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关键词： 测序   生命科学   云计算平台   DNA  

摘要： 项目概况本项目通过和北京生命科学研究所、华大基因公司联合开发面向DNA测序方向的云计算平台,利用中国科学院所属单位深腾7000超级计算集群,以及中国科学院超级计算中心的技术团队,开发BLSCBIO云计算平台,加速国内基因测序的水平,提升基因测序软件的并行能力。

关键词： 乳腺癌   数据挖掘   生物信息学分析   肿瘤体细胞突变目录   癌症基因组图谱   转移性乳腺癌   游离DNA   数字PCR   基因组当量   疗效监测   循环肿瘤DNA   靶向捕获   高通量测序  

摘要： 无论从发达国家还是从发展中国家,无论从每年新发病例数量出发还是从每年死亡情况来看,乳腺癌都是威胁女性健康最常见的癌症。其中,转移性乳腺癌（Metastatic Breast Cancer, MBC）仍是不可治愈的疾病,治疗目的主要是为了减轻症状,改善生活质量和延长生存期。因此,为了避免无效治疗的持续、为了预防不必要的医疗毒性、为了明确治疗应答、合理搭配宝贵的医疗资源,筛选高灵敏并且强特异的生物标志物用于监测转移性乳腺癌患者治疗过程中肿瘤负荷的变化,具有重要的科学及社会意义。随着近年来肿瘤细胞生物学及分子生物学的深入研究,以及检测技术手段的快速发展,循环肿瘤标记由于检测的便利性和非侵入性正逐步取代受到标本采集以及无法连续监测追踪等诸多限制的组织学肿瘤标记用于肿瘤治疗过程中反应的监测。如癌抗原15-3（CA 15-3）和循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTC）等标志物已得到广泛研究。随着“液体活检”概念的推广,携带有肿瘤特异性变异的循环肿瘤DNA （Circulating Tumor DNA, ctDNA）逐渐被人们所重视,并成为肿瘤细胞生物学及分子生物学研究领域的热点和亮点。第一章基于数据挖掘技术的乳腺癌靶向外显子的筛选和验证背景：对于癌症来说,发生突变的基因仅占整个基因组的很小一部分,这表明只有有限数量的基因参与了某一类型癌症的发生和发展。因此,只有这些与癌症相关联的一组基因是监测治疗过程中肿瘤负荷变化所必需的。但遗憾的是尚无一种能够科学完整而又非常集约化的策略来明确这些与特定肿瘤类型相关的目标基因区域。目的：本部分拟基于生物信息学和数据挖掘技术筛选出与乳腺癌高度相关的目标基因区域,为后续的靶向捕获测序提供靶标,减少盲目性,节约实验成本,使检测技术的针对性更强,适用性更广。方法：从癌症基因组图谱库（TCGA）中963例乳腺癌患者中,随机选取776例作为训练集,剩余的187例作为预测集;基于肿瘤体细胞突变目录（COSMIC）数据库,筛选出乳腺癌相关基因突变所在的基因功能区域;用筛选出的潜在“靶向区域（Selector）",覆盖训练集中乳腺癌患者的遗传学改变信息进行;应用迭代算法使"Selector"在覆盖训练集中尽可能多的患者的同时达到尽可能的精简;使用生物信息学分析技术对"Selector"所涉及基因,进行KEGG pathway和Gene Ontology分析;最后通过预测集乳腺癌患者和临床生物标本对已筛选出的"Selector"进行覆盖度验证并优化完善。结果："Selector"共计包含了834个乳腺癌相关基因,961个外显子,23982049个单核苷酸变异（SNVs）,134个Indels,52个Fusions,长度为118.24kb,遍布在所有编号染色体上。按照生物学过程分类："Selector"所涉及基因所属的GO-BP分类有1348个,最多的5种途径分别是：cellular component organization or biogenesis,cellular component organization,collagen catabolic process, single-organism developmental process和multicellular organismal catabolic process。按照细胞组件注释："Selector"所涉及基因所属的GO-CC分类有239个,前五位分别是:cell projection, cytosol, endoplasmic reticulum lumen, membrane region和cytoplasm。按照分子功能注释："Selector"所涉及基因所属的GO-MF分类有269个,前5种功能分别是：ATP binding, adenyl ribonucleotide binding, adenyl nucleotide binding, anion binding和extracellular matrix structural constituent.."Selector"所涉及基因可能参与调节的KEGG信号通路包括73条,前五位主要涉及黏着斑、子宫内膜癌、小细胞肺癌、阿米巴病和促性腺激素释放激素信号通路。"Selector"在训练阶段可以覆盖100%的乳腺癌患者,预测集验证阶段亦可以覆盖高达88.7%的乳腺癌患者,平均识别每位患者2个及以上SNVs。40例独立转移性乳腺癌患者不同治疗阶段的72份生物标本验证结果显示,该区域可以覆盖100%的患者和生物标本。结论："Selector"有效的将乳腺癌相关的靶向测序区段浓缩至整个基因组大小的3.7/10万,使得后续深度测序得以实现,为后续研究提供了靶标,减少了实验测

关键词： Dysferlin肌病   DYSF基因   杂合突变   DNA测序  

摘要： 目的研究1个来自中国广西肌肉疾病家系的临床表型及可能的基因突变。方法收集到1个肌病家系,该家系中共有2例患者,症状相似,发病年龄约21岁左右,首发症状为双下肢无力和萎缩,缓慢进行性进展。采集先证者及其他家族成员的血样,提取基因组DNA,采用聚合酶链式反应(polymerasechain reaction, PCR)、直接测序法对先证者DYSF基因进行基因检测。根据先证者的基因检测结果,对8个其他家族成员进行基因检测。结果基因检测结果Duchenne肌营养不良(DMD)基因未发现存在大片段变异,先证者及其3个家族成员(Ⅱ-2、Ⅱ-3和Ⅲ-1)DYSF基因编码区第4个外显子的第268号核苷酸由C变为T (c.268C>T)的杂合核苷酸变异,导致编译第90号氨基酸精氨酸的密码子变为终止密码子(***90Ter),从而使肽链合成提前终止。先证者及其他3个家族成员(Ⅰ-1、Ⅱ-2和Ⅲ-2)DYSF基因编码区第30个外显子的第3214号核苷酸由C变为T (c.3214C>T)的杂合核苷酸变异,导致第1072号氨基酸由精氨酸变为色氨酸(***1072Trp)。结论通过本研究发现该家系DYSF基因编码区第268位点和第3214位点发生C→T突变(c.268C>T, c.3214C>T),结合临床表型,该家系的患者诊断为Dysferlin肌病,为常染色体隐性遗传,2个突变点对该病在家系的发生均起到重要的作用。

关键词： 大肠杆菌   L-色氨酸   基因工程   NADPH   耐酸  

摘要： L-色氨酸是一种重要的芳香族氨基酸,广泛应用于饲料和医药方面。本研究依据代谢工程理论,以L-色氨酸工程菌TRTH为出发菌株,构建L-色氨酸高产菌。tktA基因编码的转酮醇酶在磷酸戊糖途径中生成4-磷酸赤藓糖起主要作用。在本实验中,将两种启动子控制的tktA基因整合至假基因位点ybfG处,获得菌株TRTH(△ybfG::Ptrc 1-tktA)和 TRTH(△ybfG::Ptrc2-tktA)。通过30L发酵罐进行发酵实验,结果表明,菌株TRTH(△ybfG::Ptrc1-tktA)L-色氨酸产量36.2 g/L,相比较于菌株TRTH(32.2 g/L)产量提高12.4%。而菌株TRTH(△ybfG::Ptrc2-tktA)L-色氨酸产量 12.3 g/L,相比较于菌株TRTH下降61.8%。发酵结果表明适当增强tktA基因表达量能够增加L-色氨酸前体物E4P的合成,减少耗糖量提高L-色氨酸产量。将将解除了反馈抑制的基因trpED整合至假基因位点处构建菌株TRTH(△ybfG::Ptrc-trpED)。发酵结果显示 TRTH(△ybfG::Ptrc-trpED)L-色氨酸产量为29.3 g/L,比出发菌TRTH降低9.3%。这表明L-色氨酸工程菌质粒本身所带有的L-色氨酸合成相关基因表达量已足够。以增加NADPH为目的,将gapC基因替换大肠杆菌自身基因gapA构建了菌株TRTH(△gapA::PgapA-gapC)。发酵 L-色氨酸最终产量为 37.5 g/L,相较于 TRTH(32.2 g/L),增加15.4%。说明通过增加NADPH的供应量对提高L-色氨酸产量和减少乙酸有正向效果。菌株TRTH生产L-色氨酸时,发酵周期较长,容易染菌,若将培养基pH降低可减少生产过程中染菌的机率。构建了耐酸性菌株TRTH(△araBAD::Para-arcA)和TRTH(AaraBAD::Para-gadBC)。将菌株TRTH(AaraBAD::Para-arcA)分别在pH5.5、6.0及双阶段情况下发酵,L-色氨酸产量均提高。菌株TRTH(△araBAD::Para-gadBC)在pH6.0情况下发酵,最终L-色氨酸产量为27.45 g/L下降18.86%。发酵结果表明谷氨酸依赖性系统的强化并没有显著提高TRTH的耐酸能力。

关键词： 基因编辑   风险   人类生殖细胞干预   预防原则  

摘要： 近年来,CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑以及其他相关技术的研究受到广泛的关注。文章讨论人类生殖细胞基因编辑的风险、社会和伦理内涵,凸显相关的风险管理问题,并反对在涉及到人类生殖细胞干预进行过早的实验。论文认为应该容纳更广泛公众讨论,并以预防原则为基础推进研究。

关键词： 小鼠   遗传背景   孤雌发生   胚胎干细胞   线粒体  

摘要： 遗传背景影响动物的胚胎发育和出生后动物发育状态。动物卵母细胞孤雌激活后在体外培养可发育为囊胚,囊胚在ES细胞培养条件下生长、传代可分离孤雌胚胎干细胞(parthenogenetic embryonic stem cells, pESCs)。遗传背景影响孤雌胚胎发育和pESCs的分离效率。已有研究表明遗传背景可影响小鼠pESCs的获得效率,但父系遗传背景能否影响pESCs多能性和线粒体基因表达等特性还未知,本文立足于父系遗传背景这一因素,通过对pESCs多能性和线粒体基因表达的检测,探讨其对pESCs特性的影响,同时作为后续深入研究的参照数据。(1)本实验以父系(129/Sv、C3H)和母系(KM)小鼠来源的pESCs (KM×129/Sv FI和KM×C3H FI)为研究对象,J1 ESCs为对照,通过从形态学观察,PCR、qPCR测定多能性相关标志基因表达情况,免疫荧光检测干细胞标志蛋白的表达,细胞体外拟胚体形成及分化能力,检测实验组和对照组细胞特性的差异。结果显示：Ji ESCs和两株pESCs均保持全能性,但某些多能性基因的表达水平有显著差异：Oct-4在KM×C3HFI pESCs中表达水平显著高于J1ESCs (p<0.05),而Sox2、H19、IGF2、KIF4、C-myc表达水平极显著高于J1ESCs (p<0.01);在KM×129/SvFIpESCS中, Sox2、Nanog的表达水平显著高于J1ESCs(p<0.05),C-myc表达水平极显著高于J1ESCs(p<0.01);另夕KM～C3HF1 pESCs形成的EBs直径显著小于J1ESCs(p<0.05), KM×129/Sv FI pESCs形成的EBs直径极显著小于J1ESCs(p<0.01)。综上所述,来源于129和C3H父系遗传背景的pESCs多能性标志基因的表达水平明显高于J1ESC,证明父系遗传背景影响pESCs多能性基因的表达。(2)检测两株pESCs以及J1ESCs增殖能力,并通过qPCR检测线粒体基因Pnpt1、 Cox2、tim23、tom40、12sRNA和CytoC的表达情况。结果显示：第2-5天KM×129/Sv FI pESCs增值速度显著低于J1ESCs (p<0.05),但在第6天细胞增殖速度显著加快(p<0.05);第1、3、6天KM×C3H FI pESCs增殖能力显著低于J1ESCs (p<0.05),在第4天和第5天差异极显著(p<0.01);tim23在KM×C3H FI pESCs中表达水平显著低于J1ESCS (p<0.05):Tom40 在KM×129/Sv FI pESCs中表达水平显著高于JiESCs(p<0.05)。 CytoC表达水平极显著低于J1 ESCs (p<0.01),12sRNA表达水平极显著高于J1 ESCs(p<0.01)。结果证明父系遗传背景影响pESCs细胞活力和线粒体基因表达。

关键词： S-腺苷高半胱氨酸水解酶   构建表达载体   毕赤酵母表达  

摘要： S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)在真核细胞中具有重要的甲基循环代谢调节作用,是存在于生物细胞内调节甲基反应的一种水解酶,此水解酶广泛存在于真核细胞如:人类、植物、真菌中。SAHH其主要的功能是催化S-腺苷高半胱氨酸(SAH)水解生成高半胱氨酸(Hcy)和腺苷(Ado)的可逆反应。研究表明人体内S-腺苷高半胱氨酸水解酶水平的高低可能影响冠心病和阿尔茨海默症即老年痴呆病的发病概率。为了更好的研究该酶,我们通过基因克隆技术将人源表达SAHH的基因整合到毕赤酵母菌基因组上,成功构建真核表达体系,再利用毕赤酵母菌表达该目的蛋白SAHH。具体的实验方案如下:首先,我们从GenBank中查找到编码人源的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因,在此目的基因前后设计酶切位点和重组标签His-tag。通过全基因合成技术合成拥有完整编码框的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因,构建pPIC9K-sahh表达载体。然后,利用同尾酶Bgl II酶切克隆载体,通过电转化使其整合到毕赤酵母菌GS115的基因组中,用遗传霉素G418筛选出高拷贝转化子,转化子通过MD和MM平板鉴定其表型为Mut S型。经菌体PCR验证后,将筛选到的阳性转化子用1%甲醇诱导,使其分泌SAHH蛋白,之后我们利用冷冻干燥器将产物浓缩,利用0.22μm的滤膜过滤杂质和晶体。最后,我们将浓缩后的液体通过Ni-NTA亲和层析对重组SAHH蛋白进行纯化。此方法具有筛选方便、蛋白产物分泌表达稳定和易于纯化等优点。人源sahh基因包含1299个碱基对,其编码432个氨基酸,因此理论上此水解酶的相对分子量约为47.5 kDa,通过SDS-PAGE得出发酵产物的条带大小约为48 kDa。由于SAH被SAHH一步水解为高半胱氨酸和腺苷,而高半胱氨酸可直接用Ellman试剂直接定量测定,在412 nm下吸光度随着产物的升高而升高,我们测得浓缩后的SAHH蛋白酶活为626.6 IU,而经过Ni-NTA亲和层析纯化后的SAHH蛋白酶活为1106.8 IU。而对照组即sahh基因没有整合到毕赤酵母菌GS115基因组上的菌体通过此方法发酵得到的产物,测其酶活性约为1.33 IU,因此对于毕赤酵母菌GS115本身的发酵产物对本实验的研究结果可以忽略不计。同时我们通过查阅文献获知有些研究通过对表达体系的表达条件进行优化后酶活可达到1600 IU相比我们所得的酶活较高,但是我相信我们在之后的对表达体系的表达条件进行优化后一定比1600 IU高。结论:此研究中我们成功构建毕赤酵母菌真核表达体系,同时使得SAHH在毕赤酵母中获得了高效分泌表达。我们的研究结果可与在病原菌中功能相似的甲基化有关的S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)的结构进行差异比较,筛选特异性抑制病原菌SAHN酶活性但不影响SAHH的天然化合物抑制剂。

关键词： ELECTRIC-FIELD   AL2O3 NANOPORE   TRANSLOCATION   FABRICATION   TRANSPORT   GRAPHENE   ION   MOLECULE   SILICON   MEMBRANE  

摘要： The solid-state nanopore-based DNA sequencing technology is becoming more and more attractive for its brand new future in gene detection field. The challenges that need to be addressed are diverse: the effective methods to detect base-specific signatures, the control of the nanopore's size and surface properties, and the modulation of translocation velocity and behavior of the DNA molecules. Among these challenges, the realization of the high-quality nanopores with the help of modern micro/nanofabrication technologies is a crucial one. In this paper, typical technologies applied in the field of solid-state nanopore-based DNA sequencing have been reviewed.

关键词： 草酸青霉   工程菌构建   木糖苷酶   酶学性质   优化   发酵生产   应用  

摘要： 木聚糖是半纤维素的主要组成成份,广泛存在于硬木和谷物的细胞壁当中,是自然界中丰富的可再生资源。植物木聚糖的异质性及其复杂的化学性质,决定了它的完全降解需要多种酶的共同参与。β-木糖苷酶是木聚糖酶系中重要的酶组分,在降解木聚糖的过程中,它不仅可以解除木二糖对木聚糖酶的抑制作用,而且能够水解木寡糖生成更多的木糖。β-木糖苷酶在生物转化、制浆造纸和医药行业等方面具有很大的应用潜力,获得高产量的β-木糖苷酶具有重要的实践意义。通过对草酸青霉野生株及其多株突变株等菌株的发酵鉴定,筛选出一株合成木糖苷酶较高的草酸青霉ΔlaeA-gpdA (p) ::xlnR。与草酸青霉野生株114-2相比,该菌株合成木糖苷酶的能力提高了4.5倍。对114-2、ΔlaeA、gpdA(p)::xlnR、 gpdA(p)::clrB、ΔlaeA-gpdA(p)::xlnR和ΔlaeA-gpdA (p)::clrB六株菌株的木糖苷酶基因转录水平的分析表明,同时敲除laeA和过表达xlnR之后,木糖苷酶基因转录水平显著上调,而对114-2菌株单独的进行敲除laeA或过表达xlnR的改造,菌株合成木糖苷酶的能力并没有明显的变化,显示LaeA和XlnR共同作用于木糖苷酶基因的表达。在草酸青霉ΔlaeA-gpdA (p) ::xlnR中成功同源过表达8个木糖苷酶基因(xyl3A、 xyl3C、xyl3D、xyl43A、xyl43C、xyl43D、abf43D和xyl31A)。其中,过表达xyl3A的其中一株转化子(BZ-1)的β-木糖苷酶和木聚糖酶酶活分别达到35.7 U/mL和408 U/mL,为出发株的28.4倍和1.9倍。abf43D、xyl3D和xyl31A基因转化子的木糖苷酶活分别为出发菌株的1.6、1.6和2.0倍,显示在草酸青霉中过表达β-木糖昔酶可以实现其β-木糖苷酶合成能力的显著提高。对纯化后的Xy13A进行酶学性质检测,结果显示Xyl3A的最适底物为lpNPX,比酶活为25.2 U/mg,其对pNPX的最适作用温度50℃,在45℃以下其温度稳定性较好;最适pH值3.5～5,pH4.5时酶活力较稳定。大部分金属离子(Cu2+、Co2+、 Ca2+、Pb2+、Ba2+、Mg2+、K+、Mn2+和Zn2+),对酶活的影响不明显;加入5 mM的Fe3+时,p-木糖苷酶相对酶活为119%,显示铁离子促进β-木糖菅酶活性;5 mM的SDS存在下,β-木糖苷酶活降低了57%,显示其对Xyl3A活性具有较强抑制作用。该酶对木糖的耐受性Ki值为5mM,以pNPX为底物时的Km值为0.36 mM。为提高BZ-1合成β-木糖苷酶的能力,对发酵碳氮源等培养条件进行了优化。得到发酵BZ-1的最优培养条件为玉米芯2.4%,微晶纤维素2.4%,麸皮2.4%,玉米浆粉2.1%,KH2PO40.5%, MgSO4·7H2O 0.05%o在此培养条件下,BZ-1合成的β-木糖苷酶、木聚糖酶和滤纸酶活分别达到67.7U/mL、556.7 U/mL和0.4U/mL。其中,β-木糖苷酶酶活力是目前已报道的丝状真菌中产酶的最高水平。以碱处理的玉米秸秆为底物,研究了基因工程菌BZ-1的β-木糖苷酶粗酶液在降解半纤维素与协同降解纤维素原料中的应用潜力。发现与出发菌株::xlnR的粗酶液和商品木聚糖酶相比,BZ-1菌株的粗酶液具有更高的水解玉米秸秆中木聚糖的能力,木聚糖转化率显著提高。利用来源于玉米芯、甘蔗渣及山毛榉的木聚糖进行酶解实验,发现BZ-1菌株的粗酶液对玉米芯来源的木聚糖的降解效果最好,显示β-木糖菅酶对木聚糖底物的降解具有特异性。

关键词： RNA   复合物   基因组   选择性剪切   转录组   基因工程  

摘要： CRISPR-Cpf1结合crRNA的复合物晶体结构哈尔滨工业大学生命科学与技术学院黄志伟研究团队揭示了CRISPR-Cpf1识别CRISPR RNA(cr RNA)以及Cpf1剪切precr RNA成熟的分子机制,相关结果发表在《自然》杂志上。CRISPR-Cas系统是细菌编码的适应性免疫系统,该系统通过RNA引导的效应蛋白剪切病毒的DNA或者RNA从而抵抗病毒的感染。该系统之一的CRISPR-Cas9系统被用来作为可编程的基因编