关键词:
瘢痕组织
脱细胞基质
真皮支架
生物力学
修复
摘要:
研究背景临床上大面积瘢痕患者存在正常皮肤面积严重不足,无法通过有限面积的正常皮肤或皮瓣移植修复瘢痕切除后创面等问题。刃厚皮片具有可反复切取供皮的优势,但是如果仅用刃厚皮片覆盖创面,移植区内会因支撑力不足产生二次挛缩,且该挛缩往往比原瘢痕更严重,影响受区功能。真皮支架材料为宿主细胞提供了生长附着的微环境,指导细胞发挥功能和传导细胞间信号,抑制胶原蛋白的过度合成,减少创面瘢痕形成及色素沉着,改善创面修复后的柔韧性及粘弹性,是加快组织再生和修复的关键因素。然而,市售的真皮支架材料的缺点包括费用昂贵、免疫原性强、来源有限、材料降解过快、营养渗透性差、血管化速度慢、提取步骤繁琐、机械性能差、降解产物有细胞毒性、存在传播疾病风险、异源性病毒感染、等等,限制了其在临床上的广泛应用。大面积瘢痕患者通常会经历多次瘢痕切除术,如果能够把切除的瘢痕组织制备成脱细胞基质,将其作为一种支架材料进行瘢痕切除后的创面修复,就可能克服目前临床上应用的真皮支架材料的部分缺点,如市售脱细胞真皮基质(Acellular Dermal Matrix,以下简称ADM)带来的免疫原性,而且能更好地利用患者的自身组织,这符合废弃组织再利用的原则。瘢痕脱细胞基质(Scar Acellular Matrix,以下简称sAM)可有效扩大真皮支架材料的来源,降低商品化真皮支架成本,也可提取细胞外基质用于制备生物合成支架材料,促进皮肤组织工程学的发展。研究目的1.制备无完整细胞结构的sAM及ADM,比较成熟期sAM、增生期sAM及正常皮肤ADM的组织结构、生物相容性和生物力学特征,为创面修复的动物实验提供物质基础。2.探讨利用人sAM进行动物创面的修复作用及疗效评价,并研究创面愈合过程中相关基因的表达情况。研究方法和结果1.瘢痕脱细胞基质的制备及生物学检测方法:分别从临床上随机切取人成熟期瘢痕、增生期瘢痕和正常皮肤。利用手术刀或滚轴式手工取皮刀将所取瘢痕和正常皮肤去表皮及皮下组织后切取成大小适中,厚薄适宜的标本,利用胰蛋白酶+Triton X-100法将这些标本进行脱细胞及灭菌处理,制备成成熟期及增生期瘢痕组织的sAM及正常皮肤组织的ADM。对所取得的三组脱细胞基质材料进行:1、HE染色及扫描电子显微镜进行组织结构分析;2、DAPI、Picogreen进行材料免疫原性分析;3、将表皮干细胞和正常皮肤成纤维细胞种植于各材料中并进行培养,通过HE染色及扫描电子显微镜观察各组材料中细胞生长的能力及特点;4、利用万能拉力试验机分析各组试件的应力应变伸长比、杨氏模量、松弛量、松弛斜率、蠕变量、蠕变斜率及最大拉伸应力,并根据得出数值绘制拟合应力应变、归一化松弛及蠕变曲线。结果:1)HE染色可见三种材料中无完整细胞核存在。正常皮肤ADM组织纤维细,排列有序;增生期sAM组织纤维粗大,排列紊乱;成熟期sAM组织纤维粗细不等,排列较正常皮肤紊乱,但较增生期sAM有序,中间可见少许类似正常皮肤纤维的成分。2)DAPI显示三种材料均未见完整细胞核,Picogreen法检测三种材料内残留DNA含量均低于50ng/mg,表明胰蛋白酶+Triton X-100法制备的脱细胞材料免疫原性低,符合生物学材料标准。3)在三种材料中种植细胞后,表皮干细胞在正常皮肤ADM和成熟期sAM表面及内部聚集生长。在增生期瘢痕sAM中,表皮干细胞仅在材料表面生长。皮肤成纤维细胞在成熟期sAM及增生期sAM中生长较差,可能与培养环境相关。4)三种试件的杨氏模量、蠕变斜率未见统计学差异;增生期sAM的应力-应变伸长比、松弛量、蠕变量及最大拉伸应力小于正常皮肤ADM,松弛斜率大于正常皮肤ADM,差异有统计学意义;增生期sAM的松弛量小于成熟期sAM,差异有统计学意义;成熟期sAM中,应力-应变伸长比较正常皮肤ADM小,差异有统计学意义,其余数值未见统计学差异。2.人瘢痕脱细胞基质动物创面修复及相关基因表达的研究方法:采用约克夏猪作为体内实验动物。实验分组分为成熟期sAM组,增生期sAM组和空白对照组。随机选择制备好的成熟期sAM及增生期sAM按实验分组埋植于制备好的猪背部创面,创面面积约2cm×2cm,并于材料表面覆盖刃厚皮片后打包堆加压妥善固定,分别于术后1、2、3、6个月取材,取材时将移植物连同表皮及少许皮下组织一同切取,然后进行:1、HE染色、Masson染色观察胶原纤维排列结构及细胞浸润情况;2、免疫组化染色观察各取材时间点中新生COLA1、elastin和Fibronectin 的密度;3、实时荧光定量 PCR(qPCR)观察 TGF-β、COLA1、Vimentin、MMP-1、MMP-2、MMP-9及TIMP1的表达;4、α-SMA评价各取材时间点中移植物的血管计数,观察sAM在动物体内的修复效果。结果:1)两种sAM在