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关键词： 肝细胞癌   肿瘤干细胞   CD133蛋白   表面标志物   PI3K-AKT  

摘要： 肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,我国肝癌死亡率高居世界之首。近数十年来,虽然在手术和放化疗等治疗方面取的了很大的进步,但其远期疗效仍不满意,主要原因是术后肿瘤的复发和转移。肝癌手术后5年复发率高达62％。因此,肝癌转移复发的研究现已成为目前肝癌防治工作中的重点。肝癌的转移是一个多环节,多阶段的过程。通过对肝癌患者原发灶和转移灶的对比研究发现,两者之间具有高度同源性,这提示我们,这部分引起转移的肿瘤细胞具有复制出和原发灶异质性相同的能力。<br>　　 许多研究证实了肿瘤组织中并不是每个肿瘤细胞都具有致瘤性,而是由一部分比例极低的细胞增殖形成的,这部分细胞被称为肿瘤干细胞,并且认为肿瘤干细胞是导致肿瘤发生以及治疗后复发的“根源”。肿瘤干细胞具有:自我更新、分化潜能、高致瘤性、耐药性等生物学特性。<br>　　 目前在对乳腺癌和胰腺癌的研究中发现,肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells)是引起肿瘤转移的重要原因。肝癌中肿瘤干细胞的研究才刚刚起步,目前认为,肝癌干细胞的来源可能为肝干细胞或肝祖细胞,即卵圆细胞。最近,一些研究人员利用肿瘤干细胞表面标志物CD133,从肝癌组织及肝癌细胞系中分离出具有干细胞特性的亚群,为肝癌干细胞的存在找到了新的证据。这些肝癌组织中CD133+细胞,不仅在体外具有很强的增殖和克隆形成能力,还在免疫缺陷鼠的体内具有明显的成瘤优势;同时,CD133+细胞具有较高的干细胞相关基因如catenin、Oct-3/4、Bmi、SMO、Notch-1的表达;在体外适当条件下培养,CD133+细胞能分化为血管内皮样,骨骼肌样或心肌样细胞。<br>　　 人CD133蛋白为细胞膜蛋白超家族成员,为一个含有865个氨基酸、分子量约为120 ku的糖蛋白。其分子结构包括:细胞外NH2-端,2个大的胞外环状结构,5次跨膜结构域,2个小的富含半胱氨酸胞内环状结构和胞内的-COOH结构<br>　　 本研究主要通过对CD133基因的提取及过表达的方法,研究CD133+肿瘤细胞增殖、致瘤性、耐药性及凋亡。研究发现在体外,CD133+肿瘤细胞具有更强的增殖能力,致瘤性及耐药性。进一步研究发现,过表达CD133的肿瘤细胞,其细胞内部PI3K-AKT被过度激活,从而导致了其增殖能力增强,凋亡减弱。综上,我们认为,肝癌中CD133+细胞具有肿瘤干细胞的特性,是肝癌转移复发的重要原因。靶向CD133+肝癌细胞将成为肝癌分子靶向治疗的一个新途径。<br>　　 本文主要分为以下四个部分:<br>　　 第一部分,通过收集肝癌细胞系进行筛选发现,并不是所有肝癌细胞系都表达CD133表面分子,其表达率高低不一。我们通过流式细胞仪检测后,选定Huh7和HepG2两株细胞。Huh7细胞株中CD133的表达率稳定在70％左右,HepG2细胞株中CD133的表达稳定在1％以内。通过提取Huh7细胞中CD133基因序列,构建真核细胞表达载体,转染入HepG2细胞系中,建立稳定表达CD133的HepG2细胞系(HepG2-CD133),另一组HepG2转染空质粒载体,并建立稳定转染细胞系(HepG2-EV)。<br>　　 第二部分,通过对HepG2-CD133和HepG2-EV两株细胞的体外对比发现,CD133组的增殖,耐药能力增强。凋亡减弱。由此推断,CD133分子具有改变细胞增殖等生物学性状的能力,具有肿瘤干细胞的部分特性。<br>　　 第三部分,对HepG2-CD133及HepG2-EV两株细胞的体外成瘤比较。通过对免疫缺陷鼠随机分为两组,分别皮下接种同一数量的HepG2-CD133及HepG2-EV两株细胞,观察记录瘤体大小,3周后将瘤体取出,分别测量大小,重量,进行比较。实验发现,HepG2-CD133组致瘤性明显强于HepG-EV组,主要表现在瘤体的生长速度方面。<br>　　 第四部分,进行HepG2-CD133及HepG2-EV两株细胞分子信号通路的研究。分别提取两株细胞的蛋白,进行分子电泳及蛋白质印迹,观察分子信号通路的变化。HepG2-CD133与HepG2-EV对比发现,CD133组中的PI3K-AKT信号通路被过度激活。这可能是导致HepG-CD133细胞株增殖、致瘤增强,凋亡减弱的直接原因。<br>　　 综上所述,越来越多的肿瘤干细胞研究中将CD133作为一个标志分子,而CD133的功能现在却不清楚。本研究通过过表达的方法,将CD133作为单一的影响因素进行分析,揭示CD133的生物学功能,发现CD133表面分子能使肿瘤细胞具有部分肿瘤干细胞特性,靶向CD133分子可能会成为肿瘤的分子靶向治疗的新途径。

关键词： CXCL12/CXCR4生物学轴   CXCL12因子   CXCR4受体   AMD3100   Tca8113细胞   CCK-8   PCR   增殖   侵袭   transwell  

摘要： 研究背景： 舌部鳞状细胞癌是口腔颌面部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一,它具有：生长速度快,局部侵袭力强,淋巴结转移率高等特点。这些生物学特征,特别是易于向颈部淋巴结转移的特性对患者预后影响很大,因此研究口腔颌面部舌鳞癌细胞的增殖,侵袭及转移对提高患者的治愈率和生存率具有非常重要的意义。 趋化因子是一类能够刺激白细胞的趋化性,吸引中性粒细胞、单核／巨噬细胞等炎性细胞移动到炎症灶,并增强炎性细胞的吞噬杀伤功能,促进它们释放炎症蛋白和炎症介质,直接参与免疫调节和免疫病理反应的小分子分泌蛋白。趋化因子CXCL12对淋巴细胞有强烈的趋化作用并在发育及免疫系统中起重要作用,其在体内多个器官中都可以表达。CXCR4是趋化因子CXCL12的特异性受体,其在体内广泛存在,如淋巴细胞、内皮细胞等。最新研究发现,很多恶性肿瘤细胞表面都可以检测到高表达的CXCR4受体,如乳腺癌,直肠癌,胃癌等。恶性肿瘤细胞能够高表达趋化因子受体,同时体内的某些器官能够表达其相关配体,高表达CXCR4受体的肿瘤细胞能够在CXCL12的趋化作用下,出现器官特异性转移。CXCL12/CXCR4生物学轴已被证明与多种恶性肿瘤的增殖,侵袭及转移密切相关。故通过研究CXCL12/CXCR4生物学轴与恶性肿瘤生物学行为的相互关系,为肿瘤的治疗提供新的思路和方法。 目的： 为了研究探讨CXCL12/CXCR4生物学轴对舌部鳞状细胞癌生物学行为的影响,本实验旨在通过应用一定浓度的趋化因子CXCL12及CXCR4受体的抑制剂AMD3100,以体外培养的舌鳞癌细胞为研究对象,检测舌鳞癌细胞CXCR4受体的表达情况,同时观察研究CXCL12/CXCR4生物学轴对舌鳞癌细胞增殖,侵袭转移的影响,为舌鳞癌的侵袭转移研究提供部分理论基础。 材料与方方法： 1.细胞株：舌鳞癌细胞Tca8113购自中国科学院上海生命科学研究院 2.主要材料：培养基RPMI-1640,胎牛血清（杭州四季青公司）,CCK-8试剂（Sigma）, DMSO（二甲亚砜）,CXCL12因子（博奥森）,AMD3100, CXCR4抗体（博奥森）,RNA提取试剂TRIzol（美国Invitrogen公司）,Taq DNA聚合酶（Transgene）, Matrigel（美国BD公司）,Transwell小室及配套孔板（costar公司）等。 3.方法： （1）舌鳞癌Tca8113细胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液（含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）,于37℃、5%CO2的饱和湿度孵箱中培养,每2-3天换液一次,0.25%的胰蛋白酶消化传代 （2）制作细胞爬片,通过SP法细胞免疫组化检测Tca8113细胞表面CXCR4受体的表达 （3）应用CCK-8方法检测CXCL12/CXCR4生物学轴对舌鳞癌细胞Tca8113增殖的影响及抑制剂AMD3100对其增殖行为的干预。 （4）应用PCR,检测一定浓度的CXCL12及其特异性受体AMD3100对舌鳞癌Tca8113细胞CXCR4受体mRNA表达量的影响。 （5）体外应用铺有Matrigel的Transwell小室,研究CXCL12/CXCR4生物学轴对舌鳞癌细胞Tca8113侵袭转移的影响及抑制剂AMD3100对其的干预。 结果： 1.体外培养的舌鳞癌细胞Tca8113,生长规律,状态良好,生长曲线近似S形。一般在细胞生长至第2-3天时进入对数生长期,在镜下,细胞排列紧密,形态不一,此期可行传代或者进行实验研究;1周左右细胞的增殖及分裂能力开始下降,形态出现变化,凋亡细胞数目增多。 2.免疫组化结果示：CXCR4受体在4组中均出现阳性表达,其中CXCL12因子刺激组表达量最高,AMD3100预先孵育组CXCR4受体表达量最少,其他两组差别不明显,CXCR4受体主要在胞膜上表达,胞浆及核仁表达量较少。 3.通过应用RT-PCR,基因水平检测CXCR4受体mRNA发现,四组均表达CXCR4受体]mRNA, CXCL12因子刺激组最高,抑制剂AMD3100预先干预组表达量最低,其他两组差别不明显,表达结果同免疫细胞化学结果基本吻合。 4.通过CCK-8试剂盒检测CXCL12/CXCR4生物学轴对舌部鳞状细胞癌增殖行为的影响,低浓度的CXCL12因子对Tca8113细胞的增殖作用不明显,100ng/ml浓度的CXCL12因子能明显促进肿瘤细胞的增殖,且对Tca8113细胞的增殖作用随着作用时间的延长,促增值效应越明显。在相同的时间点,100ng/ml浓度的CXCL12因子刺激组OD值最高,1μg/mlAMD3100预先孵育各趋化因子组,可不同程度的抑制CXCL12因

关键词： 重组人釉原蛋白   猪釉基质蛋白   牙周膜   牙周组织再生   成纤维细胞   细胞生物学  

摘要： 目的：比较重组25KDa全长人釉原蛋白（rhAm）和提取的猪釉基质蛋白（EMPs）对人牙周膜成纤维细胞（HPDLF）和人包皮成纤维细胞（HFF）生物学特性的影响，初步探讨rhAm促进牙周组织再生的作用和可能机制，探索rhAm临床应用的可行性。<br>　　意义：采用两种蛋白作为刺激因素，观察成纤维细胞在不同条件下的生物学特性变化，了解rhAm和EMPs对目标细胞影响的差异，以期对细胞工程学和口腔药理学的基础研究提供理论数据。同时对rhAm促进牙周组织再生的机制做初步探讨，为rhAm应用于临床牙周组织再生治疗的可行性提供实验数据。<br>　　方法：选择BL21/pET28a-His-SUMO-rhAm表达系统，在适宜的条件下经诱导表达和酶切纯化得到25KDa全长rhAm，并采用SDS-PAGE和Western blot鉴定；乙酸法提纯EMPs。体外培养HPDLF和HFF。用不同浓度的rhAm和EMPs分别刺激HPDLF、HFF，观察并比较两种蛋白对细胞粘附、增殖和迁移能力的影响。<br>　　结果：<br>　　1、利用His-SUMO融合表达系统，经诱导表达和酶切纯化得到重组25KDa全长人釉原蛋白（rhAm）。通过乙酸法得到猪釉基质蛋白（EMPs）。<br>　　2、原代培养获得性状稳定的第3-6代人牙周膜成纤维细胞，经鉴定证实为外胚间充质来源的成纤维细胞；培养得到性状稳定的人包皮成纤维细胞株。<br>　　3、rhAm和EMPs均能明显促进人牙周膜成纤维细胞的黏附、增殖和迁移（p<0.01），两种蛋白之间作用无明显差异(p>0.05)。<br>　　4、rhAm和EMPs均能明显促进人包皮成纤维细胞株的黏附、增殖和迁移（p<0.01），两种蛋白之间作用无明显差异(p>0.05)。<br>　　结论：25KDa rhAm和EMPs对成纤维细胞具有相似的生物学作用。rhAm和EMPs可通过增强相关成纤维细胞的生物学活性，从而促进牙周及相关组织的再生和愈合。

关键词： 乙型肝炎   淋巴细胞   转氨酶水平   细胞生物学  

摘要： 目的：全世界有3.5亿的慢性乙型病毒性肝炎(乙肝)患者，我国约有1.2亿。慢性乙肝是由乙型肝炎病毒(HBV)感染而致病的，属于炎症性疾病。发病时，机体内骨髓、肝脏、脾脏和淋巴结中的巨噬细胞增多，淋巴组织中的B淋巴细胞和T淋巴细胞增殖分化，这些免疫细胞释放细胞因子和趋化因子，在抗病毒的同时造成局部长期的炎症反应，因此炎症性的免疫细胞和细胞因子在乙型肝炎的发生发展过程中发挥着重要的作用。Notch信号与细胞的命运决定和免疫系统的发育有密切关系。最近大量的研究表明：在对病毒等病原微生物的应答过程中，Notch信号对巨噬细胞、树突状细胞、T和B淋巴细胞等外周免疫细胞的激活和分化方向起着关键的调节作用。本研究旨在考察Notch信号分子及一些细胞因子和趋化因子在慢性乙型肝炎患者外周血中的表达情况。<br>　　方法：⑴收集2010年11月-2012年1月之间在河北省衡水市哈励逊国际和平医院、衡水市传染病医院就诊的慢性乙型肝炎患者30例，根据转氨酶的高低，将实验组分为转氨酶大于100U/ml组和转氨酶40-100U/ml组，另外收集健康人30例为正常对照组。⑵采集两组实验组和正常对照组的新鲜空腹抗凝血，分离单个核细胞，提取RNA，反转录为cDNA，应用实时定量RT-PCR技术检测Notch1、Notch2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10、IL-17、IL-17F、Hes-1、RANTES、DIL-4、MIP-3和Jagged-1。收集实验组和正常对照组的血清，应用放免的方法测定IL-4，IL-6和IL-8。<br>　　结果：①Notch1、Notch.2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10、IL-17、IL-17F、Hes-1、RANTES、DIL-4、Jagged-1、IL-4、IL-6和IL-8两组实验组和正常对照组相比较，测定水平均明显升高，具有显著性差异，P<0.05。其中，转氨酶大于100U/ml的实验组中的各分子表达水平升高更明显，其中IL-10的表达量为正常对照组的13269倍，Notch1、IL-17F和RANTES三项的表达水平分别为正常对照组的3121倍、1394倍和1065倍。两组实验组相比较，转氨酶大于100U/ml组比转氨酶40-100U/ml组各指标的测定水平明显升高，具有显著性差异(P<0.05)。转氨酶大于100U/ml组Jagged-1的mRNA的表达量为转氨酶40-100U/ml组的16.24倍，差异最大。②两组实验组和正常对照组相比较，测定水平没有显著性差异，P>0.05。两组实验组相比较，测定水平没有显著性差异，P>0.05。<br>　　结论：慢性乙肝患者的Notch1和Notch2两种受体，DIL-4和Jagged-1两种配体，Notch靶基因Hes-1，Th1型细胞因子IFN-γ，Th2型细胞因子IL4和IL-10，Th17型细胞因子IL-17和IL-17F，抗病毒的细胞因子IFN-α和IFN-β，趋化因子RANTES以及促炎症细胞因子IL-6均比健康人显著升高。并且转氨酶越高，表达水平越高.这些结果提示：Notch信号可能在乙肝的发展过程中扮演着重要的角色。

关键词： 中国科学院院士   生物化学   细胞生物学   中科院院士   基础医学   中国科学院上海生物化学研究所   李林  

摘要： 2011年中科院院士增选结果12月9日揭晓,51名科学家新当选为中科院院士,中国蛋白质专业委员会委员、上海生物化学与细胞生物学研究所李林研究员当选。李林,1961年生,1983年毕业于南京大学生物系,1989年在中国科学院上海生物化学研究所获博士

关键词： 微流控芯片   细胞生物学   细胞迁移   水流动力学   免疫酶联分析   微环境控制  

摘要： 微流控芯片技术是一种用来处理和控制微量液体的科学技术系统,它可以集成管道、微阀、混合器、泵等多种多功能元器件从而实现芯片上的样品进样、预处理、传输、检测等多种功能,从而实现对多种生物实验的微尺度检测。微流控芯片系统减少了样品和试剂的消耗、缩短了实验反应时间、准确性高、携带方便且能够实现原位实时检测。经过多年的科研发展,微流控芯片技术已经成为目前比较前沿的新兴交叉科研领域,其独特优势使其能够以独特的方法解决很多目前大尺度生物实验难以实现的问题,从而为生物学研究提供极大的便利。本文在前人工作的基础上,开发了多款用于研究单细胞长期培养、肿瘤细胞一内皮细胞共培养、细胞迁移、水流动力学对内皮细胞力刺激的影响、免疫酶联反应等领域的集成微流控芯片,这些芯片设计构思新颖,从根本上解决了所研究领域目前存在的科研问题,主要内容如下:　　1.用于研究单细胞长期培养的集成微流控芯片　　在本章中我们设计并制备了一种集成微流控芯片用于长期培养单细胞,通过集成在芯片装置上的压力阀可以精确地控制单细胞定位到不同的培养小室中进行分隔培养,避免了细胞之间直接接触的相互作用。通过优化培养液的换液频率及引入条件培养基等培养方法,实现单细胞在微流控芯片上长达四天的正常培养。我们将数百个细胞培养在芯片上的一个独立培养小室中,并将其生成的条件培养基持续提供给与之连通的单细胞培养小室中的单个细胞,这种方法明显地改善了单细胞的生长状态,产生了一个更合适于原位监测单细胞独立生长的微环境。这种可长期培养单细胞的微流控芯片能够扩展到更高的通量水平,用于进一步满足药物筛选及干细胞培养等领域的需求。　　2.用于定量研究肿瘤细胞一内皮细胞共培养过程中动态相互作用的集成微流控共培养芯片　　在本章中我们制备了一款微流控芯片对人宫颈癌细胞(Hela)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养过程中的相互作用进行单细胞水平的定量化的动态研究,以探索这种相互作用在肿瘤转移和血管生成过程中的功能。通过定量化分析自动化成像系统拍摄到的每个培养小室的时间序列相差图片,我们观察到在共培养过程中HUVEC细胞伴随Hela细胞接近出现了撤退行为,这精确验证了共培养体系中两种细胞通过可溶性细胞因子存在着相互作用,通过改变细胞培养过程中的培养液更换频率,进一步证实了这种旁分泌机制的存在。这种微流控芯片技术高度可控,避免了对细胞的污染,全自动化而且成本较为低廉,对细胞一细胞之间的相互作用进行了定量化的动态研究,并对细胞培养的微环境在时间空间上进行精确调控。　　3.集成微流控芯片装置应用于高通量细胞迁移的研究　　在本章中我们设计并制备了一款微流控芯片,能够精确地生成均一的“伤痕”区域来研究细胞迁移的运动能力,确保细胞在微环境中的迁移行为有较好的平行性。通过分析实时拍摄的细胞迁移过程中的相差显微图像,在几个小时内就能得到一个简单的参数定量描述细胞迁移的速度,而如此短的实验时间也减少了细胞迁移过程中细胞增殖行为对其的影响。通过结合自动化图像分析平台和基于模型的数值模拟结果,我们动态准确可靠地测量了原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在各种条件下的细胞迁移,检验了基因HDAC7和其他基因的沉默对内皮细胞的影响,验证了这种方法在细胞生物物理学领域及高通量筛选中的应用。　　4.集成微流控芯片装置应用于水流动力学对内皮细胞基因表达调控的研究　　动脉粥样硬化是造成心血管疾病的主要诱因,主要发生在血管的分叉和弯曲的位点,这些区域的液体流动比较混乱。目前已经研发了若干种装置用于研究水流动力学中力刺激对内皮细胞的影响,以模拟人血管内血液流动对细胞的作用,但是它们需要消耗大量细胞和试剂,实验花费较高。在前人工作的基础上,我们制备了一种集成微流控芯片用于研究剪切力对内皮细胞的作用,该芯片集成了芯片上的蠕动泵以实现培养液在封闭管道内循环的持续流动。对受剪切力刺激的细胞样品进行实时定量PCR及高通量测序的检测,我们找到若干待研究的与剪切力相关的基因、可变剪切、非编码长链RNA等未被报道的生物学相关结果,我们认为这些结果能够帮助人们更清楚地理解动脉粥样硬化的发生。　　5.集成微流控芯片装置应用于高通量免疫酶联反应的研究　　酶联免疫吸附反应(ELISA)是一种用于研究生化分析和诊断检测的重要技术,传统的免疫酶联吸附反应多在孔板上完成,试剂消耗量大且花费时间长。虽然许多基于微流控芯片的检测技术被研发来检测免疫酶联反应,但是生成一种集成的微流控芯片来快速、精确、高效、低背景地检验ELISA反应仍旧是一个迫切需求。我们在前人工作的基础上设计并制备了一种集成微流控免疫分析芯片来实现芯片上的高通量三明治夹心法免疫酶联检测。这款芯片通过集成力学纽扣阀到芯片上生成了若干图案化反应位点,只需要1μL的反应溶液即可在一个小时内完成整个ELISA检测,检测极限可以达到10

ISBN: (纸本)9787564505523

关键词： 分子细胞生物学   IFCC   生化  

摘要： 详情请登录中国生物化学与分子生物学会网站http://***/或者是登录培训班网站:http://***/ifcc2012/查询,或者直接联系我们:联系人:宋娟孙

关键词： 降钙素基因相关肽   单核苷酸多态性   重组腺病毒   人牙周膜成纤维细胞   细胞增殖   成骨分化  

摘要： 牙周炎是侵犯牙龈和牙周支持组织的慢性炎症性的破坏性疾病，它是引起牙齿缺失的主要原因之一。以前认为牙周炎的发病与进展主要受细菌及其他环境因素的影响与调节。最近，有充足的证据表明基因在该病的发病和进展中起着重要的作用。 我们的前期研究发现：降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide, CGRP）阳性神经纤维广泛存在于牙周组织中，尤其是牙周炎的起始部位;牙周炎时，牙周组织中的CGRP阳性神经纤维显著增多，并向周围间质释放;一定浓度的CGRP可促进体外培养的牙周膜成纤维细胞的增殖。 另外国外有研究报道CGRP基因存在四个多态性位点，并且发现与帕金森氏病和精神病的发病有关。在以前一系列的研究中发现：CGRP+5247位点存在等位基因杂合子多态性现象;CGRP+5247位点单核苷酸多态性与广东人成人重度牙周炎有相关性。虽然目前对CGRP与牙周炎发生关系的研究很多，但是研究CGRP基因多态性对人牙周膜成纤维细胞生物学特性的影响仍需实验验证。 本研究通过构建CGRP基因多态性重组腺病毒，转染人牙周膜成纤维细胞，进一步检测了CGRP多态性基因对人牙周膜成纤维细胞生物学特性的影响，为进一步研究CGRP基因与牙周炎的关系提供了细胞学基础。 第一部分：人牙周膜成纤维细胞的原代培养及检测 目的：取材培养人牙周膜成纤维细胞并检测其组织胚胎学来源 方法：离体牙取自长海医院门诊口腔科因正畸而拔出的双尖牙，年龄12-26岁，所选牙齿无龋坏、根尖周疾病及牙周炎。采用酶消化+组织贴附的方法进行人牙周膜成纤维细胞原代培养，在原代细胞生长达到一定数量后，局部消化传代培养。对第4代细胞进行人牙周膜成纤维细胞的形态学观察和免疫组织化学鉴定（采用sABC法，进行波形丝蛋白和细胞角蛋白染色）。 结果：原代培养出人牙周膜成纤维细胞，免疫荧光鉴定波形丝蛋白染色显示阳性，细胞角蛋白染色显示阴性。 结论：成功原代培养出中胚层来源的人牙周膜成纤维细胞。 第二部分:构建降钙素基因相关肽（CGRP）5247单核苷酸多态性(A/C)的重组腺病毒，转染人牙周膜成纤维细胞并测定细胞内CGRP基因及表达蛋白的变化 目的：制备与鉴定携带CGRP-A和CGRP-C的重组腺病毒并将CGRP-A,CGRP-C基因转染入人牙周膜成纤维细胞 方法：以计算机软件辅助设计引物扩增CGRP-A开放阅读框序列，通过重叠PCR点突变活动CGRP-C开放阅读框序列;分别将CGRP-A和CGRP-C插入pShuttle中构建腺病毒穿梭质粒pShuttle-CGRP-A及pShuttle-CGRP-C，经酶切线性化后采用电穿孔法将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1一起转化到BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中，挑选同源重组质粒，酶切线性化后利用脂质体法将其转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒，观察细胞病变效应（CPE）现象，收集细胞反复冻融、裂解，获得高滴度重组腺病毒，通过酶切分析及PCR分析，鉴定重组腺病毒是否含有插入的目的序列。Ad-CGRP-A,Ad-CGRP-C重组腺病毒以及对照组Ad-EGFP分别转染处于对数生长期的人牙周膜成纤维细胞中，72小时后抽RNA，反转录为cDNA，用定量PCR和Westen-blot等方法测定细胞内CGRP基因及表达蛋白的变化。 结果：DNA序列测定结果证实重组质粒载体pShuttle-CGRP-A及pShuttle-CGRP-C构建正确，插入序列位置正确。PCR及酶切鉴定结果，重组腺病毒含有目的插入序列。定量PCR结果显示转染了CGRP-A,CGRP-C基因的人牙周膜成纤维细胞组，CGRP基因含量明显高于对照组。测序显示两实验组细胞内确实含有CGRP-A与CGRP-C基因序列。 结论：成功构建Ad-CGRP-A,Ad-CGRP-C重组腺病毒载体，并成功将CGRP-A,CGRP-C基因转染入人牙周膜成纤维细胞中。 第三部分：检测转染了CGRP-A,CGRP-C基因的人牙周膜成纤维细胞的胶原mRNA与胶原蛋白的表达，细胞增殖能力以及细胞成骨分化 目的：研究CGRP-A,CGRP-C基因多态性对人牙周膜成纤维细胞生物学特性的影响。 方法：实验细胞与对照细胞抽提RNA，反转录cDNA后，用定量PCR和Westen-blot测定细胞内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白mRNA含量和胶原蛋白表达;用流式细胞仪测定细胞周期，观察两基因对细胞增殖的影响;钙盐染色定性观察细胞成骨分化。 结果：显示，含有CGRP-A基因的细胞，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白mRNA含量及胶原蛋白的表达明显高于对照组，含有CGRP-C基因的细胞Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白mRNA含量则表达上明显低于对照组;细胞周期测定结果显示，含有CGRP-C基因的细胞增殖能力明显弱于对照组和CGRP-A实验组;钙盐染色可于含有

关键词： 细胞生物学   实验教学   教学改革  

摘要： 实验教学是理论课程教学的重要组成部分,其目的是培养学生掌握先进的实验技能,具备良好的科学研究素养、先进的思维方式和解决科学问题的创新能力。为了达到新世纪高素质创新型人才培养的目标,针对目前实验教学的现状和存在的问题,从优化实验教学体系、丰富实验教学方法、完善综合考核方式和建立多种形式的信息反馈等4个方面探索了综合性教学改革的具体措施。这些改革措施有效地激发了学生求知的欲望,充分调动了学生学习的潜能,培养了学生自主创新的能力,提高了实验教学的质量。