关键词:
拟南芥
水通道蛋白质
H2O2
蛋白结构
质膜定位
摘要:
水通道蛋白质(Aquaporin)是一类位于生物膜上的孔道蛋白,存在于所有物种中。质膜内在蛋白(Plasma membrane intrinsic proteins,PIPs)是植物中定位于细胞质膜的水通道蛋白质,主要负责调控H2O、H2O2和CO2等不带电化合物进出细胞。尽管PIPs的生理功能已经得到了广泛而深远的研究,但是其在植物免疫过程中的影响近年来才逐渐受到关注。在植物免疫反应中,PIPs参与调节气孔的关闭,形成对叶部病害的物理屏障;本实验室的研究证实PIPs也可以作为免疫受体,调节病原菌对寄主的侵染;此外,PIPs的底物分子H2O2的爆发是植物成功识别病原物或病原物相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)的标志,通过介导 H2O2 从质外体运输到细胞内,PIPs还调控一系列免疫应答反应。基于PIPs在植物免疫中的广泛参与度,本研究针对拟南芥PIPs作了三方面的研究工作。一、AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7在植物抗病反应中协同介导质外体H2O2进入细胞;二、AtPIP2;4的三维结构及其传导H2O2时的结构分析;三、拟南芥PIPs中的transmembrane helix 2(TM2)和TM3对AtPIP1家族和AtPIP2家族亚细胞定位的决定作用。首先,AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7在植物抗病反应中协同介导质外体H2O2进入细胞。拟南芥有13个定位于质膜的水通道蛋白质,它们被分成两个家族,分别是AtPIP1和AtPIP2,AtPIP1家族的成员包括AtPIP1;1-AtPIP1;5;AtPIP2家族的成员包括AtPIP2;1-AtPIP2;8。将这13个水通道蛋白质转入酵母中,结果发现表达了AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7的酵母细胞对H2O2的敏感度显著提高,由于H2O2是植物基础免疫应答反应中重要的信号分子,因此推测AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7参与拟南芥的基础免疫反应。使用细菌性病害Pseudomonas syringae *** DC3000(PstDC3000)处理拟南芥叶片,结果诱导了AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7这三个基因的上调表达,暗示AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7在Pst DC3000侵染拟南芥的过程中发挥着一定的作用。通过对拟南芥实施的转基因操作,本研究获得了AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7的突变、互补和过表达拟南芥植株。使用Pst DC3000处理获得的植株,结果发现AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7这三个基因的过量表达显著地提高了拟南芥植株对Pst DC3000的抗性,而对这三个基因的突变则显著地降低了拟南芥对Pst DC3000的抗性。此外,与野生型植株相比,缺失突变和过表达分别导致了拟南芥胼胝质沉积的减少和增多。以上结果说明AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7分别参与了拟南芥的基础免疫应答。为了进一步探讨AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7在植物免疫中的协同作用,本研究通过病毒介导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术,将AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7三个基因进行组合沉默。使用Pst DC3000侵染沉默后的植株,结果发现AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7的任何沉默组合都显著降低了拟南芥对Pst DC3000的抗性。而且,同时沉默AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7三个基因的植株比只沉默其中两个基因的植株更易受到Pst DC3000的侵染。那么,AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7又是如何参与拟南芥的免疫反应的呢?为了回答这个问题,本研究利用H2O2的荧光染料在酵母细胞中证实了H2O2是AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7的跨膜运输底物。进一步的植物实验证实,面对细菌侵染,拟南芥利用AtPIP2;4、AtPIP2;5和AtPIP2;7将瞬时产生的胞外H2O2转运至胞内,从而有效地调节下游的免疫反应。本研究还通过AtPIP2;4的结构学研究探讨了水通道蛋白质底物转运效率的机制。已经证实AtPIP2;4介导胞外H2O2向胞内运输,从而充当植物免疫反应的分子开关。实际上除了转运H2O2,AtPIP2;4还可以高效地转运H2O。为了证实这一点,本研究利用发酵罐大规模地表达了 AtPIP2;4,随后分离、纯化,获得了高纯度的蛋白质。将蛋白质组装到脂质体上,利用停流仪测定了 AtPIP2;4的渗透效率(P