三个基因都分别在诱导型启动子（GAL1）和组成型启动子（PGK1）的作用下明显提高了NMN在酵母中的产量,其中诱导型启动子作用的Nampt单基因表达菌株（p ESC-Nampt-TRP）的产量最高,摇瓶发酵24 h达到49.13mg/L的NMN。（2）然后,构建酵母多基因表达菌株。将三个基因两两组合,应用基因工程方法将双基因组合载体导入酿酒酵母中得到双基因酵母表达菌株,摇瓶发酵结果显示双基因组合表达菌株分别在组成型启动子（PGK1和TDH3）和诱导型启动子（GAL1和GAL10）的作用下明显提高了NMN在酵母中的产量,其中诱导型启动子作用的Nampt和Pnu C的组合表达菌株（p ESC-Nampt-Pnu C-TRP）的产量最高,摇瓶发酵21 h达到50.43mg/L NMN;将三个基因连入同一个载体,再将其导入酿酒酵母细胞得到三基因表达菌株（p ESC-Nampt-Pnu C-Nia P-TRP）,结果显示该菌株摇瓶发酵24 h的NMN产量为50.07mg/L。（3）优化改造后酿酒酵母的摇瓶发酵条件。选择上述实验改造得到的NMN生产效率最高的酿酒酵母菌株p ESC-Nampt-Pnu C-TRP进行摇瓶发酵。摇瓶发酵实验中通过优化发酵时间,底物浓度,诱导剂浓度和加入柠檬酸钠强化磷酸戊糖途径的方法进一步提高该菌株生产NMN的能力。最终该菌株在3g/L的烟酰胺底物浓度,0.5g/L的柠檬酸钠和2%的半乳糖诱导剂的作用下,摇瓶发酵20h得到52.26mg/L的NMN产量。

关键词： 胚胎干细胞   Atl3   多能性维持   胚层分化  

摘要： 胚胎干细胞主要是指分离于哺乳动物胚胎发育囊胚期内细胞团(Inner Cell Mass,ICM)的一类细胞,它们具有自我更新能力(Self-Renewal)和发育多能性(Pluripotency)。胚胎干细胞应用前景广泛,可用于生产人类器官移植材料、生产克隆动物、遗传育种等。以往对胚胎干细胞的研究大多聚焦于多能性信号通路和转录网络,而内质网相关基因在胚胎干细胞发育中的功能研究还不全面,其中Atl3(Atlastin GTPase 3)是编码类似动态膜GTP酶家族的成员,主要定位于高度弯曲的内质网膜,Atl3相关突变(Y192C和P338R)会诱导I型遗传性感觉和自主神经病变,Atl3突变对细胞内质网形态发生有重大影响,进而扰乱了正常的内质网膜动力学,影响了内质网在细胞中的分布。研究Atl3对胚胎干细胞发育的影响有助于理解内质网相关基因对胚胎命运调控的作用。本文将结合内质网膜上的驻留蛋白Atl3基因和胚胎干细胞,围绕Atl3在mESCs(Mouse Embryonic Stem Cells)的生长发育中对多能性维持与失去的影响展开研究。首先,我们探索了过表达Atl3在R1-ESCs多能性维持过程中的影响,发现过表达Atl3对R1-ESCs多能性维持并无明显影响。随后我们构建了Atl3的shRNA载体,发现在多能性维持阶段,R1-ESCs和OG2-ESCs敲低Atl3后,细胞形态发生了明显变化:克隆整体呈扁平状,细胞-细胞间粘连减少,成团克隆中单个细胞的边界清晰,传代后表型依然如此,不存在细胞系差异。而在胚胎发育过程中发生的上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)有助于细胞在胚胎中的移动,经检测,敲低Atl3后R1-ESCs和OG2-ESCs出现的细胞-细胞间粘连减少并非由EMT介导。mESCs保持圆润克隆状是其维持多能性的一个标志,我们发现在多能性维持阶段敲低Atl3使R1-ESCs的Nanog、Oct4的表达在m RNA和蛋白水平略微升高;代表着mESCs更好多能状态的na(?)ve标志基因Esrrb、Stella的表达水平也同时升高。根据敲低Atl3后R1-ESCs和OG2-ESCs的形态表型推测,敲低Atl3后很可能会促进R1-ESCs在多能性维持阶段往神经细胞方向分化,相互印证的q-PCR和WB结果证实,神经细胞标志基因Pax6、Nestin的表达水平确有所提高,敲低Atl3后R1-ESCs能促进其往神经细胞方向分化。有研究指出,Pax6过表达可以抑制mESCs的增殖,诱导细胞周期停滞,因此我们接着检测了在多能性维持阶段敲低Atl3后R1-ESCs的细胞周期和细胞凋亡,发现敲低Atl3的R1-ESCs处于G1期的细胞增加;处于G2/M期的细胞减少;细胞凋亡水平并无明显变化,这说明敲低Atl3的R1-ESCs细胞总数的减少是由于细胞周期的变化所导致的。接着我们探索了在R1-ESCs分化过程中Atl3的转录水平,用mES培养基以悬滴的方式培养EB球,发现Atl3的转录水平随着EB分化进程的推进而逐渐增加。在R1-ESCs EB分化阶段,敲低Atl3后,D6时细胞团的边缘模糊不规则且周围细胞变为扁平状,透光性强;通过q-PCR检测发现,中胚层基因的表达在D6普遍被抑制,外胚层基因Pax6在D6被明显促进。Pax6是神经外胚层的标志基因,关系到神经元特异性基因的表达。敲低Atl3的R1-ESCs在多能性维持和EB分化阶段Pax6的表达水平均上调,说明敲低Atl3会影响ESCs向神经方向分化。我们将在接下来的实验中继续探索,在R1-ESCs定向神经分化的过程中,敲低Atl3的具体影响。最后我们进行了机制上的探索,对多能性维持阶段敲低Atl3的R1-ESCs进行RNA-Seq。通过GO分析发现,差异分析中下调的基因涉及的信号通路有TGF-β信号通路,上调的基因涉及的信号通路主要是c AMP信号通路,我将继续探索Atl3是如何通过调控内质网的动态变化而影响细胞命运决定的具体分子调控机制。综上,在多能性维持阶段,过表达Atl3对R1-ESCs多能性维持没有明显作用;R1-ESCs和OG2-ESCs敲低Atl3后,细胞形态呈扁平状且游离松散且细胞与细胞间连接减少并非由EMT介导;R1-ESCs多能性基因和na(?)ve标志基因表达水平升高;细胞周期有所改变,G1期细胞增加,G2/M期细胞减少,细胞增殖能力减弱;并且促进了R1-ESCs往神经细胞方向分化;而在EB分化阶段,Atl3的转录水平随着EB分化进程的推进而逐渐增加;敲低Atl3后抑制R1-ESCs中胚层表达。

关键词： 生物艺术   媒介研究   生物伦理学   观者  

摘要： 现代生物技术的发展和艺术领域中科学手段的不断升级,为生物艺术家操纵媒介提供了更多的手段与方法;随之,生物艺术中的生命形态也呈现出多样化的特征。在生物艺术的语境下,具有生命活性的媒介承载着尤为重要的交互功能,并彰显出生命与艺术相互融合的美学特征。同时,生命这一元素不仅为生物艺术提供了一种生命建构,还渗透出生物艺术实践内在的生命伦理。本文将研究视角聚焦在生物艺术的媒介上,在以往学者对生物艺术分类的基础上,笔者将生物艺术媒介的类型分为生物材料、生命过程、生物系统以及生物概念四个类别;并将其总结出活性,多样性,互动性与时间性四个特性。根据以上类别、特征以及艺术家的实践方法,媒介在生物艺术实践中的样态可分为“活性”“符号性”“概念性”三个类别。基于“活性”媒介的艺术实践包括基因遗传与转换、生命克隆、活细胞与组织培养等,其艺术表现特征为有生命成长的过程、有生命体征和生命变化,这一类的艺术实践通常包含生命有机体的参与;基于“符号性”媒介的艺术实践中艺术家将生物材料或生物信息进行符号化的表达,例如基因、DNA序列、蛋白质等。相对于“活性”生命艺术,“符号性”媒介呈现出静态的、无生命体征的特性;“概念性”生物艺术媒介是指那些将生物材料、生物信息或生物体进行思维化表达的物质,例如生态系统、生物多样性、生物伦理等。笔者通过“艺术家—媒介—观者”的视角,分析媒介在生物艺术实践中的功能和美学特征。在生物艺术实践中,媒介涵盖了作为中介、艺术家与观者之间交互信息的通道、通道所依赖的技术手段的三种身份,实现了媒介在以往艺术中的身份上的自我突破。生物艺术媒介参与艺术实践中,不仅为后者带来了丰富的生命美学特征,同时也让人们对参与艺术实践中的生命和人类自身进行反思与审视。生物艺术中,人类操控和改造自身或其他物种的这一行为,源于艺术家的创作理念,他们想借此形式语言来警醒人们对自然与科技的尊重,倡导人与物种的和谐相处;同时,这一行为本身意味着将人类生命同其他物种的生命割离开来。所以在生物艺术的语境下,人们迫切需解决的问题不仅是如何提升技术的手段,或创造出新的生命样态,同时还需要针对生物艺术实践制定合理的道德尺度,强调生命伦理,以实现人与自然、人与机器、人与其他物种的和谐相处。

关键词： 胚胎干细胞   自我更新   转录因子   基因表达   细胞自噬  

摘要： 小鼠胚胎干细胞(MouseEmbryonicStemCells,mESCs)有两种独特的生物学特性:自我更新和细胞多能性。为了确保mESCs的干性状态，研究人员可以采用两种不同的体外培养方法:一种是使用添加了2i的无血清培养基，另一种是使用含有白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)的血清培养基。目前，国内外科研学者对mESCs的体外培养和基础研究已取得了一定研究成果，但是其他哺乳动物ESCs的体外技术仍然存在着巨大的挑战。解析ESCs干细胞维持关键基因的作用机制是解决这一问题的途径之一。转录因子Tfcp211已经被证实与ESCs自我更新密切相关，其在干细胞中高表达，过表达Tfcp211可以有效地促进ESCs干性的维持，已成为鉴定干细胞的标志基因之一。前期本团队成员已初步证明Tfcp2l1能够激活Esrrb或抑制Lef1等下游基因的表达来促进ESCs未分化状态的维持，但其下游调控网络和机制还有待深入地研究。　　本文通过PiggyBac(PB)载体构建一个过表达Tfcp2l1基因的质粒，将其转染到小鼠46CmESCs中，收集细胞进行转录组高通量测序，并将测序结果与Tfcp2l1的染色质免疫共沉淀测序结果进行联合分析,以筛选Tfcp2l1直接调控的靶基因。KEGG和GO分析显示Tfcp2l1的下游基因主要富集在与干细胞多能性的相关的调控通路，其中Tfeb被报告在mESCs干性的维持中可能发挥重要功能，因此本研究首先重点检测Tfeb与Tfcp2l1之间的关联。本研究在Tfcp2l1过表达的细胞中检测Tfeb的表达，发现后者的表达量显著增加了。相反，当使用pLKO.1慢病毒载体系统下调Tfcp2l1表达时，Tfeb的表达也降低了。而过表达和干扰Tfeb的表达，Tfcp2l1的转录并未发生改变。接着，本文在撤LIF的小鼠46CmESCs中加入LIF处理1小时和12小时，结果显示Tfcp2l1和Tfeb的表达趋势相似，可是当下调Tfcp2l1表达时，发现LIF并不能提高Tfeb的转录。以上结果说明LIF部分通过Tfcp2l1诱导Tfeb的表达。以上数据表明Tfeb是Tfcp2l1的直接下游靶基因。　　为了检测Tfeb是否可以调控Tfcp2l1促进mESCs自我更新的能力，首先本研究在无LIF存在的条件下，对培养8天的Tfeb过表达细胞株(PB-Tfeb)进行了碱性磷酸酶(AP)染色，结果显示PB-Tfeb细胞具有较高的AP活性，而PB转染的对照组细胞却分化了。同样，免疫荧光染色(IF)显示PB-Tfeb细胞高表达自我更新标志基因Klf4。以上数据表明Tfeb具有和Tfcp2l1类似的促进mESCs自我更新的功能。接着，本研究过表达Tfcp2l1的mESCs中干扰Tfeb表达，发现该细胞的边缘出现了分化，AP活性降低，低表达Klf4。表明敲低Tfeb会削弱Tfcp2l1促进mESCs自我更新的作用。　　由于Tfeb是细胞自噬的一个重要调控基因，因此在mESCs中过表达Tfeb后自噬的标志蛋白LC3A/B蛋白水平增强，而敲低Tfeb则会下调LC3A/B的蛋白水平降低。于是本文推测Tfcp2l1可能调控自噬的发生，为了验证此假设，本研究首先检测了过表达Tfcp2l1的mESCs在饥饿的条件下发生自噬情况，结果显示，与对照组PB细胞相比，PB-Tfcp2l1中的自噬标记蛋白LC3A/B的表达量显著减少，溶酶体探针的荧光强度降低了，线粒体探针荧光并未明显降低，Tfeb表达量也没有明显变化。以上数据表明Tfcp2l1负调控自噬发生，但并不是通过诱导Tfeb的。　　综上所述，本文的研究结果证明了Tfeb是Tfcp2l1的直接下游靶基因，其可以部分调控Tfcp2l1促进mESCs自我更新的功能;同时，本文还发现Tfcp2l1负调控自噬发生。本文的研究结果丰富了Tfcp2l1作用的调控网络，使科研人员对干细胞多能性的认识更加全面。

关键词： poly(A)尾巴   m6A   PAIso-seq2   小鼠胚胎干细胞   NIH3T3细胞  

摘要： DNA和蛋白质的修饰作用所引起的表观遗传调控已经得到了许多深入的研究,但是对于RNA的修饰作用仍是一个研究较少的领域。目前已知的RNA修饰已超过百种,这些转录后修饰对各个领域的RNA分子都有着十分重要的调控作用。然而,对于这些RNA修饰的位置和功能的了解确是十分有限。同时由于复杂的RNA结构与功能也使得研究RNA修饰的生物学作用成为一项具有挑战性的工作。在真核生物中,5’端的帽子以及3’端的多聚腺苷酸[polyadenylation,poly(A)]尾巴在转录调控中扮演着重要的角色,而在信使核糖核酸(messenger RNA,m RNA)的内部也存在的一些修饰作用可用于维持m RNA的稳定性。其中N6-腺苷酸甲基化修饰(N6-methyladenosine,mA)是哺乳动物m RNA和长链非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)中最常见的转录后化学修饰。在哺乳动物和酵母中,RNA的mA修饰优先发生在基因编码区和3’端非编码区(3’untranslated region,3’-UTR),说明mA修饰在转录后调控的每一个环节都起着至关重要的作用,其中包括m RNA的翻译、剪接和稳定性等。Poly(A)尾巴是绝大多数m RNAs和lnc RNAs的3’末端非模板聚合而成的一段序列。Poly(A)尾巴在m RNA的稳定性、运输和翻译过程中发挥着重要的作用。揭示poly(A)尾巴的组成、长度、调控及功能将为许多的生物学相关过程的研究带来全新的启示。随着第二代测序技术的快速发展,转录组水平已经得到了广泛的研究。但poly(A)尾巴的信息却在二代测序中是缺乏的,因此poly(A)尾巴的全长序列迟迟无法确定。为了弥补这一空缺,基于三代测序研发的包含poly(A)尾巴在内的全长转录本的测序技术[poly(A)inclusive RNA isoform sequencing,PAIso-seq]及其第二版本的PAIso-seq2测序技术被成功开发。这些技术实现了在转录组范围内测量poly(A)尾巴的长度,及其内部和3’端非A碱基以及全长c DNA。由于转录组学的迅速发展与测序技术不断的完善,不同RNA修饰的功能之间是否具有相关性成为了一个值得人们深入探究并且具有深远意义的课题。本研究结合mA特异性甲基化RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)和PAIso-seq2测序技术,通过构建包含poly(A)尾巴的包含mA修饰的全长RNA测序文库从而完成一系列生物信息学分析,对poly(A)尾巴的长度及非A碱基进行分析,最终分析mA修饰作用与m RNA和lnc RNA的poly(A)尾巴之间的关系。论文研究发现在小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和3T3细胞中,mA修饰的m RNA被多聚腺苷酸化的比例更高并且具有更长的poly(A)尾巴。除此之外,poly(A)尾巴中含有非A碱基的比例也有所不同。在小鼠ES细胞,mA修饰的m RNA中poly(A)尾巴含有非A碱基的比例显著降低。而小鼠3T3细胞中,mA修饰的m RNA中poly(A)尾巴的非A碱基比例降低幅度却很小。因此mA修饰的m RNA中poly(A)尾巴含有非A碱基的比例是细胞类型特异性的。除此之外,本论文还对mA修饰的lnc RNA也进行了同样的分析。实验结果发现,mA修饰的lnc RNA也具有更长的poly(A)尾巴,并且mA修饰的lnc RNA中poly(A)尾巴含有非A碱基的比例也存在显著降低的现象。那么在其他物种中是否也存在这样的发现,值得人们在未来继续不断的探索。综上所述,本研究对mA修饰m RNA和lnc RNA的poly(A)尾巴进行了动态分析,并证明了mA修饰与m RNA和lnc RNA的poly(A)尾巴之间存在相互作用。除此之外,本论文所获得的全长c DNA信息也为mA修饰与选择性剪接、选择性多聚腺苷酸化之间的相互作用提供了一个良好的研究方案。本论文的研究也为不同转录后RNA修饰之间的相互作用提供了一个很好的例子,对于进一步探索两种最丰富的RNA转录后修饰的功能协调提供了重要的参考价值。

关键词： 实验动物   无菌基因工程   隔离器   胚胎移植  

摘要： 目前，基因工程动物是人类探究人与动物基因功能的重要工具。然而，随着宏基因组学、代谢组学等多组学分析技术不断发展成熟，人们发现微生物在动物生理、代谢、免疫三个层面的研究中都具有巨大潜力，同时微生物组与宿主基因组之间并不独立发挥对表型性状调节的作用，而是具有复杂互作关系。这使研究学者探索基因功能时，不能轻易忽视体内微生物的存在。因此，为了更好地研究微生物与宿主基因之间的互作关系，无菌基因工程小鼠是核心工具。然而，目前无菌基因工程小鼠品种数量稀少，究其根本原因是无菌小鼠制备方法子宫切除术在制备无菌基因工程小鼠时必须分两步进行，导致成本高、耗时较长、制备效率偏低，而在无菌小鼠常规软质隔离器中无法在严格污染控制前提下进行胚胎移植无菌制备操作。因此本研究旨在创制一种可以将胚胎移植技术应用于无菌小鼠制备生产的新型隔离器。本研究主要研究结果如下:　　1.基于将隔离器与显微镜组合，本研究创制了一种隔离器。本研究通过参与无菌小鼠平台无菌小鼠制备、繁育、饲养等工作，充分了解常规无菌小鼠软质隔离器各组件功能。在此前提下，本研究完成了对所要创制隔离器的设计。该隔离器操作模块分为子操作模块A软质部分与子操作模块B硬质部分，操作人员通过子操作模块A软质部分对无菌假孕小鼠进行饲养与麻醉，通过子操作模块B硬质部分对无菌假孕小鼠进行胚胎移植。随后，本研究通过实地考察实验动物笼器具公司，了解笼器具生产材料。在此前提下，本研究检测了各种隔离器组件材质，并委托代工机构进行子操作模块A软质部分与操作子模块B硬质部分制作。最后通过实物组装对一些尺寸参数进行修正。　　2.基于创制隔离器，本研究首次建立利用非手术胚胎移植法制备无菌小鼠的技术操作流程。本研究前期胚胎操作在放置于超净工作台内的定制胚胎操作箱中进行,通过体外受精与胚胎体外培养技术获得了 C57BL/6小鼠的二细胞与囊胚。随后通过经宫颈胚胎移植装置吸取囊胚，并打包传入创制隔离器内。最后在子操作模块B硬质部分对麻醉后的假孕小鼠进行非手术法胚胎移植。　　3.基于各种检测手段，本研究创制的隔离器可以形成无菌环境，本研究创建的通过非手术法胚胎移植技术对无菌小鼠进行胚胎移植的方法可靠。本研究通过革兰氏染色镜检法、脑心浸液肉汤培养基培养法、液体硫乙醇酸盐培养基培养法、胰酪大豆胨液体培养基培养法、哥伦比亚血琼脂培养基培养培养法、分子生物学技术方法、寄生虫检查方法、病毒检查方法、无菌动物生理学特性分析方法，对创制隔离器内环境、无菌小鼠非手法胚胎移植过程中各种可能污染来源进行检测。　　综上所述，本研究成功创制一种适用于胚胎移植技术制备无菌基因工程小鼠模型的新型隔离器。该新型隔离器不仅可以维持长期无菌环境，而且适用于胚胎移植技术操作要求，其成功创制将突破传统隔离器发展瓶颈，引领无菌动物制备隔离器发展新方向。本研究将对无菌基因工程小鼠制备效率的提升及相关模型资源开发具有重要意义，继而大力推动人和动物基因与微生物互作共同影响人类重大疾病表型与畜禽重要生产经济性状等基础理论研究。

关键词： 法医遗传学   DNA   RNA   集成检测   二代测序  

摘要： 【目的】脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)遗传标记和核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)分子标记在法医学实践中的应用十分广泛。DNA遗传标记可以用于个体识别、亲子鉴定、生物地理祖先推断及表型刻画等方面。RNA分子标记可以用于组织属性推断、体液离体时间推断、年龄推断及分子病理诊断等方面。目前针对这两种标记的检测多为独立进行,存在实验流程复杂、检材消耗量大、信息关联度差等缺陷。对一份生物物证同时进行两种标记的集成检测,可以一次性挖掘生物检材的多维度信息,并实现多类信息的证据关联。集成检测可以简化实验步骤,缩短检验时间,更可以节约宝贵的案发现场生物检材。相比于法医遗传实验室常用的毛细管电泳技术而言,二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术具有高通量、高速度、集成化等特点,支持同时检测多类及大量的分子标记,更加适合法医学DNA和RNA的集成检测。目前,国内外对基于NGS的DNA和RNA集成检测技术的研究和报道有限,尤其是该技术在法庭科学中的研究较为少见,因此本次研究的目的在于探索适用于在NGS平台上对法医学DNA遗传标记和RNA分子标记集成检验的技术方法。【方法】1.比较DNA和RNA的共同提取方案本研究使用了QIAamp DNA Investigator试剂盒、Mag Attract M48 DNA手工提取试剂盒、Prep Filer Express BTA法医DNA提取试剂盒、超纯RNA提取试剂盒、miRNeasy Micro试剂盒和All Prep DNA/RNA Micro试剂盒对5名受试者的外周血进行核酸提取,通过核酸定量结果比较不同试剂盒的DNA和RNA共提取效果。2.比较DNA和RNA混合液的核酸定量方法本研究使用Qubit荧光仪(荧光检测法)和Nano Drop分光光度计(紫外吸收光度法)对核酸混合溶液进行定量,比较了这两种方法的DNA和RNA定量结果。***和RNA标记的筛选及集成检测体系的构建本研究对常用于法医学个体识别的短串联重复序列(short tandem repeat,STR)、SNP(single nucleotide polymorphism,SNP)遗传标记及可以用于推断外周血和唾液组织属性的信使RNA(messenger ribonucleic acid,mRNA)分子标记进行筛选,对这些标记进行了引物设计及引物特异性验证,并使用验证通过的DNA和RNA标记进行集成检测体系的构建。4.探索逆转录反应是否会对法医学DNA的检验产生影响利用毛细管电泳技术和NGS技术对逆转录前后的DNA溶液进行检验,并对检验结果进行统计分析。5.探索DNA和RNA集成检测的文库构建方案本研究使用文献报道过的两种文库构建方案对DNA和RNA共同进行文库构建(方法一:对总核酸进行逆转录,使用逆转录产物直接进行文库构建;方法二:对总核酸进行逆转录,使用逆转录产物及总核酸溶液的混合物进行文库构建),通过文库质检评估这两种文库构建方案的可行性。6.体液样本的检验及结果准确性验证本研究采用构建好的DNA和RNA集成检测体系在NGS平台上对两种体液共10个样本进行法医学DNA和RNA标记的检验,分析集成检测的测序参数、测序结果等,并对STR、SNP分型及mRNA的定性结果进行了准确性验证。【结果】1.使用超纯RNA提取试剂盒和miRNeasy Micro试剂盒可以在所有样本中同时提取出DNA和RNA,使用其他4种试剂盒虽然均可以提取到DNA,但是RNA的提取效果不理想,仅能从部分样本中提取到RNA。2.对核酸混合液进行定量,Nano Drop分光光度计和Qubit荧光仪的定量结果差异较大,使用Nano Drop得到的DNA定量结果为Qubit定量结果的1.2至7.2倍,使用Nano Drop得到的RNA定量结果为Qubit定量结果的2.1至14.6倍。3.本研究筛选到了10个被广泛研究的常染色体STR、45个常染色体SNP及8个mRNA分子标记,对这些标记设计的引物均具有较好的特异性。4.可以在经过逆转录的DNA溶液中检出STR和SNP,且分型结果与未经过逆转录的DNA分型一致。5.使用两种文库构建方案,均能同时检出DNA文库和RNA文库。6.使用DNA和RNA集成检测体系对10个体液样本进行检验,均能检出STR、SNP的分型结果及mRNA的表达。通过验证,集成检测体系的STR、SNP分型结果及mRNA的定性结果均具有较高的准确性。【结论】本研究开发了一种基于NGS技术集成检测法医学DNA遗传标记和RNA分子标记的实验技术,并构建了一个集成检测体系,能够同时检测10个常染色体STR基因座、45个常染色体SNP基因座和8个mRNA分子标记,可以对人的

关键词： DNA存储   酶促反应   聚合酶链式反应   DNA合成   DNA测序  

摘要： 随着计算机技术的发展,人类实现了利用磁性、光学和电子信息等存储介质进行信息存储,同时利用二进制编码方案进行信息向数字的转换,进入了数字化信息时代。然而,在人类积累了海量信息的今天,产生信息的速度也越来越快,这导致目前的存储技术难以应对爆炸式数据增长的挑战。DNA存储技术指的是按照预先设计的编码方案,将信息转换为以四种天然核酸碱基(A、T、C、G)的不同排列顺序,然后存储在脱氧核糖核酸中。相比于传统存储方式,DNA分子作为信息存储介质具有高存储密度、低维护成本等优良特性,这使得DNA存储技术成为存储信息的理想方案,并有望在未来成为具有广泛实用性的新型信息存储方式。作为一个新型存储方案,要想实现DNA存储技术的普及应用,仍需要解决诸如合成成本高、碱基利用率低等问题。针对上述问题,本文基于生物酶反应提出了一种DNA存储的新方案,并设计了针对性的信息编码方案,将数字信息转换为能够用于实际存储的DNA序列。本文的主要工作如下:一、基于多种生物酶的长链DNA存储系统。本系统将数字信息分配给大量的DNA信息短链,然后按照碱基互补配对原则将DNA短链拼接起来。通过T4 DNA连接酶等多种生物酶的酶促反应,将原本形成复合结构的大量短链DNA反应生成一整条长链DNA序列,最后使用该长链DNA分子作为信息的存储介质。二、适配于长链DNA存储系统的编码方案。针对DNA测序错误、DNA分子碱基序列限制等问题,本文设计了针对性的DNA编码算法。在结合编码方案的基础上,本文设计了具备完整DNA存储功能的长链DNA存储模型。三、长链DNA存储系统的完整生物实现。按照编码算法生成的DNA序列,本文进行了具体的分子生物实验,在验证了长链DNA存储系统可行性的同时,得到了实现长链DNA存储系统的最佳反应体系。本文构建的长链DNA存储系统是结合生物酶酶促反应的新型DNA存储技术,在通过分子生物学技术对设计的方案进行实验分析的基础上,本文提出了适配的编码算法在算法层面解决了长链DNA存储系统可能存在的问题,这些工作是生物学和计算机科学的成功结合。基于生物酶的长链DNA存储方案不仅针对目前DNA存储面临的长链DNA合成困难,合成成本高以及碱基利用低等问题进行了改善,也为DNA存储技术的实际应用提供了新思路和解决方案。