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关键词： 毛囊干细胞   表皮干细胞   组织工程皮肤   β1整合素   角蛋白19  

摘要： 目的： 1、建立高效、快速的兔FSCs (Follicle stem cells, FSCs)和ESCs (Epidermal stem cells, ESCs)分离、培养技术,进行原代与传代细胞的培养。2、观察体外培养的兔FSCs和ESCs生物学特征、细胞周期,并比较两种细胞的差异。3、体外分离、培养人FSCs和ESCs,进行形态学观察。4、比较人FSCs和ESCs生物学特征。探讨更合适组织工程皮肤的种子细胞,为体外构建含有附属器官的人工皮肤和实现大面积皮肤损伤从结构修复到功能重建提供基础。 方法： 1、采用两步酶消化法从兔触须部和腹部皮肤分别获取FSCs和ESCs,进行原代与传代培养,用倒置相差显微镜观察细胞形态。 2、免疫组化检测兔FSCs和ESCs的表面标记物,β1整合素和角蛋白19(keratin19,K19)的表达差异。用MTT法考察FSCs和ESCs增殖活性。 3、采用流式细胞仪分析兔的第5代和第15代FSCs和ESCs各周期细胞的分布;比较经传代后两种细胞的生物学活性。 4、用荧光定量PCR技术检测传代培养的FSCs和ESCs K19,βl整合素在mRNA水平上的表达差异。 5、采用单细胞法和组织块法培养,分离培养人头皮来源的FSCs;分离培养人皮肤的ESCs,进行原代和传代细胞形态学观察。 6、比较人FSCs和ESCs体外贴壁时间、细胞形态结构、生长曲线和细胞增殖活性的差异。 结果： 1、采用两步酶法成功地分离出兔的FSCs和ESCs,FSCs分离培养2天丌始有细胞贴壁,3天时贴壁的细胞有明显的聚集倾向,7天后克隆增大丌始融合,传代培养的FSCs贴壁迅速,细胞培养8天达到完全融合。ESCs培养10天细胞才有克隆样生长趋势;传代培养细胞贴壁缓慢,细胞培养2周80%融合。 2、免疫组化染色结果显示,兔FSCs和ESCsβ1整合素、K19免疫染色均阳性表达。FSCs和ESCs生长曲线的比较除第2天无明显的差异外,从第6天丌始FSCs的增殖活性明显高于ESCs,具有统计学意义(P<0.05),第10、14、18天FSCs的增殖活性逐渐增强,直到第26天,增殖活性开始下降;ESCs在第10天达到了增殖最高峰后细胞增殖活性迅速下降。FSCs显示出持续高增殖,其高增殖时间是ESCs的2倍。 3、流式细胞仪分析细胞周期结果显示,传代培养的FSCs和ESCs随代次延长S期百分比和PI值均有下降,同代次细胞FSCsPI值大于ESCs。 4、荧光定量PCR检测兔FSCs和ESCs的β1整合素和K19基因表达,显示FSCsβ1整合素和K19mRNA表达明显高于ESCs。 5、“两步酶”分离法可获取大量人FSCs和ESCs;单细胞培养FSCs细胞大部分在24h内贴壁,传代细胞增殖迅速,3天左右达到80%以上融合。组织块培养5天可见细胞在组织周围爬出,细胞呈表皮样。生长迅速,15天时可见表皮样细胞周围出现成纤维样的细胞。ESCs培养3天时细胞多悬浮生长。传代细胞增殖缓慢,培养7天细胞达到80%融合。 6、人FSCs和ESCs β1整合素、K19免疫染色均阳性。FSCs与ESCs生长曲线相比,FSCs具有更高的增殖活性且有一个相对较长高增殖活性的生长期。 结论： 1、“两步酶”消化法是一种安全、高效的FSCs和ESCs的分离方法。可在较短时间内为实验研究提供大量目标细胞。 2、人和兔来源的FSCs与ESCs均表达表皮干细胞标志β1整合素和K19,且FSCs显示高表达。 3、获取的FSCs和ESCs均具有较高的增殖能力,经体外培养的FSCs能在体外长时间扩增且细胞周期分布稳定。 4、FSCs和ESCs均可以作为皮肤组织工程的种子细胞,FSCs不仅获取容易且具有更高的增殖活性和多分化潜能,对构建全层工程皮肤,FSCs更有优势。

关键词： 胃癌   凋亡   增殖   microRNA   miR-650   RGS7  

摘要： 目的：胃癌是常见的恶性肿瘤之一,具有高发病率和高死亡率的特点,其5年生存率仅约30%-40%。目前胃癌发病的microRNA分子机制相关研究资料仍相当有限,本文研究miR-650的表达与胃癌细胞增殖及凋亡等活动之间的关系,探讨了miR-650在胃癌发病机制中的调控作用及临床意义。 方法：采用RT-PCR检测miR-650在胃癌组织及胃癌细胞中的表达水平,分析患者术后生存期与miR-650的表达水平等临床因素间的内在联系,胃癌细胞转染成熟miR-650序列及其抑制剂-LNA寡核苷酸序列后,利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,通过LC-MSMS系统定量分析筛选miR-650靶蛋白,采用Western Blot检测miR-650靶蛋白RGS7的表达水平,裸鼠体内研究评估miR-650对胃癌细胞的生物学影响及其抑制剂的生物疗效。 结果：胃癌组织中miR-650表达水平存在明显差异,患者术后生存期与miR-650的表达水平密切相关,而与性别、肿瘤大小及肿瘤分期等临床因素无明显相关性。KATO Ⅲ、NUGC4及SGC-7901细胞高水平表达miR-650,而NCI-N87及MKN-45细胞仅微量表达miR-650,胃癌细胞转染miR-650抑制剂后其增殖能力明显下降,胃癌细胞凋亡水平明显上升,同时发现RGS7蛋白是miR-650下游靶蛋白之一,靶蛋白RGS7表达水平与miR-650表达水平呈负相关,动物体内研究证实miR-650抑制剂可显著抑制体内肿瘤生长。 结论：胃癌细胞中miR-650的高水平表达可促进细胞增殖并抑制其凋亡,其机制可能是抑制靶蛋白RGS7的表达。MiR-650在胃癌形成过程中可调控胃癌细胞的增殖及凋亡等多个过程,并且其不同表达水平与患者术后生存期长短密切相关,因此miR-650有可能作为一种新型特异性肿瘤标志物,对我们全面理解胃癌发病机制、寻找诊断和治疗靶点及预后监测等将具有重要的潜在临床价值。

关键词： 生物合成纳米技术   Au纳米颗粒   青霉   出芽短梗霉   镰刀菌   尖刀镰刀菌   尖叶拟船藓   生物合成生化机制   生物调控合成   生物学效应   细胞毒性  

摘要： 纳米材料具有独特的物理和化学性质,如大的比表面积、高的催化活性和生物相容性,已被广泛地用于催化、能源、生物和分析等领域。随着传统的物理和化学制备纳米材料方法的发展,近年来采用生物方法制备和组装纳米结构材料的研究引起了广泛的关注。生物合成的纳米材料因富集大量生物活性分子被赋予独特的物理化学特性、生物活性以及良好的分散性和稳定性,使其在生物化学等领域具有广泛的应用前景。目前,已有多种生物包括细菌、放线菌、真菌以及一些高等植物用于合成金、银、硫化镉、硫化锌以及磁性氧化铁等纳米材料。与此同时,实现纳米材料尺寸、形貌生物可控合成也成为纳米生物合成新技术前沿研究领域之一。在本研究小组已有的纳米生物技术研究工作基础上,本论文瞄准这一前沿研究方向,开展了纳米材料生物可控合成技术的研究。以4株真菌包括青霉(Penicillium sp.)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulan)、镰刀菌(Fusarium sp.)及尖孢镰刀霉(Fusarium oxysporum)和尖叶拟船藓植物(Dolichomitriopsis diversiformis)为生物材料,研究了不同真菌合成Au纳米颗粒的生化合成机制;发展了细胞内调控合成不同尺寸Au纳米颗粒新方法;探索了D. diversiformis植物细胞外调控合成不同形貌Au纳米材料的规律;并进一步考察了富集不同生物活性分子Au纳米颗粒的细胞生物学效应,以及对肿瘤细胞毒性作用机制。以期为生物调控合成纳米材料基础性研究和进一步应用提供有益的探索。本论文研究工作具体包括以下几方面： 1.不同真菌合成Au纳米颗粒生化合成机制研究 利用环境分离的***、Fusarium sp.及F. oxysporum3株真菌发展了真菌细胞内合成Au纳米材料的生物方法,并对其合成的生化合成机制进行了比较分析。将A. pullulans、Fusarium sp和F. oxysporum细胞与氯金酸共孵育,3株真菌均可细胞内合成Au纳米颗粒;生化成分分析及FTIR光谱表征发现,***细胞以还原糖为生物活性分子介导细胞内Au纳米颗粒合成,而Fusariumsp.及F. oxysporum以蛋白质为生物活性分子介导细胞内Au纳米颗粒组装;进一步SDS-PAGE蛋白质电泳分析表明,Fusarium sp细胞内分子量为100kDa,25kDa和19kDa的蛋白质参与Au纳米颗粒合成,而F. oxysporum细胞内分子量为25kDa和19kDa蛋白质参与Au纳米颗粒合成,A. pullulans合成的Au纳米颗粒不存在蛋白质。研究结果将揭示3株真菌细胞不同的生物活性分子介导了Au纳米材料的合成。通过采用LC-MS/MS法对蛋白质分子进行鉴定,结果表明Fusariumsp.参与合成的Au纳米颗粒的3个蛋白质分别为脂膜ATP酶(plasma membraneATPase)、3-葡聚糖结合蛋白(3-glucan binding protein)及3-磷酸甘油脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase),这些蛋白均为细胞能量代谢相关蛋白。细胞超薄切片表征发现,细胞内合成的Au纳米颗粒均存在真菌细胞液泡中。时间动力学TEM结果表明,还原糖易于合成球形、单分散性Au纳米颗粒,蛋白质易于介导Au纳米颗粒聚合体的组装。 2.基于温度调控真菌细胞内合成不同尺寸Au纳米颗粒研究 以温度为调控因子,利用环境分离的真菌Penicillium sp发展了一种细胞内调控合成尺寸可控的Au纳米颗粒新方法。将真菌Penicillium sp细胞与氯金酸共培育后,可在细胞内合成球形的、单分散性的Au纳米颗粒,粒径分布18-35nm。合成动力学TEM表征发现,细胞吸收反应溶液AuCl4-,在细胞内首先被还原形成Au核,再组装成Au纳米颗粒。生物组分分析结果表明,Penicillium sp细胞内还原糖为活性组分介导细胞内Au纳米颗粒的合成。通过控制合成反应温度,在4℃条件下,Penicillium sp细胞可细胞内合成4-10nm粒径的Au纳米颗粒。在28℃则合成20-37nm粒径颗粒,在不恒定的温度条件下,Penicillium sp细胞则合成多分散性的Au纳米颗粒。TEM结果表明,纯化的Au纳米颗粒也表现为球形、单分散性等相似的特征。FTIR光谱表征表明,纯化的Au纳米颗粒存在1405cm-1多糖羰基伸缩振动。研究结果揭示通过控制反应温度条件,可实现真菌细胞内对纳米颗粒的尺寸控制。 3.基于pH调控植物细胞外合成不同形貌Au纳米颗粒研究 利用尖叶拟船藓(D. diversiformis)植物体为生物材料,以pH为调控因子,发展了一种细胞外生物调控合成Au纳米颗粒的新方法。将氯

关键词： MESENCHYMAL STROMAL CELLS   HEPATOCYTE-LIKE CELLS   EPITHELIAL-CELLS   IN-VITRO   SCIATIC-NERVE   RAT MODEL   MICROSCOPIC ANATOMY   CEREBRAL-ISCHEMIA   PROTEOME ANALYSIS   FETAL MEMBRANES  

摘要： The amniotic membrane (AM) and amniotic fluid (AF) have a long history of use in surgical and prenatal diagnostic applications, respectively. In addition, the discovery of cell populations in AM and AF which are widely accessible, nontumorigenic and capable of differentiating into a variety of cell types has stimulated a flurry of research aimed at characterizing the cells and evaluating their potential utility in regenerative medicine. While a major focus of research has been the use of amniotic membrane and fluid in tissue engineering and cell replacement, AM-and AF-derived cells may also have capabilities in protecting and stimulating the repair of injured tissues via paracrine actions, and acting as vectors for biodelivery of exogenous factors to treat injury and diseases. Much progress has been made since the discovery of AM and AF cells with stem cell characteristics nearly a decade ago, but there remain a number of problematic issues stemming from the inherent heterogeneity of these cells as well as inconsistencies in isolation and culturing methods which must be addressed to advance the field towards the development of cell-based therapies. Here, we provide an overview of the recent progress and future perspectives in the use of AM-and AF-derived cells for therapeutic applications.

关键词： NECROSIS-FACTOR-ALPHA   BONE-MARROW FAILURE   ABNORMAL LYMPHOKINE PRODUCTION   COLONY-STIMULATING FACTOR   SELF-RENEWAL CAPACITY   UMBILICAL-CORD BLOOD   NATURAL GENE-THERAPY   DOUBLE-STRAND BREAKS   C-DEFICIENT CELLS   CROSS-LINK REPAIR  

摘要： Fanconi anemia (FA) is the most common inherited bone marrow failure syndrome. FA patients suffer to varying degrees from a heterogeneous range of developmental defects and, in addition, have an increased likelihood of developing cancer. Almost all FA patients develop a severe, progressive bone marrow failure syndrome, which impacts upon the production of all hematopoietic lineages and, hence, is thought to be driven by a defect at the level of the hematopoietic stem cell (HSC). This hypothesis would also correlate with the very high incidence of MDS and AML that is observed in FA patients. In this paper, we discuss the evidence that supports the role of dysfunctional HSC biology in driving the etiology of the disease. Furthermore, we consider the different model systems currently available to study the biology of cells defective in the FA signaling pathway and how they are informative in terms of identifying the physiologic mediators of HSC depletion and dissecting their putative mechanism of action. Finally, we ask whether the insights gained using such disease models can be translated into potential novel therapeutic strategies for the treatment of the hematologic disorders in FA patients.

关键词： 期刊   报刊   主编   编辑人员   Cell Research   出版   细胞生物学  

摘要： 《细胞研究》期刊是由中国科学院上海生命科学研究院和中国细胞生物学学会联合出版的一份细胞生物学领域有悠久历史的英文月刊,近年来已从国内的一家小期刊发展成为亚太地区的一流科学期刊之一,该刊目前所享有的国际声望和关注很多都可归功于与自然出版集团(NPG)的一个持续合作项目。这个项目从2006年开始,当时该刊被纳入了后者的"亚洲学术期刊"计划。本文是对在这个合作项目中所涉及的关键人士的五篇系列采访文章当中的第五篇,在这篇文章中,《自然细胞生物学》期

关键词： 糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D   糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白质   前列腺干细胞抗原   前列腺癌   PC-3细胞  

摘要： 目的 初步研究GPI-PLD基因过表达对前列腺癌PC-3细胞株GPI-PLD酶活性的影响,探讨GPI-PLD释放前列腺干细胞抗原（PSCA）后前列腺癌PC-3细胞株生物学功能的改变,进一步探讨PSCA的生物学功能和在前列腺癌发病过程中的作用与地位,为运用GPI-PLD基因 治疗前列腺癌等肿瘤性疾病打下坚实基础。 方法 1.收集26例正常人外周血血清和18例前列腺癌患者外周血血清,测定其GPI-PLD酶活性。 2.采用梭华-Sofast阳离子聚合物将本实验室已经构建的真核表达载体pcDNA3.1（+）/GPI-PLD转入前列腺癌PC-3细胞,以转染空载体的pcDNA3.1（+）的PC-3细胞组、未转染的PC-3细胞组为对照,800ug/mLG418筛选出稳定表达的阳性细胞克隆。 3.逆转录酶-PCR（RT-PCR）检测转染前后细胞内GPI-PLD mRNA水平。利用本实验室自制的具有完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶（placental-type alkaline phosphatase, PLAP）作为底物,定量检测稳定转染前后细胞内GPI-PLD酶活性。ELISA法检测各组细胞PSCA的释放情况,流式细胞术检测细胞表面GPI锚定的PSCA表达水平以及细胞周期和凋亡率,细胞计数法测定细胞生长曲线。 结果 1.前列腺癌患者和正常人对照组外周血血清GPI-PLD酶活性（转化底物PLAP的百分率）分别为29.79%±4.13%和38.27%±5.73%,前列腺癌患者比正常人对照组的GPI-PLD酶活性明显下降,差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。 2. RT-PCR结果和GPI-PLD酶活性测定结果表明,稳定高表达GPI-PLD的前列腺癌PC-3细胞系已经建立。①经G418筛选后,稳定转染GPI-PLD的PC-3细胞组GPI-PLD mRNA相对表达量较转染pcDNA3.1（+）的PC-3细胞组和未转染的PC-3细胞组明显增高,GPI-PLD mRNA表达水平（相对灰度值,IA比值）分别为0.976±0.041、0.549±0.032和0.522±0.047,差异有显著统计学意义（P＜0.01）。②相比转染pcDNA3.1（+）的PC-3细胞组和未转染的PC-3细胞组,稳定转染GPI-PLD的PC-3细胞中GPI-PLD酶活性明显增高,差异有显著统计学意义（P＜0.01）,转染GPI-PLD的PC-3细胞组中GPI-PLD酶活性（转化底物PLAP的百分率）达到24.47%±6.89%,转染pcDNA3.1（+）的PC-3细胞组和未转染的PC-3细胞组GPI-PLD酶活性（%）相对较低,分别为11.63%±6.04%和10.10%±5.38%。 ***法检测细胞培养基上清中释放的PSCA浓度结果显示,转染GPI-PLD的PC-3细胞组培养基上清中PSCA浓度为146.96±3.32pg/mL,转染pcDNA3.1（+）组和未转染组这一值分别为90.66±3.19pg/mL和89.24±1.77pg/mL,差异有显著统计学意义（P＜0.01）。 4.流式细胞术检测细胞表面GPI锚定蛋白质PSCA水平结果显示,相比pcDNA3.1（+）/PC-3细胞组和PC-3细胞组,pcDNA3.1（+）/GPI-PLD/PC-3细胞组的平均荧光强度显著降低,有显著性统计学意义（P＜0.01）。GPI-PLD转染组平均荧光强度为59.79±0.92,而其他两对照组分别为85.63±1.30和85.97±1.23。 5.流式细胞术检测细胞周期结果显示,相比pcDNA3.1（+）/PC-3细胞组和PC-3细胞组,pcDNA3.1（+）/GPI-PLD/PC-3细胞组的G0-G1显著上升,S期显著下降,G2期略有下降,差异有统计学意义（P＜0.05）。细胞计数和细胞生长曲线表明,pcDNA3.1（+）/GPI-PLD/PC-3细胞组生长速度较pcDNA3.1（+）/PC-3细胞组和PC-3细胞组明显减慢。凋亡结果显示,pcDNA3.1（+）/GPI-PLD/PC-3细胞组相对于其他两个组,凋亡值显著上升,差异有显著统计学意义（P＜0.01）。 结论 1.前列腺癌患者较正常人的外周血血清GPI-PLD酶活性显著降低,提示前列腺癌患者GPI-PLD基因表达下调。 2.成功构建GPI-PLD基因稳定过表达的前列腺癌PC-3细胞株。 3. GPI-PLD基因过表达能成功释放PC-3细胞膜上GPI锚定蛋白质PSCA,使细胞培养基上清中的失GPI锚定PSCA增加,降低膜表面GPI锚定PSCA的水平。 4. GPI-PLD基因过表达可引起前列腺癌PC-3细胞株细

摘要： 细胞生物学是生命科学四大基础学科之一[1],是高校生命科学相关专业的基础课程。作为实验科学的细胞生物学,其实验课程不仅为学生掌握细胞生物学基本研究原理和方法奠定了基础,也培养了学生科学的实验思维能力和科研创新能力[2]。减少验证性实验,增加综

关键词： 细胞生物学   雌激素受体α   ERE4   转染   抗生素筛选   HeLa细胞株  

摘要： 环境雌激素（Environmental Estrogens, EEs）在极低的剂量水平就具有雌激素活性，且可通过食物链进入人体并在生物体内富集从而对机体产生不利影响。在中国水体污染非常严重，其中雌激素污染也已引起人们广泛关注，但目前尚没有一种高灵敏度检测其综合生物学活性的方法。环境雌激素主要是通过激素受体介导调控靶基因转录表达，从而产生雌激素类效应。本研究利用雌激素受体α（Estrogen Receptor α, ERα）、雌激素受体反应元件(Estrogen Receptor response Element, ERE)和荧光素酶报告基因等，建立了一种用于检测环境雌激素的高灵敏度单克隆稳定转染HeLa细胞株检测系统。研究内容包括： 一、根据人雌激素受体α基因完整开放阅读框（ORF）序列设计特异性引物，应用RT-PCR技术从人胎盘组织中扩增到长约为2kb的DNA片段。将其克隆至pEASY-T1载体，测序结果表明成功获得ERα完整ORF，包括1788个核苷酸，编码595个氨基酸残基。将该片段克隆至真核表达载体构建重组质粒pEGFP-ERα，通过PCR、双酶切和测序鉴定表明重组质粒构建成功。将该质粒转染人子宫颈癌（HeLa）细胞，通过G418抗生素筛选获得稳定表达ERα基因的HeLa细胞株，对转染子进行荧光定量PCR鉴定，发现该细胞中ERαmRNA转录水平是阴性对照组的3.45倍，P值分析小于0.05，说明转染子与阴性对照组在ERα mRNA水平存在显著差异，表明ERα基因已稳定存在HeLa细胞中，将该转染子命名为HeLa/ERα。 二、将人工合成的一段四倍串联雌激素受体反应元件ERE4基因插入pGL3-basic载体多克隆位点（MCS）上，构建带有雌激素依赖性顺式调控元件ERE4及由ERE4所调控的报告基因荧光素酶基因（luc）的雌激素作用报告载体pGL3-ERE4-luc。经双酶切、测序鉴定构建成功的pGL3-ERE4-luc重组质粒转染HeLa/ERα转染子，利用潮霉素B抗生素压力（Hygromycin B，HygB）持续筛选，体外添加10-3mmol/L17β-雌二醇（E2），应用化学发光仪检测报告基因荧光吸收达到229,000，说明环境雌激素稳定转染HeLa细胞株检测系统构建成功，将含有以上两种重组质粒的单克隆HeLa细胞株命名为HeLa/ERα/ERE4细胞株。 三、利用构建成功的稳定转染的HeLa细胞株检测系统对钱塘江杭州段水域和浙江省杭州市下沙高教园区人口密集地生活污水同一时段各取水点进行雌激素污染检测，总取水点为10处，取水样品数为16个，检测出含雌激素污染样品为2个，检测出总雌激素活性(相当于E2)为0.2-0.3ng/L。 四、探讨环境雌激素污染对昆虫机体生长发育的影响，利用本实验室家蚕生物反应器为实验平台，以菁松×皓月家蚕品种为实验材料，以含雌激素污染水样为家蚕饲料用水，用于从家蚕孵化至5龄整个生长时期的食物来源。检测5龄蚕血淋巴雌激素含量，与正常水源喂养家蚕5龄蚕血淋巴雌激素含量比较发现过高雌激素（终含量为4×10-3pmol/gs，以10pmol/L E2溶液配制饲料）添加导致家蚕整体生长大小不整齐、部分个体变小、发育变慢，熟蚕不结茧率明显增加，出现死笼情况多等症状，此外，雌二醇终含量为4×10-3pmol/g时，家血淋巴中的雌激素含量反而降低。 该方法利用ERE4的调节作用和荧光素酶活性通过两级放大方法，为检测样品中雌激素的综合活性建立了一种高灵敏度高通量的检测方法。

关键词： 引导式教学   多媒体技术   细胞生物学实验  

摘要： 在高等医学院校细胞生物实验教学中,运用引导式教学模式和多媒体技术有机结合的方法,使实验教学和课堂教学成为一个有机整体,实现了教学互动、教学相长,提高了学生的思考能力和创造能力,为培养素质高、综合能力强的有用医学人才提供了科学保证。