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关键词： 硬度   拓扑结构   胚胎干细胞   肝细胞   转染  

摘要： 胚胎干细胞(ESCs)作为多能干细胞,能在体外自我更新和分化成所有的体细胞,可作为其他细胞的种子细胞。胚胎干细胞的特殊性质使其成为非常热门的研究对象。研究显示,胚胎干细胞的生长分化无论在体内还是体外受到各种因素的影响,如细胞周围物理力学环境、可溶性因子、细胞相互作用、外源基因干扰等。已有研究围绕单一力学性质,仅硬度或者拓扑,或者仅研究定向分化,而并没有将硬度、拓扑和定向分化结合起来的研究,而在体内分化过程中微环境的力学性质并非单一存在。因此为了更好地模拟体内微环境,有必要将硬度和拓扑耦合,研究其对胚胎干细胞的生长分化调控。此外,研究揭示外源基因干扰胚胎干细胞可改变其正常生长和分化状态,可认识和了解细胞生长和分化机制,发现未知基因和已知基因新的功能,然而胚胎干细胞的基因转染效率很低,有待优化其转染载体,提高其转染效率。基于基底力学微环境和基因转染可影响胚胎干细胞的命运,本文以人胚胎干细胞(hESCs)为研究对象,探讨了硬度和拓扑耦合的微模式化基底以及基因转染载体的物理化学因素对胚胎干细胞的生长分化的影响,为了解和认识微模式化基底影响hESCs的生长和肝向分化机理、为优化设计hESCs的基因转染载体提供理论支持。研究的内容和结果如下:首先本课题选取常见的硬度可调节的聚丙烯酰胺水凝胶,通过微模式化制作技术,制备了两种硬度(分别为6.1和46.7 kPa)、四种拓扑结构(分别为柱状、沟槽、六边形、平面),硬度耦合拓扑结构的八种基底。所制备的基底经过处理后,将hESCs接种在其上,培养三天后加入不同的诱导分化因子,通过一系列的分化流程,将hESCs诱导分化为类肝细胞。对细胞形态变化、蛋白和基因水平标志物的检测和肝细胞功能的考察,发现在不同的生长分化时期,硬度和拓扑起不同的作用:在干性维持阶段,软、硬胶都有利于干性维持,软胶上的细胞比硬胶的表达更多的Nanog和Oct-4,沟槽结构不利于干性维持;确定内胚层分化阶段,硬胶上的细胞易分化,六边形和柱状对分化影响最大;在前体肝细胞分化阶段,软胶有利于类肝细胞功能维持,平面和柱状表达更多的肝细胞特异性标志物;在成熟的肝细胞阶段,软胶优于硬胶,拓扑结构对类肝细胞功能没有明显影响。硬度在分化的过程中起决定性作用,拓扑结构对分化有部分作用,研究结果提示在胚胎干细胞分化及体外肝细胞培养中,应该考虑到硬度和拓扑结构的影响,提高分化所得肝细胞的效率和成熟度。其次本文采用不同末端基团(氨基、羧基和羟基)和不同大小的五种PAMAM树枝状分子转染hESCs,考察其对hESCs转染能力、生长、干性维持和分化的影响,并动态观察hESCs胞吞胞吐FITC标记的PAMAM的过程。研究发现G5、G7、G4.5COOH和G5OH粒径在5 nm左右,G1直径最小为3.14 nm。G5、G7带正电荷,G1带微弱的负电荷,G4.5COOH和G5OH带较强的负电荷。PAMAM的末端基团对转染、生长分化影响最大,只有末端基团为氨基的PAMAM才能转染hESCs,10μM的G5转染效率最高,低浓度(0.5、1μM)的G7具有一定的转染能力。末端基团为氨基的PAMAM代数越高毒性越大;末端基团为羟基和羧基的PAMAM对hESCs的毒性低,有利于hESCs干性维持。另外,hESCs对FITC标记的G5胞吞胞吐作用明显。综上,对hESCs的转染需要综合考虑末端基团、阳离子大小、电荷等因素才能更好地转染hESCs。

关键词： Human embryonic stem cell N-glycans   N-glycan core branching   pluripotency   differentiation   SUGAR CODE   BISECTING GLCNAC   DIFFERENTIATION   GLYCOSYLATION   LECTINS   EXPRESSION   GLYCOME   BIOSYNTHESIS   SPECIFICITY   DETERMINANT  

摘要： Human embryonic stem cells (hESCs) and reprogrammed human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proliferate indefinitely in the undifferentiated state (self-renewal) and differentiate into the three germ layers (and ultimately into all cell types) (pluripotency). Branching in the N-glycan core of hESCs/hiPSCs is limited. hESCs/hiPSCs have high mannose-type and biantennary complex-type core structures, indicating immature stages of N-glycoproteins. The two branches on the core consist of type 2 N-acetyllactosamine (LacNAc), completed mainly with alpha 2,6-linked sialic acid. Complex terminal fucosylation, particularly alpha 1,2-linked fucosylation, is another characteristic N-glycosylation feature of hESCs/hiPSCs. All of these structural features are probably associated with the pluripotency of hESCs/hiPSCs. In differentiated cells, two-, three-, and four-branched N-glycan core structures are seen and N-acetylhexosamine compositions increase in the branches. The elongation and size of the branches in the N-glycan cores increase by the addition of poly-LacNAc chains and are the typical features during differentiation. As alpha 1,2-linked terminal fucosylation disappears, alpha 1,6-linked core fucosylation increases. It is necessary to know the pluripotency-associated glycans in order to identify and isolate the pluripotent cells from heterogeneous populations containing differentiated cells.

关键词： 干细胞研究   精细胞   功能性   小鼠精子   胚胎干细胞   实验室   中华人民共和国   重大突破  

摘要： 为了完成这一壮举,来自中国科学院动物研究所、中国科技大学、扬州大学、南方医科大学等机构的研究人员首先诱导小鼠胚胎干细胞产生功能性的精子样细胞(sperm-like cells),然后将这种精子样细胞注入小鼠卵细胞中产生能生育的小鼠后代。相关研究结果于2016年2月25日在线发表在Cell Stem Cell期刊上,论文标题为"Complete Meiosis from Embryonic Stem CellDerived Germ Cells In Vitro"。

关键词： 放线菌   宿主   天然产物   基因工程  

摘要： 微生物可以合成种类丰富、结构复杂的活性天然产物。然而,在许多情况下,这些次级代谢产物的产量较低,不利于产物的鉴定和新药的开发。随着功能基因组及基因工程技术的发展,微生物宿主的定向改造得以实现,通过简单的遗传操作,微生物就可以合成大量的目标产物,极大地加快了菌株改造的进程。本文主要对最重要的天然产物合成宿主——放线菌的基因工程研究展开介绍,并为放线菌的遗传操作提供全新的视角。

关键词： Notch信号通路   人胚胎干细胞   分化   肝胆管细胞  

摘要： [目的]Notch信号作为一种在进化中高度保守的反映细胞间传导机制的通路,它维持着细胞的增殖、分化和凋亡,在胚胎发育和细胞分化命运的决定中发挥重要的作用。我们的目的就是探寻Notch信号通路在肝胆管细胞分化中所起的作用。[方法]将hESC株H1‘细胞接种到Matrigel包被的培养板上,加入含有细胞因子活化素A (Activin A)的分化液诱导5d。由activin A处理得到的DE细胞分别在含20ng/mlBMP4,100ng/mlFGF1的培养体系和20ng/mlBMP4, 100ng/mlFGF1, Notch抑制剂NAPT的培养体系中处理5天。采用免疫细胞化学染色、RT-PCR反应鉴定分化细胞的性质,胆管细胞的分化以及notch信号通路中的相关受体和基因的表达情况。[结果]实验发现50-100个细胞左右的hES团块是理想的分化细胞量,这样大小的hES团块同时具有较强的增殖能力和分化能力。noggin能有效的抑制hES细胞分化为DE细胞。hES来源的DE细胞表达notch信号通路中的相关受体notch1, notch2及下游活化基因hesl, hes5。而这些notch信号分子在BMP-4和FGF-1作用3天后表达下降或消失。在向肝胆管细胞的分化体系中加入Notch信号通路的抑制剂后,发现有部分DE细胞发生凋亡或死亡,残存的细胞Notch信号胞内下游蛋白(NICD)表达明显下降,而且大部分蛋白分布在胞浆内,并未转移至核内,说明NICD未处于激活状态;相反,对照组(FGF-1、BMP-4)NICD荧光强度要明显高于实验组,且NICD主要分布在核内,表明NICD处于激活状态;与此同时,notch抑制剂作用5天后,与对照组相比,实验组肝细胞的生成率明显降低,甚至检测不到。[结论]***细胞在高浓度activin A和低浓度血清的诱导下可定向分化得到高比率的DE细胞;而用noggin可抑制hES向DE细胞分化。***细胞的分化密度与DE的形成效率密切相关。***-1和BMP-4可有效地促使DE细胞向胆管上皮细胞的分化。***信号通路决定DE细胞的胆管细胞发生。

关键词： 人胚胎干细胞   心室肌细胞   信号通路   视黄酸   获得性心脏病  

摘要： 人胚胎干细胞具有多能性，理论上能够分化为机体各种类型的细胞，在重大疾病的移植治疗中具有巨大的应用前景。心脏疾病，尤其是获得性心脏病已经成为影响人类健康的重要杀手。临床上利用干细胞来源的心肌细胞移植治疗心肌梗塞，需要解决以下四个问题:心肌分化效率、单一的心肌细胞亚型、安全且无动物源污染、成熟可用于移植。为了获得单一的、安全的心室肌细胞，本论文发现了心肌前体细胞定向分化为心室肌细胞的调控信号通路，并采用无动物源、成分确定的分化体系，利用小分子化合物诱导方法定向、高效获得心室肌细胞。　　本文发现BMP信号通路(BMP4)可以促进心室肌特异基因IRX4的表达，并抑制心房肌特异基因NR2F2的表达，并且BMP信号作用的最佳时间是分化程序的“D5-D8”。BMP信号通路的抑制剂Noggin和Dorsomorphin可以阻断BMP信号的上述作用，从而降低IRX4的表达，提高NR2F2的表达水平。在BMP家族蛋白中，本论文发现仅BMP4和BMP2具有明显的促进心室肌特异基因IRX4表达的作用。FACS检测心室肌特异轻链蛋白MLC-2v和心肌肌钙蛋白CTNT比例，发现BMP4处理组的心室肌细胞比例高达82.23％，而RA处理组仅为14.07％。免疫荧光染色和Western Blotting同样证明，相对于RA处理组，BMP4处理组细胞晚期心室肌特异MLC-2v表现高表达比例和高表达水平。此外，BMP4诱导的心肌细胞表达有CTNT、α-Actinin、MLC-2a、MLC-2Vv和MHC等结构蛋白。通过电生理和钙活动检测，BMP4处理组中具有正常动作电位和钙火花的心室肌细胞比例高达83％，而RA处理组仅为10～20％。上述结果表明，BMP4可以促进人胚胎干细胞(hESCs)分化为具有正常结构蛋白表达和电生理功能的心室肌样细胞。通过进一步研究，本论文发现BMP4是通过Smad信号通路(Smad1/5/8)调控心肌前体细胞的特化过程，而不是通过Non-Smad信号通路（例如ERK，JNK和p38MAPK信号通路等），ERK、JNK和p38 MAPK等信号通路的抑制剂均不能有效降低处理组细胞的心室肌特异基因IRX4的表达水平。在此基础上，本论文利用小分子化合物(CHIR99021、IWR-1)和成分确定、无动物源的心肌分化培养基系统(RPMI1640+S12)，利用BMP4诱导可得到高达92.86％的心室肌样细胞，并且具有功能性的钾、钙、钠等离子通道。此外，本论文还利用RA和BMP信号处理组细胞初步研究其下游可能调控心脏发育的相关细胞因子和转录因子的表达模式，以及对第一心区和第二心区早期重要调控基因表达的影响，为后续研究提供一定参考信息。　　综上所述，本论文发现BMP信号通路(BMP4)可通过Smad信号通路调控心肌前体细胞特化为表达正常结构蛋白和功能性的心室肌样细胞，并利用成分确定的分化系统获得了安全、无动物源的高比例人胚胎干细胞源的心室肌细胞。

关键词： CARCINOMA-CELLS   EPIGENETIC REGULATION   PROMININ FAMILY   TGF-BETA   CANCER   GROWTH   DIVISION   STATINS   AC133   IDENTIFICATION  

摘要： The lipophilic statin lovastatin decreases cholesterol synthesis and is a safe and effective treatment for the prevention of cardiovascular diseases. Growing evidence points at antitumor potential of lovastatin. Therefore, understanding the molecular mechanism of lovastatin function in different cell types is critical to effective therapy design. In this study, we investigated the effects of lovastatin on the differentiation potential of human embryonic stem (hES) cells (H9 cell line). Multiparameter flow cytometric assay was used to detect changes in the expression of transcription factors characteristic of hES cells. We found that lovastatin treatment delayed NANOG downregulation during ectodermal and endodermal differentiation. Likewise, expression of ectodermal (SOX1 and OTX2) and endodermal (GATA4 and FOXA2) markers was higher in treated cells. Exposure of hES cells to lovastatin led to a minor decrease in the expression of SSEA-3 and a significant reduction in CD133 expression. Treated cells also formed fewer embryoid bodies than control cells. By analyzing hES with and without CD133, we discovered that CD133 expression is required for proper formation of embryoid bodies. In conclusion, lovastatin reduced the heterogeneity of hES cells and impaired their differentiation potential.

关键词： 反式-4-羟脯氨酸   起始效率   延伸效率   发酵条件   比酶活  

摘要： 反式-4-羟脯氨酸为手性亚氨基酸,是一种被广泛应用于医疗美容,化工,畜牧领域的生产原料。本文构建了一株能够高效表达反式-4-脯氨酸羟化酶基因的重组大肠杆菌,并对得到的重组菌株DH5α/pUC-19-pH进行了摇瓶发酵工艺优化,主要结果如下：1,优化反式-4-脯氨酸羟化酶编码区序列：使用JCAT软件优化了反式-4-脯氨酸羟化酶的编码区基因序列,改变了141个碱基(替换了138个同义密码子),使其CAI指数由0.3965优化至0.9277,C/G比由73.6263%优化至59.7069%,优化后的mRNA翻译延伸效率显著提高。2,优化反式-4-脯氨酸羟化酶非编码区序列：在RBS区前端添加一段来源于T7噬菌体的g10-L翻译增强子序列,以提高外源基因的表达量;设计RBS区,使其内部包含一段以AAGGA为核心的强SD序列,使得mRNA能够高效的与原核生物核糖体结合,同时,将T7 g10-L序列置于SD序列上游能有力地提高下游基因编码蛋白的表达水平;使用RNAstructure软件优化TIR区的二级结构,使其自由能∧G由-12.8升高到了-7.6,从而优化mRNA的翻译起始效率。3,选择色氨酸启动子并进行简化,在构建的反式-4-脯氨酸羟化酶基因末端添加来源于PET载体的TrpLABCDE转录终止序列,以保护序列的稳定性。为了方便后续实验,在表达盒的5’端加入限制性内切酶Sal Ⅰ位点,在3’端加入Nde Ⅰ酶切位点;使用T载体质粒pUC-19成功构建重组菌DH5α/pUC-19-pH,并对比大肠杆菌JM109,C43,BL21以及XL-1优化宿主菌,对比pCDFDuet-1, pACYCDuet-1, pETDuet-1, pRSFDuet-1, pCOLAduet-1优化质粒载体,最终得到比酶活最高的菌株为DH5a/pUC-19-pH,达到0.0108 U/mg。4,测定DH5α/pUC-19-pH的生长曲线及发酵曲线,进行摇瓶发酵的单因素条件优化,最佳结论值如下：温度37℃,L-脯氨酸浓度200 mM,亚铁离子浓度2 mM,镁离子浓度0.02%,胰蛋白胨8 g/L,碳氮比为1,得到的培养基配方如下：葡萄糖20g/L,胰蛋白胨8 g/L,L-脯氨酸200 mM,硫酸亚铁2 mM,硫酸镁0.2g/L,硫酸铵10 g/L,磷酸氢二钾1g/L,氯化钠2 g/L,柠檬酸2 g/L,氯化钙0.015g/L。优化后反式-4-脯氨酸羟化酶的比酶活在发酵16 h时达到了0.301 U/mg,较最近的报道提高了45.4%。

关键词： 胚胎干细胞   诱导分化   角膜缘干细胞   角膜缘干细胞缺乏   免疫原性  

摘要： 目的:诱导人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,h ESCs)向角膜上皮样细胞分化,观察分化细胞的生物学特性及其治疗角膜缘干细胞缺乏的效果,并探讨分化细胞的免疫原性及其移植后的免疫排斥反应。方法:通过小分子化合物诱导h ESCs向角膜上皮细胞分化,免疫荧光染色、PCR检测其上皮细胞标志物的表达,同时培养成体角膜缘上皮细胞(Limbal Epithelial Cells,LECs),以羊膜为载体制备重组角膜上皮细胞膜片。建立新西兰兔和食蟹猴的角膜缘干细胞缺乏模型,行重组角膜上皮细胞膜片移植,术后通过裂隙灯和印迹细胞学观察其治疗效果。通过全基因组芯片筛选h ESCs分化细胞和LECs差异表达的基因,流式细胞检测二者免疫相关分子的表达,体外T细胞增殖实验和NK细胞杀伤实验验证其免疫原性,同时在体外模拟炎症微环境观察对细胞免疫原性的影响,重组角膜上皮细胞膜片移植后观察免疫排斥反应,并用免疫荧光染色观察免疫细胞。结果:h ESCs分化细胞的细胞形态与角膜缘干细胞相似,并表达角膜缘干细胞和角膜上皮细胞的标记物,其多能性标志物为阴性,并能在去上皮羊膜上形成复层的细胞结构,重组角膜上皮细胞膜片移植到角膜缘干细胞缺乏的新西兰兔和食蟹猴体内后,能够显著改善眼表情况并长时间保持稳定。相比于LECs,h ESCs分化细胞中免疫相关基因的表达显著下调,其MHC分子低表达,在体外不易引起T细胞增殖也不易被NK细胞杀伤,并且这些特性不受炎症微环境的影响,h ESCs分化细胞移植到体内后未见明显的免疫排斥反应,且移植后免疫细胞的浸润也较少。结论:通过小分子化合物诱导的方法可以成功将胚胎干细胞分化为具有一定增殖能力的角膜上皮样细胞,该细胞体内移植后能够有效治疗角膜缘干细胞缺乏,并且其免疫原性较小,不易引起免疫排斥反应。

关键词： 转基因作物   大豆   转化   草甘膦抗性  

摘要： 大豆[Glycine max (L.)]是重要的粮油、饲料和经济作物,杂草防治是大豆栽培管理中的重要工作,种植抗除草剂转基因大豆可以大幅度提高杂草防治效率,降低杂草防治成本。本研究以本实验室获得的草甘膦抗性基因glOevo构建植物转化载体pCAMBIA1300-35S-g10evo,利用农杆菌介导法侵染大豆子叶节,通过诱导、筛选获得抗草甘膦转基因大豆。本研究对获得的转基因大豆进行草甘膦抗性水平筛选,获得具有良好抗性的转化株系G10evo。利用Western blot法检测G10evo草甘膦抗性基因glOevo的表达,检测到大小约为46kDa的表达蛋白;利用酶联免疫法定量分析转基因大豆G10evo V4期抗草甘膦基因的表达量,结果显示第二片复叶的EPSPS(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶)含量为276.73μg/g,占总可溶性蛋白的0.76%。Southern blot分析结果显示,G10evo含有的外源抗草甘膦基因为单拷贝插入。遗传稳定性分析表明,g10evo基因在G10evo各代中能够稳定遗传。在温室中进行草甘膦抗性测定,施用4倍正常田间浓度的草甘膦对G10evo没有明显的药害。G10evo能高抗草甘膦,具有产业化应用前景。