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关键词： 井冈霉素   基因组   色素   阿卡波糖   异源高产  

摘要： 井冈霉素是我国自主研发并实现大规模产业化生产的第一个农用抗生素,主要由吸水链霉菌井冈变种(Streptomyces hygroscopicus ***)产生。它对防治水稻纹枯病具有特效,在亚洲的水稻产区需求量巨大。同时,井冈霉素及其衍生物可作为治疗II型糖尿病的药物阿卡波糖和伏格列波糖的合成前体,具有很高的经济附加值。鉴于其市场需求的不断攀升,利用代谢调控和基因工程手段来优化井冈霉素高产菌株的发酵性能,获得产量进一步提高的菌株,是本论文的研究重点。前期研究发现井冈霉素野生型菌株5008中存在三套同源的afsA-arpA代谢调控基因,组合缺失A因子受体基因shbR1和shbR3能明显上调valABC的转录水平,井冈霉素的终产量提高约40%。因此,我们首先通过缺失高产菌株TL01中shbR1和shbR3基因,促使井冈霉素的发酵产量分别提升14%和11%,在组合缺失菌株中井冈霉素的终产量由22.5 g/L提高到28 g/L。商品化的井冈霉素粗品通常包含约70%的A组分,15%的B组分,以及其他类似物。与有效成分A组分相比,B组分具有明显低效的抗病原真菌活性。前期研究推测ValE与ValJ蛋白可能催化A组分转化成B组分。在缺失valE基因后,突变株只产生少量的B组分;在缺失valJ基因后,突变株中B组分的含量与出发菌株相比减少了35%。并且不论是缺失valE基因,还是缺失valJ基因,对井冈霉素A的产量没有影响。由此,通过基因工程改造,我们成功实现了井冈霉素A组分的特异性积累。井冈霉素工业发酵中会产生大量的色素,48小时发酵液呈现深褐色,加大了下游分离纯化的难度,并影响了产品的色泽、产率和质量。为了消除发酵液中的色素,我们通过全基因组分析,在基因组中寻找到了四组可能参与色素合成的基因,分别参与以酪氨酸为前体的黑色素、III型聚酮合酶(以下简称为PKS)编码的黑色素、II型PKS编码的孢子色素、来源于尿黑酸的褐黄素的合成。通过对上述基因簇进行逐一中断,和出发菌株TL01相比,多巴类黑色素基因突变株PY06中井冈霉素的发酵产量提高了12%;III型PKS编码的黑色素基因簇突变株PY07产量无明显变化;II型PKS编码的孢子色素基因簇缺失和褐黄素基因缺失,分别导致井冈霉素产量下降11.7%和17.2%。所有突变株中井冈霉素基因簇转录水平和发酵液颜色均没有明显变化。基于上述改造过的高产菌株,我们进一步中断井冈霉素生物合成基因簇,成功构建了用于高效表达氨基环醇类化合物的异源宿主。一方面,我们将包含阿卡波糖天然合成基因簇的整合型质粒引入到阿卡波糖基因簇被中断的原始菌株Actinoplanes *** 50/110(?acb)中,可以检测到阿卡波糖合成能力的恢复。但该基因簇在Streptomyces coelicolor M145和Streptomyces lividans 1326中的转录量极低,检测不到阿卡波糖的产生。这暗示可能存在未知的副调控基因抑制阿卡波糖天然合成基因簇的转录,或者缺乏激活该基因簇表达的正调控基因。另一方面,我们选用井冈霉素基因簇的温敏性启动子PvalA,并将阿卡波糖生物合成的17个可能必需基因进行串联组装,并将其引入上述的宿主中,检测各基因的转录水平。综上所述,本论文通过全基因组分析,对井冈霉素高产菌株TL01进行了系统地改造,得到了井冈霉素产量提高、有效成分A组分特异性积累的衍生菌株。同时尝试了天然的和人工重组装的阿卡波糖天然基因簇的异源表达,为异源高产阿卡波糖奠定了基础。

关键词： 转基因作物   成员国   进口   欧洲   孟山都   会员国   基因工程   转基因技术   生物技术产品  

摘要： 人口增长、可耕地面积减少加速了对转基因生物种子的需求,此类种子相对于传统种子而言,抗性更强且产量更大。然而,尽管转基因种子优点突出,但其市场化仍受到一些国家政策制度的极大限制。目前,转基因技术在许多国家都存在高度争议,一方面受到希望增产和改良品种人士的极力推崇;另一方面,强烈反对转基因食品的民众纷纷向其发难……

关键词： 人类基因组计划   人工合成   改写模式   人类细胞  

摘要： "人类基因组计划改写"是一个自然发展进程,将使人类基因研究从"读取模式"转变成为"改写模式"。——美国纽约大学杰夫·博克(Jef Boeke)教授据英国《每日邮报》报道,日前,科学家宣布了一项宏伟计划,将在10年之内人工合成完整的人类细胞。这一项目被命名为"人类基因组计划改写",有助于研究人员制造用于研究的合成人类基因和染色体。研究人员指出,如果这一项目得以顺利进行,将有

关键词： 胚胎干细胞   端粒长度   iPS细胞   神经分化   Tcstv1基因   Tcstv3基因  

摘要： 本文主要从以下几个部分展开论述：　　第一部分 Tcstv1和Tcstv3延长小鼠ES细胞的端粒长度　　小鼠胚胎干细胞（ES细胞）是从早期胚胎中分离、体外适当条件培养而得到的一种多能性干细胞，它们可以维持自我更新并具有发育形成胎儿各个组织的能力。最近的研究发现，小鼠ES细胞中存在着一类异质性的亚稳态细胞，它们可以零星地进入类2-细胞胚胎状态(2-cell-embryo-like state)，表达2-细胞胚胎特异基因，并对维持ES细胞的发育潜能具有重要意义。已经有研究表明，2-细胞胚胎特异基因Zscan4对于维持ES细胞的端粒长度、基因组的稳定性以及发育多能性具有重要作用。然而，ES细胞中其他2-细胞胚胎特异基因的功能目前了解的还不多。我们研究发现，2-细胞胚胎特异基因Tcstv1和Tcstv3在ES细胞端粒长度调控中起作用。过表达或者敲低Tcstv1和Tcstv3都不会立即影响ES细胞的生长增殖、多能性以及体外分化。然而，Tcstv1或者Tcstv3过表达会使ES细胞端粒延长，反之Tcstv1/3敲低使得端粒长度缩短。Tcstv1或者Tcstv3过表达不会影响ES细胞端粒的稳定性。此外，Tcstv1可以提高Zscan4蛋白水平，并且促进端粒姐妹染色单体交换(T-SCE)的端粒重组。而且，Tcstv1/3敲低可以使Zscan4蛋白水平降低。总的来说，Tcstv1和Tcstv3参与ES细胞长期自我更新所必需的端粒维持。我们的结果同时也提示着，Tcstv1/3蛋白可能会与Zscan4蛋白相互协作，并使其蛋白稳定，但具体的分子机制仍需进一步研究。　　第二部分 Jnk1缺失的iPS细胞神经分化缺陷模型的建立　　c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-teminal kinase，JNK)是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase，MAPK)信号通路家族中的一员。JNK由Jnk1、Jnk2和Jnk3三个基因编码，其中JNK1和JNK2在组织和细胞中广泛表达，而JNK3的表达则具有组织特异性。缺失Jnk1和Jnk2两个基因的小鼠胚胎发育存在神经管闭合缺陷，且是胚胎致死的。虽然单独缺失任何一个Jnk基因的小鼠都是可以存活的，但Jnk1缺失的小鼠存在着一些神经系统缺陷，比如前连合形成受损以及轴突和树突微管完整性的逐渐缺失。然而其神经发育缺陷的特定阶段及具体机制仍然有待进一步研究。诱导多能性干细胞（iPS细胞）的建立为疾病发病机制的研究以及以干细胞为基础的临床治疗的发展提供了新的机遇。在本研究中，我们将Jnk1缺失(Jnk1 KO)的TTF细胞诱导重编程为iPS细胞并以此建立神经分化缺陷模型。Jnk1缺失可以促进iPS细胞的早期重编程，而且Jnk1 KO iPS细胞表现出正常的多能性干细胞的特征，并具有体内和体外三胚层分化的能力。然而，在拟胚体(EB)形成的自由分化中，Jnk1 KO iPS细胞向神经分化减少。在神经定向分化中，Jnk1 KO iPS细胞向早期神经前体细胞的分化能力降低。此外，在体内畸胎瘤分化中，与野生型(WT) iPS细胞相比，Jnk1KO iPS细胞生成的神经上皮组织显著变小、规则性降低。因此，我们的研究对于深入了解JNK1在神经发育及分化中的作用以及可能导致的相关神经疾病的发病机制提供了新的视角。

关键词： Junctophilins(JPs)   Megf10   兰尼碱受体(RyRs)   神经突极化   凋亡   吞噬   Ca2+瞬变   cAMP   生长锥   GAP43   胚胎干细胞(ES细胞)   轴突修剪  

摘要： Junctophilin 3 (JP3) 和 Junctophilin 4 (JP4)在大脑皮层、海马及小脑高表达,是一类存在于可兴奋细胞中的膜结合蛋白。JP3,4能够连接细胞膜和内质网膜,形成膜连接复合物,对维持胞内钙稳态有着重要作用。研究发现,Jp3,4基因双敲除的小鼠出生后不但出现严重的发育迟缓及致死率高,而且呈现记忆认知功能损伤和运动协调功能失常,提示这两种蛋白在维持动物记忆和运动功能上起重要作用,并在胚胎神经分化发育过程中的不可或缺性。但其在胚胎发育过程的表达变化、功能特征以及功能差异尚未见报道。JP3,4能否在神经分化发育早期便参与神经系统的建立也亟待探索。果蝇表达的JP同源蛋白Undertaker (UTA),能通过维持吞噬细胞内Ca平衡来参与凋亡细胞的清理。神经分化过程伴随大量细胞凋亡,未被及时清理的凋亡细胞则会发生二次坏死,导致细胞毒性并影响轴突的生长。凋亡的细胞会释放出"find-me"信号,快速吸引周围的细胞迁移,同时也会暴露出"eat-me"信号,保证吞噬细胞的识别和吞噬。然而,哺乳动物神经组织JPs是否也具有相同的功能迄今未见报道。除了需要严格和适宜的外部环境,神经元极化及轴突生长还受胞外信号的调控。凋亡细胞能够召唤周围细胞的增殖,但是否能对神经极化以及轴突生长产生影响尚未见报道。同时,JP3,4在连接凋亡、吞噬及神经极化之间扮演的角色也亟待阐明。在神经发育初期,未分化的突起通过竞争,最终只形成单一的轴突,而其他的突起将会停止生长或者变成树突,该过程使神经元在形态和功能上都形成了极化。神经元的极化及生长需要局部的Ca信号和cAMP,形成局部极化。通过TRPC内流的Ca能够启动轴突的特化,并激活下游CaMKI等级联信号,促使轴突形成。而在轴突切断的外周神经中,钙波会沿着轴突传向胞体,启动轴突的再生。此外,Ca信号还可以和cAMP通路相互作用形成正反馈,放大cAMP信号。在诸多突起中,cAMP浓度最高的突起能够通过正反馈不断提升内部cAMP浓度,促使该突起长成轴突,而剩下突起则长成树突。然而,胞内cAMP信号如何被唤起,Ca信号如何在局部区域被精准调控,基于JP3,4维持的胞内Ca平衡是否与此相关联尚未完全明确。本论文第一部分将对以上问题做出探索。在轴突和树突的生长过程,会有过量的轴突分支、突触以及树突树形成,在形成神经环路后,多余的轴突分支将会被选择性修剪,以保证神经信号传递的专一性。吞噬受体Megf10能够参与中枢神经系统中突触的修剪与重塑,Megf10敲除小鼠则保留了过多数量的突触。果蝇Megf10的同源蛋白Draper已被发现能够参与果蝇胚胎发育过程的吞噬,而UTA则与Draper协同完成这一事件。因此,本论文第二部分(附)探索了JP3,4能否在胚胎干细胞分化神经过程中参与轴突的修剪及重塑。Junctophilin-3,-4连接吞噬参与神经极化作用研究本论文第一部分考察了JP3,4参与神经极化的分子机制,探索JP3,4正常表达与Ca/cAMP形成局部极化的相关性。实验结果显示,JP3,4在ES细胞定向分化神经元早期有一过性高表达。在ES细胞沉默Jp3和Jp4,其神经分化早期表达显著降低,导致Ca/cAMP极化正反馈通路受破坏,进而抑制神经极化。抑制JP3,4早期表达高峰使神经前体细胞胞内Ca分布失去空间特异性,并导致Ca瞬变能力显著减弱,同时cAMP含量明显下降,cAMP-LKB1-SAD/MAR K2极化通路激活受阻。提示JP3,4早期高表达对维持神经前体细胞胞内局部Ca/cAMP极化正反馈通路有重要作用。与此同时,ES细胞定向分化神经早期JP3,4一过性高表达尚与吞噬作用密切相关。神经分化过程伴随大量凋亡,抑制JP3,4早期表达致使神经前体细胞清理凋亡细胞的效率显著下降。提示JP3,4在凋亡细胞清理过程需要被大量表达。进一步研究发现,JP3,4能够感应凋亡细胞的信号。凋亡细胞的刺激可快速提高JP4及吞噬受体Megf10的表达水平,并可促进JP3与RyR2、RyR3的结合,同时,JP4与Megf10的结合也显著上调。这些结果提示,除了维持内质网与细胞膜的空间距离,JP3与JP4在功能上各有分工,可分别通过JP3-RyR2,3相互作用及JP4-Megf10相互作用参与吞噬,保证神经极化适宜的微环境。最后,实验结果显示,凋亡细胞刺激可显著提升胞内cAMP的含量并激活cAMP-LKB1-SAD/MARK2极化通路,促进神经元极化。更为重要的是,凋亡细胞的刺激能够提升神经前体细胞胞浆Ca瞬变能力,易化神经前体细胞极化。该结果提示神经分化发育过程,凋亡细胞可与神经前体细胞建立联系,不仅可诱导其吞噬,同时也能分泌信号促进神经极化及轴突生长,而JP3,4在其中起着桥梁作用。附：JP3,4参与神经分化过程轴突修

关键词： 新橙皮苷   橙皮苷   鼠李糖基转移酶   基因克隆   酶学性质   分离纯化  

摘要： 新橙皮苷在植物内的含量较低,其同分异构体橙皮苷在植物体内含量较高。两者的结构上的差异仅仅是黄酮环上取代基上葡萄糖与鼠李糖的糖苷键不同。本研究希望利用生物转化法将橙皮苷转化为新橙皮苷。本文通过构建一株原核工程菌来表达鼠李糖基转移酶,该酶可以催化鼠李糖与葡萄糖通过1,2糖苷键连接,以此来合成新橙皮苷,并且对其酶学性质进行研究,还对工程菌的产酶发酵条件进行了优化研究。主要的研究内容及结果如下:1.原核工程菌的构建及表达:从Lactobacillus plantarum WCFS1的基因组中扩增得到编码鼠李糖基转移酶的glycosyltransferase(rhamnosyltransferase),family 2(GT2)基因,将该目的基因与表达载体pET-DsbA连接,得到重组表达载体pET-DsbA-GT2。将表达载体导入表达菌株BL21(DE3),成功构建得到了原核表达工程菌BL21(pET-DsbA-GT2);采用诱导剂IPTG对工程菌BL21(pET-DsbA-GT2)进行诱导表达,GT2与DsbA成功的融合表达,得到了56.7 kDa左右大小的融合蛋白(其中,GT2的大小为35.7 kDa,DsbA的大小为21 kDa)。表达方式为部分包涵体、部分可溶性表达。2.鼠李糖基转移酶的分离纯化及其酶学性质的研究:通过分离纯化分别得到了包涵体蛋白酶(GT2-1)、可溶性蛋白酶(GT2-2)两种鼠李糖基转移酶。酶活测定结果显示GT2-1的比活力为0.41 U/mg,远低于可溶性目的蛋白GT2-2的1.92 U/mg。酶学性质的研究结果:GT2-1、GT2-2两种酶的最适反应温度38-40℃,最适pH值为6.0-6.5;GT2-1、GT2-2在20-40℃处理1 h后的酶活仍能达到90%以上,当温度超过40℃时,GT2-1的酶活随着温度的升高迅速降低,当温度达到70℃时便完全失去酶活,GT2-2温度达到80℃才完全失去酶活;GT2-1、GT2-2在pH值在5-10这个范围内均具有较好的稳定性。3.重组菌BL21(pET-DsbA-GT2)表达条件的优化:以表达系数F和表达量Q为表征量,对BL21(pET-DsbA-GT2)重组菌的表达条件进行了优化。最后得到的最优表达条件为:诱导时机选择为培养10-12 h后进行诱导;诱导时间为5-6h;诱导温度为30℃;诱导剂IPTG的最终浓度为100μg/mL;摇床转速为160 rpm。

关键词： NONINVASIVE PRENATAL-DIAGNOSIS   UNCONJUGATED ESTRIOL   ALPHA-FETOPROTEIN   ANEUPLOIDY   PLASMA  

摘要： Background. With the development of massively parallel sequencing (MPS), noninvasive prenatal diagnosis using maternal cell-free DNA is fast becoming the preferred method of fetal chromosomal abnormality detection, due to its inherent high accuracy and low risk. Typically, MPS data is parsed to calculate a risk score, which is used to predict whether a fetal chromosome is normal or not. Although there are several highly sensitive and specific MPS data-parsing algorithms, there are currently no tools that implement these methods. Results. We developed an R package, detection of autosomal abnormalities for fetus (DASAF), that implements the three most popular trisomy detection methods-the standard Z-score (STDZ) method, the GC correction Z-score (GCCZ) method, and the internal reference Z-score (IRZ) method-together with one subchromosome abnormality identification method (SCAZ). Conclusions. With the cost of DNA sequencing declining and with advances in personalized medicine, the demand for noninvasive prenatal testing will undoubtedly increase, which will in turn trigger an increase in the tools available for subsequent analysis. DASAF is a user-friendly tool, implemented in R, that supports identification of whole-chromosome as well as subchromosome abnormalities, based on maternal cell-free DNA sequencing data after genome mapping.

关键词： 转基因技术   草甘膦   农药   基因工程   草甘宁   化学污染物   除草剂   草铵膦  

摘要： 近年来转基因技术发展越来越快,技术也越来越成熟,各种转基因作物的种植也被大力推广,可以预期的是,转基因的发展必将会造成大量的农药需求,而这极有可能会带动草甘膦、草铵膦等除草剂农药产品未来新的发展。转基因技术商业化20周年,全球取得空前发展。1996年至今全球转基因作物种植面积增长100倍,2015年突破1.8亿公顷,全球市场价值达153亿美元,发展中国家逐渐发力并赶超发

关键词： 干细胞   帕金森病   再生医学   中国科学院战略性先导科技专项  

摘要： 帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见于中老年人的神经系统退行性疾病,由中脑腹侧的多巴胺能(dopaminergic,DA)神经元缺失造成。这类疾病可通过移植由人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESC)或其他途径获得的多巴胺能神经元实现治疗。然而,在应用于临床之前,需要对这些多巴胺能神经元的安全性和有效性在合适的动物模型中进行充分、全面的评价。为评价由临床级人胚胎干细胞分化的多巴胺能神经元是否安全、有效,根据先导专项部署,我们建立了MPTP诱导的帕金森病猴模型,并将由人胚胎干细胞定向分化的多巴胺能神经元植入受损猴脑区。结果表明,在所有接受细胞移植的猴中,未发生移植细胞形成的肿瘤和继发肿瘤。移植细胞可分化为多巴胺能神经元并使局部多巴胺水平提高,带来不同程度的行为学改善。这些发现提示,多能干细胞分化的多巴胺能神经元移植治疗帕金森病安全、有效,可进一步应用于帕金森病的治疗。

关键词： 猪   卵母细胞   孤雌胚胎   ES细胞  

摘要： 本试验以从屠宰场采集废弃的猪卵巢为研究材料,对卵母细胞体外成熟培养体系以及孤雌囊胚胚胎干细胞的分离培养进行了探究。首先以亮甲酚蓝染色对成熟培养前的卵母细胞进行筛选,并通过添加db-cAMP来达到核质的同步成熟,进而提高卵母细胞的体外成熟质量;随后以孤雌激活后得到的囊胚为材料,从胚龄、饲养层以及内细胞团的分离几个方面对孤雌胚胎干细胞的分离培养进行了探究。试验主要结果如下:1.以13、26、39、52μmol/L的亮甲酚蓝(brilliant cresyl blue,BCB)对成熟培养前的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)染色90 min,比较不同浓度的BCB对卵母细胞的着色率、成熟率以及孤雌激活胚胎和核移植胚胎的早期发育情况。分析结果显示,BCB浓度为26μmol/L时,经染色的COCs既有较高的着色率,而又不影响其体外成熟的效率。挑选BCB+组卵母细胞进行孤雌激活和核移植试验,其卵裂率和囊胚率均显著高于BCB-组(P<0.05)。胚胎移植试验挑选BCB+组中发育较好的1细胞期重组胚对5头代孕母猪进行了移植,其中2头怀孕,1头顺利产下了6头健康胎儿。2.成熟培养液中分别添加0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的db-cAMP时,卵母细胞的成熟率随着浓度的增加依次降低,但浓度为1 mmol/L时,孤雌激活后的囊胚率最高(27.03%);卵丘细胞单层与卵母细胞共培养时,其成熟率、卵裂率及囊胚率(86.00%、89.04%、28.36%)也得到了显著提高;0.4 mmol/L的db-cAMP和卵丘细胞单层共培养时,其成熟率和卵裂率(85.78%和88.95%)与对照组差异不显著,但囊胚率(35.14%)显著提高。3.试验研究了囊胚的胚龄、饲养层的种类及囊胚的不同处理对猪孤雌囊胚胚胎干细胞分离培养的影响。实验结果显示:①第8天的囊胚贴壁率(25.00%)显著高于第7天和第9天;②以小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层时贴壁率为18.52%,显著高于猪胎儿成纤维细胞和猪子宫上皮细胞饲养层(P<0.05);③取孤雌激活后第8天的囊胚分成全胚组、孵化囊胚组、去透明带组和分离内细胞团(ICM)组进行体外培养时,分离的ICM贴壁率明显高于其他组(P<0.05)。