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关键词： 转基因作物   安全性   伦理辩护  

摘要： 转基因作物是现代科技发展的产物,一定程度上解决了世界粮食缺乏问题,但也从伦理上对传统种植和生活观念带来了巨大冲击。针对这一棘手问题,应该运用专业的伦理学知识从道义论和后果论等角度对抓基因作物的伦理性进行辩护,并着重推动转基因作物由实质性伦理向程序理论研究推进,对转基因作物商业化开展的可行性进行合理预测,以期为转基因作物的安全性使用提供一定的理论依据。

关键词： 精子细胞   干细胞体   胚胎干细胞  

摘要： 中国科学家2016年2月25日说,他们首次实现小鼠胚胎干细胞体外分化并获得具有功能的精子细胞。这被认为是干细胞研究的一项重要进展,为无精子症男性生育后代带来希望。这项研究由南京医科大学沙家豪教授和中国科学院动物研究所周琪院士、赵小阳教授(现单位为南方医科大学)等人合作完成,研究论文当天发表在新一期美国《细胞-干细胞》杂志上。"我们的研究首次实现了完全在体

关键词： Nanog基因   胚胎干细胞   功能  

摘要： Nanog基因是2003年发现的与胚胎干细胞更新有关的转录因子,在胚胎干细胞更新过程中具有重要的作用。详细地介绍了Nanog基因的分子结构特征,功能及其表达特点。在相关研究的基础上,进一步阐述了Nanog基因在胚胎干细胞自我更新中的作用机制及它与肿瘤发生的关系,具有一定的理论意义。

关键词： 含补肾中药大鼠血清   人胚胎干细胞   体外分化   类卵泡结构  

摘要： 目的:应用含补肾中药血清研究补肾方对人胚胎干细胞体外分化为类卵泡结构的研究。方法:以H9人胚胎干细胞为实验对象,诱导H9细胞形成拟胚体(EB),加入含22、23、24、25、26、27#方的含药血清,血清浓度为3%;另以分化诱导因子骨形成蛋白4(BMP4)作为阳性对照,BMP4终浓度为100pg/ml;以不加BMP4的完全培养液作为空白对照。显微镜动态观察H9拟胚体生长和分化的形态学变化;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)技术检测EB和分化细胞生殖分化标志基因的表达;采用免疫荧光技术检测生殖细胞分化相关的标志蛋白表达;应用酶联免疫(ELIS)A技术定量测定了分化后期培养液中E2含量。实验产生的数据均使用SPSS19.0统计学软件处理,若同时满足正态分布和方差齐性,则取用x±s表示,运用单因素方法分析和配对T检验进行检测。结果:含补肾中药血清诱导H9拟胚体生长及分化1.1各含药血清组可明显促进EB的生长和诱导EB分化,在诱导分化第3天出现与阳性对照类似的早期分化特征:大量细胞从EB游离,EB逐渐缩小呈不规则形;同时收集EB及游离细胞检测胚胎干细胞分化标志基因Oct-4 mRNA的表达。结果显示:加入含药血清前其Oct-4基因大量表达,加入含药血清培养第3天,各组EBOct-4 mRNA明显下调,表明含补肾中药血清在短期内即启动EB分化。1.2进一步检测了与生殖发育相关的基因表达,各含药血清组对生殖分化相关基因的表达有明显差异,其中23#含药血清在诱导GDF9、ZP1和SCP3的表达均强于BMP4。进一步采用免疫荧光技术检测了 23#含药血清组诱导EB分化第5天GDF9的蛋白表达。与mRNA水平检测结果一致,阴性对照组因具有自发分化特性,GDF9有较弱表达;BMP4和23#含药血清诱导的GDF9表达明显增强,且23#含药血清优于BMP4。2.含补肾中药血清诱导人胚胎干细胞向生殖特异性组织细胞分化2.1含药血清诱导分化5-7天,BMP-4阳性对照组和23、25、26#含药血清组均可观察到一类明显大于其它分化类型的细胞,该类该细胞直径大于50μm,形态酷似类卵细胞。继续延长培养分化时间至7-10天,类卵细胞直径增加,其边缘逐渐形成细小颗粒;诱导分化至11-16天,类卵细胞边缘的颗粒层随时间延长而增厚,胞体直径均大于100μm,某些颗粒层呈现扁平状结构。推定这类被颗粒细胞层包裹的细胞为类卵泡结构(follicle-like structures,FLSs)。为了证实含药血清诱导分化的类卵泡结构,选择23#含药血清诱导分化并持续16天,在显微镜下观察和记录了 FLSs形成的动态变化。综合分析结果显示,含药血清以及BMP4可在5-16天内,诱导H9胚胎干细胞形成至少3种FLSs结构,包括从始基卵泡(primordial follicles)→初级卵泡(primary follicles)→次级卵泡(secondaryfollicles)的发育。2.2补肾中药诱导分化类卵泡形成的分子标志物鉴定2.2.1原始卵泡期的分子标志物分析为了进一步证实类卵泡结构的形成,选择23#含药血清,培养H9细胞3-7天,在原始卵泡形成数量较多时,应用RT-qPCR技术检测原始卵泡形成过程中3种分子标志物表达的动态变化。23#含药血清在诱导分化3、5、7天,均上调GDF9和SCP3的表达,呈现时间依赖性;23#含药血清也诱导VASA表达,但在分化第7天表达下调。GDF9和SCP3表达的时间依赖性与原始卵泡在体外分化发育的时间基本一致;VASA基因在诱导分化第7天表达下调,提示VASA的表达与始基卵泡发育有关。另选择23#含药血清诱导培养第7天的原始卵泡,检测了GDF9的蛋白表达,与基因表达水平一致,在单个类卵泡结构中显示较强的荧光信号。2.2.2生长卵泡期的分子标志物分析另收集培养7-16天的分化细胞,检测了生长卵泡形成期间3种分子标志物表达的动态变化。23#含药血清诱导分化7、9、11天,均上调ZP1、ZP2和ZP3表达,并呈现时间依赖性。对23#含药血清诱导培养第11天的生长卵泡,检测了ZP1的蛋白表达,结果显示在单个生长卵泡结构的颗粒层与卵母细胞之间有较强的荧光信号。2.3补肾中药诱导的卵母细胞发育的形态学特征原始卵泡和生长卵泡期的卵母细胞为初级卵母细胞,具有减数分裂Ⅰ各期特征,为了证实含药血清诱导的初级卵母细胞形成的减数分裂Ⅰ特征,采用免疫荧光技术,应用β-actin染色细胞骨架,Hoechst33258染色减数分裂各期的核结构,以此鉴定被颗粒层包裹的类卵母细胞。结果显示,23#血清诱导分化7-16天的类卵细胞包括有卵原细胞和处于细线期、偶线期、粗线期的初级卵母细胞;在含药血清诱导分化过程中偶见处于双线期的卵母细胞。这从减数分裂前各期的形态学特

关键词： 转基因作物   基因污染   隔离法律制度  

摘要： 转基因作物商业化种植有可能引发基因漂移,从而造成基因污染。基因污染一旦发生它将会给生物多样性带来毁灭性的破坏,其后果不堪没想。隔离制度的主要就是通过防止转基因产品与其他普通产品之间发生基因漂移,来达到防治基因污染发生的目的。完善的转基因作物基因污染隔离法律制度,对于有效地防治基因污染具有十分重要的作用。

关键词： 谷胱甘肽   (基因工程)体外酶法   耦合反应   多聚磷酸激酶   谷胱甘肽合成双功能酶  

摘要： 谷胱甘肽在医药领域、食品领域以及美容方面都有广泛应用。一直以来关于谷胱甘肽的生产方法、分离手段等的研究层出不穷,但是关于怎么提高谷胱甘肽的产量,因为生产条件限制、谷胱甘肽双功能酶的产物抑制作用等原因,目前为止仍然是亟待解决的难题。体外酶催化法生产谷胱甘肽的方法因为生产过程容易调节相关的各个因素,所以是近年来广泛研究的一种简单有效的生产方法,但是ATP供给问题是该方法的一个重要的限制条件,所以体外酶法生产谷胱甘肽目前还不能很有效的应用于工业生产本课题针对上述两个问题分别进行研究,得到了明确的实验结果：利用体外酶法耦合特定菌种来源的多聚磷酸激酶和谷胱甘肽合成双功能酶两种酶,最终实现简单、高效率、低成本生产谷胱甘肽的目标。课题中应用的多聚磷酸激酶和谷胱甘肽合成双功能酶的来源是研究成功的关键因素。课题的研究内容路线设计主要有以下几点：(1)查阅文献分别对比各种菌种来源的多聚磷酸激酶(PPK)和谷胱甘肽合成双功能酶(GS)的催化效果和酶催化动力学参数,选择对应合适的基因ppk和gs。然后以选择的合适基因片段为目的基因,构建目的基因的重组载体,异源表达成功得到目的蛋白。SDS-PAGE蛋白电泳法作为目的蛋白是否成功表达的检测手段,验证ppk和gs对应的催化酶PPK和GS的成功表达。(2)用异源表达的高效低耗的多聚磷酸激酶(PPK)和产物抑制作用弱的谷胱甘肽合成双功能酶(GS)做体外酶法耦合催化生产谷胱甘肽的尝试。在初步尝试成功的基础上,优化反应体系中各物质的浓度,确立影响反应的关键因素之后对反应关键条件进行逐个优化,最终得到耦合反应的最适条件。优化结果显示,谷胱甘肽生产体系可以从30 mM扩大到50mM;在优化得到的反应条件下,与同类生产方法相比,GSH产量由8g·L-1提高到13 g·L-1,对应转化率为83.8%;与此同时,耦合反应体系中外源ATP的加入量仅为体系需求总量的20%。总之,与前人研究成果相比,本课题使谷胱甘肽产量提高1倍,同时反应底物成本降低67.9%,这对于工业生产谷胱甘肽是一个重大突破。(3)在上述研究成果显著的基础上,扩大耦合催化反应体积继续进行探索。首先对含有重组载体的菌株进行高密度发酵,高压匀浆破胞得到大量的粗酶液。以粗酶液为催化载体,扩大耦合反应体积到250 mL。体积扩大后耦合反应生成的GSH浓度仍能达到12.32 g·L-1,对应转化率为80.24%。本课题的突破点在于,运用Pasteurella multocida来源的谷胱甘肽合成双功能酶GS产物抑制效应弱,允许催化反应体系浓度提高到50 mM,为提高谷胱甘肽GSH的产量提供了可靠的基础。运用corynebacteriumglutamicum来源的多聚磷酸激酶PPK不仅能以低聚合度的多聚磷酸为磷酸供体,而且催化效率高,能在耦合反应中催化ATP循环再生高达4次。

关键词： lncRNAs   DNA损伤应答   p53   ChIP-seq公共数据集  

摘要： 背景:非编码RNA是指一类不编码蛋白质的RNA,包括miRNAs(microRNAs,微小RNAs),piRNAs(piwi蛋白相互作用的RNAs),lncRNAs(long Non-coding RNAs,长链非编码RNAs),snoRNAs(small nucleolar RNAs,核糖体小RNAs)等,研究表明,这些非编码RNA不仅在正常的生长发育和生理过程中发挥重要作用,而且与多种疾病的发生发展密切相关。近几年lncRNAs的作用机制和功能受到了广泛关注,研究发现,lncRNAs在维持基因组稳定性过程中起到重要作用。维持基因组的稳定性是细胞发挥正常功能及维持生命的必要条件。目前已经发现多种可以对DNA造成损伤的因素存在于生物体内部或外部环境中,这些因素会破坏基因组的稳定性,甚至导致疾病的发生。DNA损伤修复能有效维持基因组稳定性,保持基因编码信息不变。若损伤的DNA未被及时修复,会造成维持基因组稳定性的重要因子的功能缺失,从而引起基因组的不稳定性和基因突变,造成肿瘤抑制基因和致癌基因的突变积累,导致细胞生长增殖失调等细胞生理现象,最终引发癌症。研究表明,p53是DNA损伤应答(DNA Damage Response,DDR)通路中重要的肿瘤抑制因子,可以维持基因组的稳定性,避免突变发生,并在抑制肿瘤细胞生长、DNA损伤修复以及诱导细胞凋亡等过程中占据重要地位。在DNA损伤应激条件下,转录因子p53可以激活引起细胞周期阻滞的基因或使受损伤的细胞发生凋亡,因而维持了细胞的稳定性。近年来研究显示,lncRNAs可以维持基因组稳定性,并在此过程中发挥重要的功能,尤其是在p53影响DNA损伤应答信号通路中发挥了重要的功能,如Hall等人在小鼠细胞内发现lincRNA-p21可以通过影响辅抑制物p21的表达,最终引起p53依赖的DNA损伤后凋亡。基于p53在肿瘤的发生发展中的重要作用,参与p53信号通路lncRNAs的表达和功能逐渐被人们所关注。根据已有的研究,发现lncRNAs参与p53相关的DNA损伤应答通路主要通过两种机制,一方面,lncRNAs通过与染色质调控因子相互作用介导转录抑制;另一方面,lncRNAs通过与组蛋白修饰激活因子结合来促进转录激活。由于lncRNAs在DNA损伤应答通路中起到至关重要的作用,研究者们使用不同的策略获得lncRNAs,并对它们表达水平进行分析,进一步研究lncRNAs在DNA损伤应答过程中的功能。通过组蛋白修饰、染色质调控因子和转录因子结合分析,可以对lncRNAs的功能进行初步分析。有研究表明,果蝇中的Dmp53与人类的p53同源,保守性极高。到目前为止,在生物体水平还缺少对lncRNAs作用机制的研究,并缺少在模式生物果蝇的功能分析和机制研究,在果蝇中已有的Ch IP-seq数据也尚未整理分析。我们通过RNA-seq技术分析了果蝇中依赖p53的与DDR相关的lncRNAs,根据已有的ChIP-seq数据库中数据信息进行统计分析,建立果蝇的ChIP-seq公共数据集,为深入研究lncRNAs的功能和作用机制提供了数据基础。目的:获得果蝇中与p53相关的、参与DNA损伤应答的lncRNAs,分析已有的ChIP-seq数据信息,建立果蝇中的ChIP-seq公共数据库。方法:1.将野生型和p53缺失型果蝇胚胎经过DNA损伤处理,提取RNA,进行RNA-seq测序。2.对RNA-seq数据进行分析,获得DNA损伤应答过程中差异表达的lncRNAs.3.搜集已有的ChIP-seq数据,将已有的数据进行归纳分类,得到系统的ChIP-seq数据体系。4.构建差异表达lncRNAs的突变gRNA质粒。结果和结论:通过对RNA-seq数据的分析,获得了169个DNA损伤应答中差异表达的lncRNAs;运用qPCR技术对差异表达的lncRNAs表达数据进行验证;构建了差异表达lncRNAs的gRNA质粒,用于建立突变果蝇,进行体内功能研究;收集已有的Ch IP-seq数据,对数据信息进行归纳分析,建立以果蝇为模式生物的ChIP-seq公共数据集。

关键词： Asxl2   小鼠胚胎干细胞   分化   心肌发育   表观遗传  

摘要： 背景:果蝇Asx(Additional sex combs)基因是ETP(Enhancers of trithorax and Polycomb)基因的一种,其编码的蛋白能调节或招募Polycomb抑制复合体(Polycomb-group repressor complex,PRC)和trithorax激活复合体(trithorax-group activator complex)。Asxl2基因是果蝇Asx基因的哺乳动物同源类似物,在2003年被鉴定出来,之后在乳腺癌,前列腺癌,膀胱癌,胰腺癌等多种人类癌症中发现人ASXL2基因的突变。近年来的研究发现,Asxl2在哺乳动物心脏中高表达并且对哺乳动物心脏的正常发育是必需的,Asxl2-/-小鼠的心脏功能出现缺陷。但是关于Asxl2在疾病中的功能和分子机制的研究尚不深入。有研究发现,Asxl2与泛素羧基末端水解酶Bap1(BRCA1 associated protein 1)形成一个复合体,去除组蛋白H2A第119位赖氨酸单泛素化(H2AK119ub1)的修饰。Asxl2-Bap1复合体的催化活性与Asxl2功能的关系需要进一步研究。目的:本研究中,我们想要证明Asxl2在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,m ESC)向心肌细胞分化过程中的作用。并且找到Asxl2结合蛋白,为阐明其分子机制打下基础。方法:利用CRISPR/Cas9n系统,构建Asxl2基因敲除的mESC单克隆细胞系,提取基因组DNA,genotyping PCR扩增出靶位点附近的DNA片段并测序,Western blot检测Asxl2的表达;利用悬滴法,将野生型m ESC和Asxl2基因敲除的m ESC单克隆细胞系向心肌细胞分化,在分化的2天观察细胞形态的变化,在分化第9天统计能自发跳动的细胞团所占的比例,在分化第0、2、5天检测心肌发育转录因子Mef2c(myocyte enhancer factor2)、Hand1(heart and neural crest derivatives expressed transcript 1)的表达;利用免疫共沉淀法(Co-Immunoprecipitation,Co-IP),在m ESC细胞中检测Asxl2结合蛋白。结果:第一部分:利用CRISPR/Cas9n系统构建Asxl2基因稳定敲除的m ESC单克隆细胞系1.成功构建靶向Asxl2基因的CRISPR/Cas9n重组质粒。2.将2个重组质粒共转染m ESC细胞,嘌呤霉素筛选后得到亚克隆细胞系,经genotyping PCR扩增出靶位点附近的序列并测序,验证得到一株Asxl2基因突变的单克隆细胞系。*** blot证实该m ESC单克隆细胞系中Asxl2表达缺失。第二部分:Asxl2基因是m ESC向心肌细胞分化所必需的***2基因稳定敲除的mESC单克隆细胞系与野生型mESC细胞相比,在向心肌分化过程中,表型发生改变。***2基因稳定敲除的m ESC单克隆细胞系与野生型m ESC细胞相比,在分化第9天能形成自发节律性收缩的细胞团比例减少。***2基因稳定敲除的m ESC单克隆细胞系与野生型m ESC细胞相比,在分化过程中心肌发育转录因子Mef2c、Hand1的表达下降。第三部分:在体内,Asxl2与Bap1能结合,而不与Ezh2结合结论:1.小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的过程中需要Asxl2的调节。***2与Bap1结合,与Ezh2并不能结合。

关键词： 基因改造   微生物   工程菌   番木瓜环斑病毒   转基因动物   基因工程   转基因生物  

摘要： 从原理上来看,转移基因并不难理解。不过,由于不同物种间基因表达的难度不一,对有着复杂调控机制的后生动植物来说,转基因的具体操作还是很复杂的。因此,转基因技术最早是从较简单的微生物开始,而对细菌、酵母(部分单细胞真菌的统称)的基因改造也是基因工程中历史最悠久、研究最广泛、取得实际应用成果最多的领域。细菌和酵母的生理结构和遗传物质都比较简单,具有生长速度快、对环境因素敏感、便于进行大规模培养、容易进行遗传物质操作等优点。经过基因改造后的微生物一

关键词： 细胞分裂素   异戊烯基转移酶   基因工程  

摘要： 本文介绍了细胞分裂素的种类和生物合成过程，阐述了异戊烯基转移酶是细胞分裂素生物合成过程中的重要限速酶，其编码基因ipt已被克隆并在植物基因工程得到广泛应用。重点综述了转化ipt基因可增加植物内源细胞分裂素的含量，在延缓叶片衰老、提高作物产量、诱导单性结实、抗旱、抗病虫害、抗寒等方面起到了显著作用，并分析了ipt基因在植物基因工程中应用研究方向。