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关键词： 非编码小RNA   HSC活化   ERK信号通路   生物学活性   肝星状细胞   α平滑肌肌动蛋白   细胞外基质  

摘要： [研究背景及目的]：<br>　　 肝纤维化是慢性肝损伤进展至肝硬化的重要阶段，以细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)过度沉积为主要病理特征。尽管肝脏中许多类型的细胞如肝细胞、胆管细胞等都参与了肝纤维化过程，但肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSCs)是产生ECM的最主要细胞。当发生肝损伤时，HSC活化并分化为成纤维样细胞，进而表达α平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)、分泌促纤维生成ECM。因此，控制HSC的活性可为肝纤维化的治疗提供新的靶点。<br>　　 微小RNA(microRNA，miRNA)是一类约有21-25个碱基的非编码小RNA，它通过完全或不完全结合于靶序列的3’UTR端，降解靶基因mRNA或抑制其翻译，对基因表达发挥调控作用。近年来，大量研究表明：miR-21参与介导了多种器官纤维化的发生，如肺，肝脏，心脏等。我们的前期初步研究发现，miR-21是与HSC活化相关的miRNA，对于肝纤维化发病机制研究和临床治疗具有重要的应用价值。<br>　　 本文旨在探讨miR-21对HSC活化和生物学活性的调控作用及其机制。<br>　　 [实验方法]：<br>　　 一、检测不同活化状态大鼠HSC和HSC-T6miR-21及相关基因差异表达<br>　　 胶原酶改良原位循环灌流法分离雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠原代HSC，分设三组：静息状态组即原代培养2天；TGFβ(2ng/ml)刺激3天组；TGFβ刺激7天组。realtimeRT-PCR法检测各组细胞miR-21及纤维化相关基因组织金属蛋白酶抑制-1(tissueinhibitorofmetalloproteinase-1，TIMP-1)、基质金属蛋白酶类(matrixmetalloproteinases，MMPs)、α-SMA及细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase，ERK)、SPRY2的表达。<br>　　 二、检测正常大鼠及肝纤维化模型肝脏组织及血清miR-21差异表达<br>　　 将雄性SD大鼠随机分为4组，每组7只。第1组为正常对照组，第2～4组为实验组，分别为二甲基亚硝胺(DMN)注射1周组、2周组和4周组。2～4组予1％DMN100ul/100g体重腹腔注射，每周连续注射3次，分别于注射1周、2周、4周处死大鼠，留取大鼠静脉血及肝脏组织；HE、MASSON、VG染色检测ECM含量并对肝纤维化程度分级，图像分析仪半定量分析；realtimeRT-PCR检测肝脏组织及血清中miR-21的表达；realtimeRT-PCR测定肝组织TIMP-1、MMPs、α-SMA、ERK、SPRY2的表达。<br>　　 三、下调miR-21表达对HSC-T6细胞生物学特性的影响<br>　　 用lipofectamine2000将miR-21inhibitor转染HSC-T6细胞，6小时换液，48小时后Trizol法抽提miRNA，realtimeRT-PCR鉴定miR-21表达；CCK-8检测HSC-T6细胞的增殖情况；realtimeRT-PCR肝纤维化相关基因α-SMA、TIMP-1及MMPs等mRNA和蛋白表达变化；<br>　　 四、下调miR-21表达对HSC-T6ERK信号通路的调控作用<br>　　 用lipofectamine2000将miR-21inhibitor转染HSC-T6细胞，6小时换液，48小时后抽提蛋白和总RNA，westernblot法检测miR-21调控靶蛋白SPRY2表达；realtimeRT-PCR和westernblot法检测ERK通路相关基因p-ERK1/2、ERK1/2、RSK2的表达；细胞免疫荧光法检测ERK通路相关基因ERK1、RSK2、SPRY2的表达。<br>　　 五、验证miR-21对SPRY23'-UTR的靶向调控作用<br>　　 设计SPRY23'-UTR报告基因质粒，同时合成miR-21寡核苷酸片段miR-21mimic，将miR-21mimic与SPRY2报告基因质粒共转染HEK-293细胞，证实SPRY2为miR-21的靶基因。<br>　　 六、统计学处理<br>　　 数据采用SPSS11.0统计软件包进行分析，结果以X-±S表示。P<0.05为具有统计学差异。<br>　　 [实验结果]：<br>　　

关键词： 宫颈肿瘤   乳头状瘤病毒,人   siRNA表达载体   顺铂  

摘要： 目的探讨人乳头瘤病毒16型（HPVl6）E7基因小干扰RNA（siRNA）表达载体对宫颈癌CaSki细胞生物学活性的影响。方法利用脂质体HPVl6E7特异性siRNA表达载体（HPVl6-E7Si）、空载体（CaSki-Si）转染CaSki细胞，荧光定量lit-PCR、流式细胞仪检测HPVl6-ETSi、CaSki-Si细胞E7mRNA和蛋白的变化；流式细胞仪及MTr法检测2种细胞的细胞周期及生长曲线变化，并检测2种细胞对顺铂的敏感性。结果成功获得沉默E7基因的克隆细胞株CaSki-E7Si及阴性对照CaSki-Si；CaSki-E7Si细胞生长明显慢于CaSki-Si细胞（P〈0．05），且前者细胞的凋亡峰明显增多。2种细胞加用顺铂作用48h后发现，CaSki—Si细胞周期阻滞在S-G2期，HPVl6-E7Si阻滞在q。，期。结论HPVl6 E7 siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌Ca$ki细胞E7基因的表达，促进肿瘤细胞凋亡，并增加顺铂的敏感性。

关键词： 舌鳞状细胞癌   醛脱氢酶   肿瘤干细胞   细胞鉴定  

摘要： 研究背景 肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)理论认为在肿瘤细胞中存在一类数量极少的(＜5%)、具有干细胞特性的细胞，具有高度的自我更新、无限增殖和多向分化的潜能。在肿瘤的发生、发展、侵袭、转移和放、化疗的敏感性中起决定性的作用。这一理论的提出改变了人们对肿瘤发生、侵袭和治疗认识，为研究肿瘤的发病机理、发展、复发和治疗提供了新的思路。寻找高效干细胞标志物，分选和鉴别肿瘤干细胞成为肿瘤的研究热点。醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenas，ALDH)家族是一类具有氧化细胞内各种醛类成为相应的弱羧酸的解毒酶。最近几年有研究指出醛脱氢酶(ALDH)可以用来富集干细胞样细胞。乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenas1,ALDH1,ALDH1A1)已经被用于乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、眼癌、造血系统恶性肿瘤、结直肠癌干细胞研究，并被认为是一种有效的肿瘤干细胞标志物。因此，通过ALDH分选舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株中具有干细胞特性的细胞亚群是可能实现的。本实验拟通过检测舌鳞癌细胞株中ALDH的表达，以期分选出ALDH细胞亚群，并通过体外增殖、诱导分化、无血清培养和动物致瘤等实验对ALDH细胞进行鉴定，以期为寻找舌癌干细胞标志物提供实验依据。 第一部分舌鳞状细胞癌醛脱氢酶(ALDH)高表达亚群细胞的分选 目的： 通过检测醛脱氢酶(ALDH)在人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞系中的表达，分选出ALDH高表达(ALDH)亚群细胞。 方法： 检测人舌鳞癌细胞Tca8113的ALDH的表达，运用流式细胞技术分选出ALDH高表达(ALDH)和ALDH低表达(ALDHlow)亚群肿瘤细胞。 结果： 人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞系中含有高表达醛脱氢酶(ALDH)活性的细胞亚群，并且含量很低，只有1.3%。 第二部分舌鳞癌ALDH亚群细胞的体外增殖、分化和无血清培养 目的: 通过进行体外培养增殖、诱导分化和无血清培养成球实验，了解ALDH、ALDHlow和未分选的肿瘤细胞的增殖速度差异，ALDH细胞分化情况，和ALDH、ALDHlow在无血清培养基里细胞生长情况。 方法: 将相同数量的ALDH、ALDHlow和未分选的肿瘤细胞在传统的普通培养基(serum supplemented medium,SSM)里进行培养，定期用CCK-8法检测各组细胞增殖情况，绘制细胞生长曲线。将分选收集的ALDH肿瘤细胞制备成单细胞悬液，接种至含有RPMI1640完全培养基的培养瓶，置于5%CO2、37℃培养箱中培养，检测培养后第3、5、7、9天细胞中ALDH的表达水平。将分选的ALDH、ALDHlow细胞制成单细胞悬液，以2x104个/毫升的密度接种至培养瓶，加入无血清培养基(serum-free medium,SFM),每天观察细胞球形成情况，每3天换液。 结果: 在体外增殖实验中，分选出的ALDH肿瘤细胞增殖能力要高于ALDHlow肿瘤细胞和未分选的肿瘤细胞，而且在体外培养的ALDH肿瘤细胞中ALDH+比例逐渐下降至分选前的比例，ALDH分化形成了ALDH和ALDHlow。ALDH肿瘤细胞能在SFM中悬浮生长形成肿瘤细胞球， ALDHlow肿瘤细胞大部分死亡，未形成肿瘤细胞球。 第三部分舌鳞癌ALDH亚群细胞动物致瘤试验 目的: 通过动物致瘤实验了解ALDH、未分选的肿瘤细胞致瘤能力的差别。 方法: 将ALDH和未分选的肿瘤细胞按不同数量级接种在裸鼠的背部皮肤下，观察各组成瘤情况。 结果: ALDH亚群肿瘤细胞比未分选肿瘤细胞致瘤性强。 结论 舌鳞癌Tca8113细胞系中存在一小群高表达醛脱氢酶的细胞，这群细胞具有增殖力强、多向分化、强致瘤力等肿瘤干细胞的生物学特性。ALDH可能是舌鳞癌干细胞的标志物之一。

关键词： 高校专业课   教材   教学内容   教材模式   细胞生物学  

摘要： 针对高校专业课教学现状,以高校专业课细胞生物学为例,分别从教材体系、教学内容和教学模式上入手,对学科知识的完整性、连续性和开放性进行了探索,建立了理论和实践相结合的教学模式,提高了教学质量,培养了学生的创新能力,在实践中效果良好。

关键词： Pokemon   MicroRNA203   Survivin   神经胶质瘤   生物学特性  

摘要： 背景：红系髓性致癌因子pokemon (POK erythroid myeloid ontogenic factor)是POK蛋白家族中的新成员，位于许多肿瘤原癌基因和抑癌基因的上游，在癌基因转化过程中起关键性作用;MicroRNA203（miR-203）是近几年来发现的又一个非编码小RNA，像其它的microRNAs一样，能够与靶基因mRNA的3’UTR结合来影响其稳定性或直接降解，从而抑制靶基因的翻译过程。Survivin则是IAP (inhibitor of apoptosis)家族中最小的成员，在大多数肿瘤和胚胎中都明显表达，而在正常分化的细胞中几乎无表达，它可以通过影响肿瘤细胞周期和caspase-3、caspase-7活性来促进增殖。本研究主要探讨了原癌基因pokemon与miR-203对胶质瘤U251细胞生物学特性的影响，并且阐明了它们对surivivn基因表达的调控机制。 目的：观察原癌基因pokemon与miR-203对胶质瘤U251细胞生物学特性的影响;探讨pokemon和miR-203在胶质瘤细胞中对survivin表达的调控机制。 方法：通过脂质体转染方法将si-pokemon RNA，pokemon表达质粒和miR-203表达质粒分别导入胶质瘤U251细胞后，应用细胞生长曲线、克隆形成实验、MTT实验、流式细胞术评价细胞生长、增殖和凋亡等生物学特性的变化及对TRAIL和塞来昔布的敏感性，通过Real-time PCR和Western blot方法检测surivivin在mRNA和蛋白水平的变化，采用双荧光素酶分析技术和ChIP实验(Chromatin immunoprecipitation assay)进行功能性验证和机理研究。 结果： 1.胶质瘤U251细胞与胶质瘤组织中pokemon和survivin的表达水平明显高于正常胶质HEB细胞和正常脑组织。转染si-pokemon RNA后，胶质瘤U251细胞的生长明显减慢（P<0.05），增殖能力减弱（P<0.05），对TRAIL和塞来昔布的敏感性增加，Real-timePCR与Western blot结果显示pokemon与survivin的mRNA水平和蛋白水平协同降低（P<0.05）;反之，转染pokemon表达质粒后，pokemon与survivin的mRNA水平和蛋白水平协同升高（P<0.05）。双荧光素酶报告基因检测和ChIP实验结果证实pokemon与survivin启动子结合并激活其活性。 2.胶质瘤U251细胞中miR-203的表达水平明显低于正常胶质HEB细胞。TargetScan预测结果发现survivin为miR-203的靶基因;转染miR-203的模拟物或表达质粒后，Real-time PCR与Western blot结果分别提示survivin的mRNA水平和蛋白水平下调（P<0.05）;双荧光素酶报告分析技术证实抗凋亡基因survivin为miR-203的直接靶点;细胞生长曲线结果显示miR-203组的生长速度明显受抑（P<0.05）;MTT实验表明miR-203组的增殖能力减弱（P<0.05）及药物敏感性增加;流式细胞术结果示miR-203组的凋亡比例明显升高（P<0.01）。 结论：原癌基因pokemon能促进胶质瘤U251细胞的生长和增殖，减弱其对TRAIL和塞来昔布的敏感性;相反，miR-203则使胶质瘤U251细胞表现出相反的生物学特性，是一个抗增殖、促凋亡的miRNA，其机理可能通过调控survivin的表达来实现，这为探索胶质瘤的发病机理和生物学治疗提供一条新思路。

关键词： 间充质干细胞   羊水   细胞增殖   细胞分化   内皮细胞分化   低氧  

摘要： 目的体外分离培养人羊水间充质干细胞（HAFMSCs, human amniotic fluid mesenchymal stem cells）,观察其生物学特性。低温冻存HAFMSCs三个月,观察冻存后细胞的生物学特性,找出最佳的冻存方案。体外诱导HAFMSCs向内皮细胞分化,分别在常氧及低氧环境下观察其分化为内皮细胞的能力。 方法采用四种方法分离培养HAFMSCs,用MTT法观察各组细胞的增殖能力。流式细胞技术（FACS）检测各组细胞表面抗原CD29, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, HLA-ABC, HLA-DR等的表达。比较各组细胞成脂、成骨的分化能力,及检测各组细胞中OCT-4, Nanog等mRNA表达水平。用不同成分的冻存液冻存HAFMSCs,冻存三个月后复苏细胞,并分析其存活率、生物学特性及分化能力。体外采用VEGF和bFGF联合诱导HAFMSCs向内皮细胞分化,FACS分析细胞vWF、CD31及CD133mRNA的表达水平,采用细胞免疫荧光的方法鉴定诱导分化后细胞vWF的表达情况,观察诱导后细胞在Matrigel上形成毛细血管样结构的能力。比较低氧环境与常氧环境下上述指标的差异。 结果四种不同的培养方法均培养出HAFMSCs。其中Chang培养基两步培养法培养的细胞,其贴壁时间、细胞集落形成时间及细胞传代时间较其余三组更短,培养1.5天即有细胞贴壁,4-5天可见细胞集落形成,细胞增殖快。四组细胞均表达间充质干细胞标记物CD29、CD44、CD73、CD90,而不表达造血干细胞标记物CD34、CD45,符合间充质干细胞的特征,各组之间无明显差异。四组细胞成骨、成脂诱导成功,并分别通过油红O染色及von Kossa染色证实。四组细胞中均检测到OCT-4, Nanog mRNA的表达。冻存三个月后的HAFMSCs,以冻存液方案为DMEM:FBS:DMSO=5:4:1勺细胞存活率最高,细胞增殖能力最强。而复苏后细胞的生长曲线、细胞表型、分化能力及OCT-4, Nanog6勺表达与冻存前细胞相比无统计学差异。HAFMSCs体外诱导分化为内皮细胞,流式细胞技术分析比较各组诱导后细胞中vWF, CD31,CD133等内皮相关标记物抗原的水平,以VEGF和bFGF联合诱导组诱导效率最高,Mtrigel上形成毛细血管结构的能力也最强。低氧环境下经VEGF和bFGF联合诱组HAFMSCs内VEGF, v WF和CD31mRNA水平高于其余组，毛细血结构能力也明显强于其余组。结论HAFMSCs具有易获、体外增殖快、多向分化能力等优势。Chang培基两步培法能够在较短时间内培大量HAFMSCs。短期冻存HAFMSCs对于其生物学特无明显影，最佳冻存配方为DMEM:FBS:DMSO=5:4:1。VEGF和bFGF联合诱较为理体外诱HAFMSCs分化为内皮细胞诱方案。低氧能够促进这过程，在短期低氧环境下，HAFMSCs诱分化为内皮细胞能力与暴于低氧环境时间关。

关键词： 转录因子Glil   乳腺癌   细胞生物学   基因调控  

摘要： 乳腺癌的发病率在所有女性肿瘤中占首位，达22.9％，并且乳腺癌的致死率也在女性癌症中排名第一。近年来乳腺癌在中国妇女中的发病率正悄然上升，在过去的十年间，北京、上海乳腺癌的发病率上升分别超过20％及30％，已接近西方乳腺癌高发国家的水平，因此加强对乳腺癌发生与发展的机制研究已刻不容缓。<br>　　 Hedghog(Hh)/Gli信号通路是一条经典的胚胎发育信号系统，在胚胎发育和胚胎形成后细胞的生长和分化过程中都起着重要作用。转录因子Gli1既是Hh通路下游的效应分子，也是该通路调节的靶蛋白，其表达也是Hh/Gli信号通路激活的标志。尽管已有研究表明，Hh/Gli通路参与了乳腺的正常发育，且与乳腺癌的发生、发展密切相关。例如，Gli1及其他Hh通路成员在乳腺癌组织中常见异常表达；Gli1的高表达可以促进乳腺癌细胞的增殖，并能抑制雌激素受体(estrogenreceptora，ERa)的表达。但是Gli1对乳腺癌其他生物学行为的影响还不很清楚，对其作用的机制也缺乏深入的研究。加之乳腺癌是一种包含多种类型的不均一性疾病。除了不同的病理类型外，还可根据癌细胞雌激素受体(ER)的表达情况，分为雌激素依赖型(ER阳性)和非依赖型(ER阴性)乳腺癌两大类型。不同类型乳腺癌之间具有明显不同的生物学特性和临床表现。Hedghog(Hh)/Gli信号通路对这两种不同乳腺癌的增殖、分化、迁移等是否有不同的影响也不清楚。<br>　　 MCF-7和T47D细胞是ER阳性的雌激素依赖性细胞系，其分化程度相对比较高，而增殖和侵袭能力都比雌激素非依赖性乳腺癌细胞，如MDA-MB-231和SK-BR-3细胞低。本校病理生理教研室在前期研究中发现Gli1在MCF-7和T47D中的表达明显低于MDA-MB-231和SK-BR-3，并显示Gli1的表达水平与ER的表达呈负相关，与乳腺癌的增殖呈正相关。本课题在前期研究的基础上，拟进一步研究Gli1在乳腺癌增殖、粘附、迁移、抗凋亡等生物学行为中的作用及可能机制。我们首先建立了持续性稳定高表达Gli1的MCF-7、T47D细胞系，观察高表达Gli1对乳腺癌细胞粘附、迁移、抗凋亡等生物学特性的影响，继而通过全基因组寡核苷酸微阵列芯片分析，寻找转染Gli1表达质粒的MCF-7细胞与转染空载质粒的MCF-7细胞之间的差异表达基因，分析受Gli1调控的基因在乳腺癌生物学行为中的作用，并预测乳腺癌细胞中Gli1的靶基因，探讨Gli1影响乳腺癌生物学特性的可能机制，进一步研究Gli1在乳腺痛发生发展中作用，寻找乳腺癌的治疗的可能靶点。<br>　　 为研究Gli1在乳腺癌发生和发展中的作用，全文由以下三个部分组成：<br>　　 第一部分，稳转高表达Gli1对乳腺癌细胞增殖、迁移、粘附和凋亡的影响<br>　　 目的：探讨Gli1在乳腺癌细胞增殖、粘附、迁移、凋亡等生物学行为中的作用。<br>　　 方法：采用细胞增殖实验、粘附实验、Transwell迁移实验等，与转染空载质粒的对照细胞相比，观察稳定转染高表达Gli1对乳腺癌MCF-7、T47D细胞株增殖、粘附、迁移的影响。给予紫杉醇(paclitaxel，PTX)100nM处理24小时、48小时，采用CCK-8法检测高表达Gli1对PTX凋亡诱导下细胞存活率的影响。<br>　　 结果：成功建立稳转高表达Gli1的MCF-7、T47D细胞株及稳转空载质粒的对照细胞。稳转高表达Gli1促进乳腺癌细胞增殖，并能明显促进细胞的粘附；其中稳转高表达Gli1的MCF-7、T47D细胞粘附能力分别是对照细胞的1.58、1.41倍(p<0.05)；Transwell小室迁移实验中发现稳转高表达Gli1的MCF-7细胞组迁移的细胞数为对照的31.6％(p<0.05)。紫杉醇处理细胞24h、48h，各个时间点高表达Gli1细胞组细胞的存活率均高于对照组(P<0.05)。<br>　　 结论：高表达Gli1能促进乳腺癌细胞MCF-7、T47D的增殖、粘附，抑制乳腺癌细胞MCF-7的迁移，促进其在凋亡诱导剂PTX作用下的存活。<br>　　 第二部分，Glil调控的靶基因的筛选与鉴定<br>　　 目的：筛选Gli1调控的基因，探讨Gli1对乳腺癌生物学行为影响的可能机制，寻找Gli1的靶基因。<br>　　 方法：采用人全基因组寡核苷酸微阵列芯片技术，筛选稳转高表达Gli1的MCF-7与对照细胞之间的差异表达基因，并用QRT-PCR方法验证。生物信息学分析预测Gli1可能的靶基因，采用QRT-PCR方法检测重组人Hedgehog通路配体SHH-N(

ISBN: (纸本)9787122132215

关键词： WWOX基因   慢病毒载体   过表达   白血病   增殖   凋亡   分子机制  

摘要： 目的：1.构建WWOX基因过表达慢病毒重组质粒载体并完成相关鉴定;2.研究上调WWOX基因对人Jurkat及K562白血病细胞生物学特性的影响;3.初步探讨其生物学特性改变的相关分子机制。 方法：1.通过PCR扩增获得目的基因WWOX全长cDNA片段，纯化后经Age I酶切消化。同时用Age I酶对载体质粒进行酶切、回收得到线性化载体片段。经T4噬菌体DNA连接酶作用将WWOX连接至线性化载体，连接产物经转化、涂板、挑取克隆、扩增培养后，用质粒小量抽提试剂盒提取质粒，酶切后PCR凝胶电泳鉴定连接产物，并行序列测定。将构建好的融合基因表达载体进行病毒颗粒包装，得到WWOX过表达慢病毒重组质粒载体系统（pGC-FU-WWOX-GFP和pGC-FU-GFP）。采用qPCR、Western blot等方法对重组载体进行鉴定。2.采用CCK-8比色、集落形成实验、DAPI染色、DNA片段电泳、Annexin V PE/7-AAD双荧光标记、Western blot等方法，研究上调WWOX对Jurkat和K562细胞生物学特性的影响。3.间接免疫荧光检测凋亡相关蛋白p53、p73、NF-κBp65及细胞色素C（Cytochrome C，Cyto C）等的表达及定位。qPCR、Western blot检测Bcl-2、Bax、Cyto C、Caspase-9、Caspase-3、p53、p73及NF-κB p65等凋亡相关蛋白的表达变化。免疫共沉淀、Western blot检测WWOX与p73、p53之间的相互作用。 结果：1.测序鉴定结果与目标序列完全一致，包装后的慢病毒经qPCR测定滴度约为2×108TU/ml。2. WWOX重组慢病毒质粒感染Jurkat及K562细胞48h后，观察到GFP稳定表达。qPCR显示pGC-FU-WWOX组细胞WWOX在mRNA水平表达增加。Western blot检测到约72kD的融合蛋白（WWOX融合GFP）表达，随时间延长，融合蛋白表达呈增加趋势。CCK-8比色实验显示，Jurkat和K562细胞中pGC-FU-WWOX组的细胞生长较两对照组明显受抑制（P＜0.05）。集落形成实验表明，Jurkat和K562细胞中pGC-FU-WWOX组细胞集落形成率较两对照组显著降低（P=0.000）。DAPI染色显示，Jurkat和K562细胞中pGC-FU-WWOX组细胞核呈现Ⅱb晚期凋亡形态。DNA片段电泳显示，Jurkat和K562细胞中pGC-FU-WWOX组出现明显的梯状降解条带，并随时间延长梯状条带生成更加明显。Annexin V PE/7-AAD双荧光染FCM检测显示，Jurkat和K562pGC-FU-WWOX组细胞48h、72h、96h的凋亡率明显高于其他两对照组（P＜0.001），主要为凋亡中、晚期细胞。3.间接免疫荧光染色可见，Jurkat和K562细胞中pGC-FU-WWOX组细胞Cyto C在胞质中呈弥散或粗块状分布，而p53、p73及NF-κB p65均定位于胞质，较对照组表达差异不明显。qPCR及Western blot显示，Jurkat和K562细胞中pGC-FU-WWOX组较其他两对照组Bcl-2表达呈下降趋势，Cyto C表达增加，同时两细胞均有Caspase-9和Caspase-3的剪接激活，而p53表达变化不明显。K562细胞中Bax表达呈上升趋势。免疫共沉淀后SDS-PAGE电泳染色显示，Jurkat和K562细胞pGC-FU-WWOX组均于约73～74kD处出现浓染的蛋白条带，而其他两对照组蛋白条带染色为阴性。蛋白印迹在两种细胞的pGC-FU-WWOX组均检测到p73及WWOX的表达，而未检测到p53蛋白的表达。 结论：1.成功构建WWOX基因慢病毒重组载体。2. WWOX过表达可明显抑制Jurkat和K562细胞增殖，诱导细胞凋亡。3. WWOX过表达均可使Jurkat和K562白血病细胞中Bcl-2表达下调，Cyto C表达增多，同时均可激活Caspase-9和Caspase-3的表达剪接，推测通过激活内源性线粒体途径可能是WWOX抑癌机制之一。4. Jurkat和K562白血病细胞中，上调的WWOX可直接与p73结合，参与诱导细胞凋亡的过程。

关键词： 血液   生物化学   细胞生物学   新发现   解剖学   基础医学   内皮   血管发育   胚胎干细胞   国际学术期刊   凝血酶受体   调节控制   调控  

摘要： 2012年4月17日,国际学术期刊《Developmental Cell》发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所裴钢研究组和北京大学、上海生命科学院健康所和神经所等合作完成的研究论文"Thrombin