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关键词： 转基因认知   转基因作物   风险评价  

摘要： 本研究针对广州大学生的转基因知识认知和转基因作物生态环境及食用安全风险问题,采用问卷调查方法,通过研究假设与经济计量模型、层次分析和模糊综合评价模型的建立,用统计软件SPSS19.0进行数据整理,对调查结果分别描述性表述、计量模型分析以及科学量化综合评价,从而得出结论,为有关部门提供相关建议。本文研究主要结论如下:大学生主观上对转基因的认知程度高,专业和常识认知程度低,对生活中转基因产品的关注度一般;互联网成为大学生关注转基因信息的主要途径,而最为关注的转基因内容是产品的食用安全;大学生尝试购买转基因产品态度是相对保守,但绝大多数大学生对国家发展转基因技术及其产业持积极态度。大学生受广告宣传和网络报道转基因信息的影响程度高。理学类(生物专业)相对于其他专业学生对转基因知识认知程度高。大学生中男生比女生、理学类(生物专业)相对于其他专业更易于交流探讨转基因话题。大学生的转基因认知程度越高,他们对其关注度也越高。受转基因信息的广告影响程度越大的大学生,对产品转基因问题关注度越高。对转基因产品的态度和国家对其发展的态度与专业、媒体影响、转基因法律法规认知度相关。大学生客观上转基因认知程度越高,他们接受转基因产品的意愿越高,但主观上对转基因认知的自我评价越高,他们尝试转基因产品意愿越低。媒体对转基因信息传播的影响因素有性别、转基因专业知识和法律法规认知度。另外,通过层次分析法和模糊综合评价法,对转基因作物的生态环境风险和食用安全风险进行科学量化分析,得出食用安全风险是最重要的风险因素,转基因作物的风险等级处于中等略高水平,其中转基因作物对非目标生物影响是比较重要的生态环境风险因素,转基因作物产生有毒物质是比较重要的食用安全风险因素。

关键词： 海参溶菌酶   毕赤酵母   条件优化   纯化   发酵罐  

摘要： 溶菌酶广泛分布于不同生物体中,它通过破坏细菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4糖苷键,从而使其原有结构受到破坏造成菌体死亡。溶菌酶作为一种天然的蛋白质具有对人体无毒性,易吸收,不污染等特性。海参溶菌酶基因由本实验室于2007年首次分离和鉴定,进一步研究发现,该溶菌酶具有广谱抗菌活性。本课题首先将实验室之前已构建的毕赤酵母基因工程菌pPIC9K-SjLys/GS115作为产海参溶菌酶出发菌株,分别从甲醇浓度、培养基pH、温度和诱导时间对其产酶发酵条件进行优化研究。通过实验得出其最优条件为甲醇诱导浓度1.0%,发酵培养基初始pH 6.0,温度30℃,培养96 h。在这个最佳目的蛋白表达条件下,其发酵液中海参溶菌酶表达含量为4.88 mg/L。将发酵液经离心和超滤浓缩后得到上清液,再经离子交换和凝胶过滤层析纯化获得海参溶菌酶产品,其酶活力为826.44 U/mg。尽管经过上述发酵条件优化后海参溶菌酶产量有所增加,然而在纯化过程中酶蛋白损失较大,造成其产率较低。为了减少纯化步骤,增加酶的回收率,本课题以海参溶菌酶(SjLys)基因序列为模板,分别在其N端和C端添加组氨酸标签(6×His tag),构建表达载体pPIC9K-SjLys-HisN和pPIC9K-SjLys-HisC。通过电转化法将线性化的带有目的基因的大片段整合到毕赤酵母GS115细胞染色体上,得到重组毕赤酵母细胞转化子。再利用浓度为1.0 mg/mL.0 mg/mL G418抗生素筛选获得32株高拷贝转化子。经菌落PCR验证和小规模培养分析,最后得到一株表达海参溶菌酶效率较高的重组毕赤酵母基因工程菌pPIC9K-SjLys-HisN/GS115,命名为HS3-1。进一步考察该工程菌株摇瓶发酵培养结果,通过SDS-PAGE和Western blotting分析表明,该工程菌株发酵产物为海参溶菌酶,其产量为5.12 mg/L。使用Ni亲和层析方法对目的蛋白进行纯化,其酶活力达1088.57 U/mg。本课题最后进行了发酵罐放大发酵生产试验。以上述重组毕赤酵母基因工程菌HS3-1作为发酵菌株,使用5 L发酵罐进行发酵生产。以BSM培养基作为发酵初始培养基,发酵过程参数控制为温度30℃,pH 6.0,搅拌转速800 r/min,溶解氧DO 30%;发酵液培养24 h待基础甘油耗尽后,补料流加甘油5 h,至菌体湿重达180 g/L20 g/L,再将发酵液酵母细胞饥饿1 h,最后向培养基中自动流加甲醇进行产物诱导,实时监控发酵液中甲醇浓度控制在1%,其诱导时间为96 h。分析结果表明,该海参溶菌酶占发酵液中总蛋白比例为58%,其产量为53.26 mg/L。通过测定经Ni亲和层析纯化后酶液中蛋白含量和溶菌酶活性,计算出该海参溶菌酶比活力为2238 U/mg。这个结果比摇瓶发酵的产酶能力和酶活性有很大的提高。进一步测定该溶菌酶的抑菌作用,结果表明,纯化后的海参溶菌酶对金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌、副溶血性弧菌和铜绿假单胞菌都具有抑菌活性。通过本课题的研究,初步完成了利用毕赤酵母基因工程菌发酵生产海参溶菌酶的小试研究,为后续的大规模的发酵及表达产物的分离纯化提供了理论基础及工艺参数,为海参溶菌酶的应用奠定了基础。

关键词： NADPH OXIDASE INHIBITOR   WNT-BETA-CATENIN   SELF-RENEWAL   CARDIOMYOCYTE DIFFERENTIATION   INTRACELLULAR SUPEROXIDE   ENDOTHELIAL-CELLS   REDOX-REGULATION   FEEDBACK LOOP   FREE-RADICALS   NITRIC-OXIDE  

摘要： Reactive oxygen species (ROS) are important regulators of cellular functions. In embryonic stem cells, ROS are suggested to influence differentiation status. Regulated ROS formation is catalyzed primarily by NADPH-dependent oxidases (NOXs). Apocynin and diphenyleneiodonium are frequently used inhibitors of NOXs; however, both exhibit uncharacterized effects not related to NOXs inhibition. Interestingly, in our model of mouse embryonic stem cells we demonstrate low expression of NOXs. Therefore we aimed to clarify potential side effects of these drugs. Both apocynin and diphenyleneiodonium impaired proliferation of cells. Surprisingly, we observed prooxidant activity of these drugs determined by hydroethidine. Further, we revealed that apocynin inhibits PI3K/Akt pathway with its downstream transcriptional factor Nanog. Opposite to this, apocynin augmented activity of canonical Wnt signaling. On the contrary, diphenyleneiodonium activated both PI3K/Akt and Erk signaling pathways without affecting Wnt. Our data indicates limits and possible unexpected interactions of NOXs inhibitors with intracellular signaling pathways.

关键词： Bone marrow stromal cells   Chimeric mouse model   Genetically engineered stroma   Human hematopoietic stem and progenitor cells   Implantable microenvironments   Scaffolds  

摘要： Background: Immunodeficient mouse models that accept human cell and tissue grafts can contribute greater knowledge to human stem cell research. In this technical report, we used biomaterial implants seeded with genetically engineered stromal cells to create several unique microenvironments in a single mouse. The scope of study was focused on human CD34 hematopoietic stem/progenitor cell (HSPC) engraftment and differentiation within the engineered microenvironment. Results: A mouse model system was created using subdermal implant sites that overexpressed a specific human cytokines (Vascular Endothelial Growth Factor A (hVEGFa), Stromal Derived Factor 1 Alpha (hSDF1a), or Tumor Necrosis Factor Alpha (hTNFa)) by stromal cells in a three-dimensional biomaterial matrix. The systemic exposure of locally overexpressed cytokines was minimized by controlling the growth of stromal cells, which led to autonomous local, concentrated sites in a single mouse for study. This biomaterial implant approach allowed for the local analysis of each cytokine on hematopoietic stem cell recruitment, engraftment and differentiation in four different tissue microenvironments in the same host. The engineered factors were validated to have bioactive effects on human CD34+ hematopoietic progenitor cell differentiation. Conclusions: This model system can serve as a new platform for the study of multiple human proteins and their local effects on hematopoietic cell biology for in vivo validation studies. © 2016 Lee et al.

关键词： 转基因技术   基因工程   外刊   产业化进程   《华尔街日报》  

摘要： 中国推转基因作物产业化美国《华尔街日报》4月14日今年,中央一号文件——一份中国农业政策文件提到了转基因技术,表示要加强农业转基因技术研发和监管,在确保安全的基础上慎重推广。相关部委负责人也表示,"十三五"期间,将推进新型转基因抗虫棉等产品的产业化进程。

关键词： 基因工程菌   L-精氨酸   培养基优化   发酵工艺  

摘要： 本文以谷氨酸棒状杆菌基因工程菌ATCC14067-T18-argB为主要研究对象,确定了发酵液中游离精氨酸的检测方法;研究了大豆蛋白胨、葡萄糖、尿素、碳酸钙和装液量等因素对精氨酸产量的影响,采用Box-Bohnken进行培养基的优化;并在发酵罐水平对葡萄糖的添加方式、初糖浓度、接种量等发酵工艺进行探索。1.采用高效液相色谱法检测发酵液中游离精氨酸的含量,确定了衍生试剂并对色谱柱、洗脱梯度等进行优化。以2,4-二硝基氟苯作为衍生试剂,Hypersil BDS C18作为检测用色谱柱,验证优化后的程序,其波形完整,不拖尾,不黏连;其线性方程回归系数为0.9947,线性关系良好;稳定性好;重复性强。2.考察发酵培养基各因素含量对积累精氨酸的影响,在单因素水平基础上,确定了三个重要影响因子,采用Box-Bohnken的方法对这三个影响因子进行响应面优化,以大豆蛋白胨、尿素和葡萄糖作为自变量,精氨酸产量为响应值,确定了发酵培养基的成分较优组分为大豆蛋白胨9.0 g/L,葡萄糖80.0 g/L,尿素8.0 g/L。使用优化后的发酵培养基,摇瓶发酵72小时,出发菌株14067-T18-argB平均积累精氨酸达10.77 g/L,比优化前提高了195.07%。使用其他基因工程菌对优化结果进行验证,基因工程菌14067-T18-argB-E-lysE平均积累精氨酸达6.72 g/L,较优化前提高了193.49%;基因工程菌14067-T18-argJBD-lysE,平均积累精氨酸达7.63 g/L,较较优化前提高了46.92%;基因工程菌14067-T18-14-21,平均积累精氨酸达9.08 g/L,较优化前提高了154.53%。3.在发酵培养基优化的基础上,在3L发酵罐水平对基因工程菌ATCC14067-T18-argB发酵工艺进行初步优化,分析发酵过程中的残糖、细菌浓度以及发酵液中精氨酸的含量。最终选择分段补加葡萄糖,最佳初始葡萄糖浓度为20 g/L,最佳接种量为1.67%,精氨酸产量较发酵罐水平优化前提高了21.82%。

关键词： 抗虫棉   中棉所   棉田   转基因技术   基因工程  

摘要： 人物名片李付广,1966年出生,汉族,河南省延津县人。中共党员,博士、研究员、博士生导师。现任中国农业科学院棉花研究所所长、党委书记,中原学者,全国农业科研杰出人才。国家棉花产业技术体系岗位科学家,遗传改良研究室主任,棉花生物学国家重点实验室副主任。兼任中国农学会理事、中国棉花学会副理事长、中国农业生物技术学会理事、第四届中国青年科技工作者协会理事。李付广主要围绕生产上对棉花新

关键词： 转基因作物   农业大国   陈晓亚  

摘要： 转基因作物已经在全球诸多国家普遍种植,而我国也是部分转基因作物的主要进口国。世界上其他国家对转基因作物的看法如何,我国转基因研究又有哪些问题?对此我们采访了植物次生代谢、植物抗虫和棉花生物学方面的专家陈晓亚院士。科学世界:有人认为,"转基因食品是美国的阴谋",您怎么看?陈晓亚:关于转基因的争论要从科学技术、国家发展和人民健康的角度去看,不要往别的事情上生拉硬扯。认为"转基因种子就是美国大公司为了推翻我们国家而发明出来的",这

关键词： 葡萄酒   高级醇   葡萄酒酵母   基因工程   糖代谢合成途径   氨基酸分解代谢途径  

摘要： 高级醇是葡萄酒中重要的风味物质,但含量过高会影响葡萄酒的风味和人体健康。本实验筛选出一株生长、发酵性能优良且高级醇生成量较低的出发菌株WY-1,将高级醇的氨基酸分解代谢途径(Ehrlich途径)和糖代谢合成途径(Harris途径)相关基因ILV2(编码α-乙酰乳酸合酶催化亚基)、ILV3(编码二羟酸脱水酶)、ILV5(编码乙酰羟酸还原异构酶)、ILV6(编码α-乙酰乳酸合酶调节亚基)、BAT2(编码细胞质支链氨基酸转移酶)和BAT1(编码线粒体支链氨基酸转移酶)进行敲除或者过表达,研究了改造这些基因对高级醇生成量的影响。(1)分析了 8 株葡萄酒酵母 WY-1,WY-2,WY-3,WY-4,WY-5,WY-6,VL1和QA23的高级醇生成量,并利用杜氏管发酵比较各菌株的耐受性,通过葡萄酒发酵比较各菌株的生长、发酵性能。结果表明WY-1高级醇生成量较低,为206.31 mg/L;且分别在乙醇体积分数16%、pH为2.65、葡萄糖浓度为400 g/L以及S02浓度为400 mg/L时都有很好的耐受性;生长速率较快、发酵性能较好,酒精度高于其他菌株,为11.01%(V/V)。筛选出了一株生长、发酵性能优良且高级醇生成量较低的出发菌株 WY-1。(2)针对Harris途径,分别对ILV2、ILV3和ILV5基因进行敲除,对ILV6基因进行过表达,获得了一系列重组菌株WY-V21、WY-V22、WY-V23、WY-V31、WY-V32、WY-V51、WY-V52、WY-V53和WY-V6。进行葡萄酒发酵,各重组菌株的生长、发酵性能均与出发菌株相差不大。发酵结果表明:与出发菌株WY-1相比,敲除ILV2三个等位基因的重组菌株WY-V23的正丙醇生成量提高了 38.46%,异丁醇生成量降低了 31.42%,异戊醇生成量降低了10.24%;敲除ILV3两个等位基因的重组菌株WY-V32的正丙醇生成量提高了 15.87%,异丁醇生成量降低了 22.76%;敲除ILV5三个等位基因的重组菌株WY-V53异丁醇生成量降低了 21.10%;游离过表达ILV6基因的重组菌株WY-V6的高级醇生成量没有差异。(3)针对Ehrlich途径,分别对BAT2和BAT1基因进行了敲除,获得了一系列重组菌株 WY-T21、WY-T22、WY-T11、WY-T12 和 WY-T22T11。进行葡萄酒发酵,敲除BAT1两个等位基因的重组菌株WY-T12的生长、发酵性能明显低于出发菌株,其他重组菌株与出发菌株相差不大。发酵结果表明:与出发菌株WY-1相比,敲除BAT2两个等位基因的重组菌株WY-T22的异丁醇生成量降低了 41.02%,活性戊醇生成量降低了 25.54%;重组菌株WY-T12正丙醇生成量提高了 37.57%,异丁醇生成量提高了 26.24倍,异戊醇生成量提高了 3.42倍,活性戊醇生成量提高了 2.61倍;敲除BAT2两个等位基因同时敲除BAT1 一个等位基因的重组菌株WY-T22T11正丙醇生成量降低了 19.52%,异丁醇生成量降低了 35.51%,活性戊醇生成量降低了 30.54%。

关键词： 尿酸酶   大肠埃希菌   分泌   持续表达  

摘要： 尿酸是嘌呤分解代谢产物,部分动物将尿酸通过尿酸酶(Uricase,EC1.***.3.3)的作用转化为水溶性更好的尿囊素排出体外,由于人类在进化过程中尿酸酶基因发生突变,因此,只能以尿酸的形式排出。尿酸排出体外有两种途径,一为通过肾脏排泄(约占排泄量的2/3),但是由于尿酸本身的水溶性有限,增加肾脏尿酸排泄通常易引起肾脏尿酸结石,更加重了对肾功能的损害;一是通过肠道排泄,肠道在排出尿酸中的作用正常情况下虽居于次要地位(约占排泄量的1/3),但是可降低通过肾脏排泄的副作用,主要通过采用蒙脱石吸附、活性炭吸附、肠道透析、进食含高膳食纤维的食物等措施降低肠道尿酸水平,它们或具有降低肠腔尿酸浓度或具有阻止尿酸从肠道吸收入血,增加尿酸从粪便的排出进而具有降血尿酸的效果,但是这几个方法有局限性,不适合长期治疗应用。本实验拟构建尿酸酶基因工程菌,使尿酸酶持续表达并分泌到胞外,促使肠道尿酸转化为尿囊素,不仅可阻止肠道尿酸吸收入血,也可加速血尿酸向肠道的扩散,进而达到降低血尿酸的作用,为探索高尿酸血症新的治疗手段提供依据。1.构建重组原核表达载体pET-28a-sUOX以产朊假丝酵母菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心,CGMCC2.120)基因组DNA为模板,PCR扩增尿酸酶编码基因,同时,以金黄色葡萄球菌(ATCC6538)基因组DNA为模板,PCR扩增金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein a,SPA)信号肽编码基因。重新改造原核表达载体pET-28a,利用PCR技术删除Lac O和LacI序列,便于不需诱导剂的作用表达尿酸酶,同时便于转化至DH5α中。将尿酸酶编码基因和SPA信号肽编码基因通过DNA连接实验连接后克隆至pET-28a载体中,命名为pET-28a-sUOX,进行测序。测序结果与GenBank查询结果一致。2.尿酸酶的表达将测序正确的重组表达载体pET-28a-sUOX转化到DH5α中,不需诱导剂的作用进行目的蛋白表达。分别收集6h、9h、12h、15h、18h菌体离心收集上清液,经硫酸铵沉淀,透析后经镍层析柱分离纯化得到蛋白产朊假丝酵母菌尿酸酶。随后测定其生物学活性同时用Bradford检测法测定蛋白质含量。其活性为2.99U/mg.