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关键词： Grwd1基因   造血细胞   生物学功能   分子机制  

摘要： 目的:　　Grwd1 ( Glutamate Rich WD Repeat Containing 1) 与多种疾病的不良预后以及生存期相关，在实体瘤中该基因已经被证实为一种新的癌基因，其作用机制与调控p53通路以及参与DNA复制装载有着密切联系。目前在血液系统疾病相关模型中也发现该基因的异常表达，但其发挥的功能以及具体机制尚不十分明确。本研究通过在小鼠骨髓细胞系32D以及c-Kit等细胞中构建Grwd1表达异常的模型，探究Grwd1对造血细胞的生物学功能影响以及其相关机制。　　方法:　　在小鼠骨髓细胞系32D、c-Kit细胞以及伴有髓系肿瘤相关基因异常的32D,通过慢病毒转染的方法建立Grwd1低表达的细胞模型。检测不同细胞中，Grwd1降低后对细胞增殖能力、细胞周期、细胞凋亡以及集落形成能力等细胞功能的影响。进一步利用蛋白印迹实验以及实时荧光定量PCR初步验证Grwd1的调控机制，明确该基因对DNA损伤刺激的敏感性变化。　　结果:　　成功构建了 Grwd1敲降的32D以及Asxl1-/- 32D细胞系。细胞功能学实验证实，Grwd1的敲降导致32D细胞出现周期阻滞，G0-G1期细胞比例增加、集落形成能力减弱等现象;小鼠原代细胞中敲降Grwd1可出现髓系偏向分化的现象;Asxl1-/-32D则表现出抑制增殖、恶性造血增加、DNA损伤敏感性增高的现象。机制探究发现，Grwd1的敲降导致生存压力刺激下P53蛋白的含量增加，p53通路下游基因表达增加。　　结论:　　Grwd1的敲降影响32D细胞生物学功能，但不影响细胞的存活。而Grwd1的敲降可加重Asxl1缺失的32D细胞的核异常现象，显著减慢其增殖速率及集落形成能力，并导致小鼠原代c-Kit细胞出现髓系偏向分化的情况。这些现象主要是因为Grwd1的低表达可以影响P53蛋白的稳定性，从而增加P53蛋白的含量并激活p53下游信号通路基因的表达。

关键词： 结直肠癌   miR-22-3p   细胞增殖   细胞迁移   细胞侵袭  

摘要： 目的构建miR-22-3p抑制表达的SW620细胞模型,检测对结直肠癌SW620细胞增殖、迁移、侵袭的影响,探究miR-22-3p在结肠癌中的潜在生物学作用,并利用miR-22-3p靶基因构建结肠癌患者预后模型。方法从TCGA数据库中下载数据分析miR-22-3p在结肠癌组织和正常组织中的差异表达情况;根据miR-22-3p表达的中位数将原发性结肠癌组织样本分为高低两个表达组并进行Kaplan-Meier生存分析从而证实miR-22-3p的生存预后价值;寻找miR-22-3p作用的靶基因并进行功能富集分析;用单因素cox回归、lasso回归、多因素cox回归从靶基因中筛出合适的预测因子构建结肠癌预后模型;运用Lip 2000将miR-22-3p inhibitor转入SW620细胞中构建抑制表达模型,运用q RT-PCR实验检测miR-22-3p的表达量,验证抑制表达细胞模型是否构建成功;CCK-8法检测抑制miR-22-3p表达后,细胞增殖能力的变化。划痕实验检测抑制miR-22-3p表达后,细胞迁移运动能力的变化。Transwell侵袭实验检测抑制miR-22-3p表达后,细胞侵袭能力的变化。结果1通过对TCGA数据库中下载结肠癌miR-22-3p转录组数据分析,发现miR-22-3p在结肠癌组织中的表达显著高于正常组织（P<0.05）,并且miR-22-3p的表达量与结肠癌T分期有关（P<0.05）。2通过对miR-22-3p进行生存分析发现高表达组的总生存期明显低于低表达组的总生存期,并具有统计学意义（P<0.05）。3筛选出共同的靶基因535个,在细胞组分富集结果中,主要富集在“转录抑制复合物”,“突触后密度”,“PML体”,“不对称突触”,“神经元间突触”等细胞组分;在分子功能富集结果中,主要富集在“DNA结合转录因子结合”、“肽N-乙酰转移酶活性”、“组蛋白乙酰转移酶活性”、“N-乙酰转移酶活性”等分子功能;在KEGG通路富集结果中,主要富集在“MAPK信号通路”、“癌症中蛋白聚糖”、“调节干细胞多能性的信号通路”、“乳腺癌”、“Fox O信号通路”等通路中。4成功利用miR-22-3p靶基因构建结肠癌预后模型:风险得分=(-0.619311395256288×Exp)+(0.249622373540642×Exp)+(0.58648170943636×Exp)+(0.170301630542932×Exp)+(0.55676004331761×Exp)+(0.630090304280584×Exp)。并且训练组和测试组的ROC曲线下面积均大于0.7,证明了模型的有效性。5实时荧光定量PCR实验测定miR-22-3p的表达量,转染组相较于对照组和空白对照组相比,miR-22-3p的表达量明显减少,差异具有统计学意义,抑制表达miR-22-3p的细胞模型构建成功。6抑制表达miR-22-3p组实验中,转染miR-22-3p inhibitor的转染组SW620细胞的增殖、迁移、侵袭能力较对照组和空白对照组明显减弱。结论1生信结果揭示miR-22-3p在结肠癌组织和细胞中表达增高,表达量与结肠癌T分期相关,并且miR-22-3p高表达的患者生存期明显降低,成功利用miR-22-3p的靶基因构建结肠癌预后模型。2实验验证表明抑制miR-22-3p的表达抑制了结直肠癌SW620细胞的迁移、侵袭和增殖能力。图16幅;表4个;参121篇。

关键词： 间充质干细胞(MSCs)   Trolox   PGE-2   巨噬细胞   细胞衰老  

摘要： 目的:间充质干细胞(MSCs)在再生医学和临床治疗中具有广阔的应用前景。MSC治疗作用要归因于其强大的增殖、分化及免疫调节能力。但MSC在体外扩增传代培养的过程中,随着细胞代数的增加将不可避免的出现复制性衰老。MSCs衰老的同时也伴随着诸多变化的发生,如分化能力、增殖能力的降低,并且免疫调节能力随之减弱,这些变化在很大程度上限制了MSCs的应用。本研究以间充质干细胞PGE-2的分泌作为衡量指标,通过化合物库筛选获得了具有抗氧化特性化合物trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并吡喃-2-羧酸),系统探究了其对MSCs的衰老和免疫调节能力等生物学特性的影响及机制。方法:在该研究中,我们首先探究了低代次的脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的形态,检测了其分化特性。利用流式技术检测了其表面标志物(CD90、CD105、CD146、CD34、CD11b、CD45),以及ELISA检测了其细胞因子(PGE-2)的分泌能力。然后利用β-半乳糖苷酶染色、流式细胞术、酶联免疫吸附实验、q PCR等方法对比了低代次和高代次的MSCs的差别。为探明trolox对MSCs生物学特性的影响,我们在该研究中首先利用CCK-8增殖实验及ELISA检测PGE-2的分泌,以确定探求trolox处理MSCs的最适浓度。之后利用流式细胞学技术检测了trolox处理前后MSCs表面标记物的变化,并将trolox处理前后的MSCs与巨噬细胞进行transwel共培养,以探明trolox的处理对MSCs免疫调节能力将产生何种影响。此外,利用q PCR检测了trolox处理前后MSCs中衰老蛋白P16、P21的表达以及mi R-17-92簇的表达。为了探明trolox对MSCs发挥作用的机制,我们将mi R-17-92簇高标达质粒转入MSCs,使其高表达,以此对比高表达前后MSCs的衰老及免疫调节的变化。此外,A20蛋白为mi R-17-92簇的下游靶点,因此我们通过蛋白印迹实验验证了衰老前后的MSCs、trolox处理前后的MSCs以及高表达mi R-17-92簇前后的MSCs中A20蛋白的表达情况。另外,由于MSCs体外培养过程中易衰老可能与氧化应激相关,并且trolox作为一种抗氧化性物质,因此在本研究中我们利用比色法对比了trolox处理前后细胞中最具代表性的抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性以及检测了抗氧化家族prdx的表达变化。结果:光镜下可观测到,年轻的MSCs贴壁旋涡状生长,形态细小狭长,并且具有良好的成骨成脂分化能力。流式结果显示MSCs细胞表面标志物CD90、CD105、CD73呈阳性,CD34、CD11b、CD45呈阴性,符合UC-MSC表面标志物的标准,并且年轻的UC-MSC具有良好的PGE-2分泌能力。UC-MSC高代次后,相较于低代次的MSCs而言,其β-半乳糖苷酶阳性染色率更高,并且停留于G0/G1期的MSCs比例上升。此外,UC-MSC高代次后成骨成脂成软骨三系分化能力下调,以及重要的免疫调节因子PGE-2的分泌能力下降。Trolox处理间充质干细胞24h和48h时,trolox的最佳浓度分别为0.25μM(P<0.0001)和2.0μM(P<0.0001)。增殖实验结果显示,trolox浓度超过5μM(P<0.01)能促进MSCs的增殖。此外,trolox处理前后MSCs的表面标记物未发生变化,仍表现为CD45、CD34阴性,CD73、CD90、CD105阳性。Trolox处理组中,间充质干细胞β-半乳糖苷酶染色阳性的细胞更少以及衰老相关蛋白P16的表达下调,并且,经trolox处理后,MSCs的增殖能力以及PGE-2的分泌能力能维持更多代数。此外,将经trolox处理的MSCs与巨噬细胞共培养,促进了巨噬细胞向M2(抗炎型)型巨噬细胞极化以及抑制了其吞噬能力。在trolox处理后,MSCs中的mi R-17-92簇的表达上调以及下游靶点A20的表达下调。在使间充质干细胞高表达mi R-17-92簇后,β-半乳糖苷酶阳性染色细胞及A20的表达下调,并且与巨噬细胞共培养后,更多的巨噬细胞向M2型极化,并且也表现为吞噬能力的下降。另外,比色法实验结果表明,trolox处理后,MSCs的抗氧化酶CAT、SOD、GSH-PX的活性以及prdx5、prdx6、gpx4基因的表达上调。结论:综上所述,本研究证明,trolox通过抗氧化途径和mi R-17-92簇-A20通路来延缓了体外培养过程中出现的MSCs的衰老,进而有利于MSCs的增殖。此外,还改变了MSCs的免疫调节能力,包括:促进免疫调节因子PGE-2的分泌、促进巨噬细胞的M2型极化、以及降低巨噬细胞的吞噬能力。因此,抗

关键词： KIF21B   胃癌   临床意义   生物学功能  

摘要： 目的:驱动蛋白家族成员21B(Kinesin Family Member 21B,KIF21B)是微管马达蛋白,在细胞内发挥运送不同物质的功能,其对胃癌发生发展的影响目前尚不明确。通过临床人胃癌组织样本、生物信息学分析和体外实验等阐明KIF21B基因在胃癌中的表达水平、与胃癌患者临床病理特征和总体生存率的相关性以及对胃癌细胞生物学功能的影响,为寻找新的肿瘤治疗靶点及研发新型靶向药物提供理论基础。方法:利用TCGA-STAD数据和GEPIA在线库验证KIF21B在胃癌中的表达结果,Kaplan-Meier Plotter数据库分析KIF21B的表达与胃癌患者总体生存率(Overall survival,OS)的关系;收集2021年9月至2022年10月于甘肃省人民医院病理诊断为胃癌并行手术治疗的患者胃癌和癌旁组织标本共53对,其中43对制作组织芯片采用免疫组化法(Immunohistoc hemical,IHC)检测KIF21B基因蛋白表达情况,并结合患者的临床信息分析KIF21B的表达与临床病理特征的关系;采用反转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技术检测10对胃癌/癌旁组织,胃癌细胞系MKN45、MGC803、HGC27、AGS和正常胃细胞GES-1中KIF21B m RNA的表达水平;筛选出表达量较高的细胞系,使用Lipofe ctamine 3000转染试剂将si-KIF21B转染至KIF21B m RNA表达量较高的胃癌细胞系中,荧光显微镜下观察,并采用RT-PCR技术验证转染效率;WB实验检测AGS转染Si-KIF21B后KIF21B蛋白的表达水平;采用划痕实验、Transwell实验、CCK8实验及流式细胞技术分别检测成功转染Si-KIF21B后胃癌细胞迁移、侵袭、增殖及凋亡能力的变化;使用R语言分析TCGA-STAD数据中与KIF21B相关的差异表达基因,并进行功能富集分析;使用R语言分析KIF21B高低表达组中,免疫细胞表达水平的差异及KIF21B的表达水平与免疫细胞的相关性。结果:KIF21B蛋白在GC组织中的表达(34/43,79.07%)明显高于癌旁组织(13/43,30.23%)(P<0.01),且KIF21B高表达与肿瘤大小、病理分期有关(P<0.05);与癌旁组织相比,GC组织中KIF21B m RNA的表达水平明显升高,TCGA数据库和GEPIA数据库在线验证后得到了相同的结果(P<0.05);Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示高表达KIF21B的患者,总体生存时间明显缩短(P<0.05),ROC曲线下面积为0.848;与正常的人胃黏膜上皮细胞GES-1相比,KIF21B基因在MGC-803、AGS、HGC27和MKN-45四种胃癌细胞系中的m RNA表达量显著增加(P<0.05),其中胃癌细胞株AGS中最高,选取AGS细胞系用于后续转染实验。分别将Si-KIF21B-1、Si-KIF21B-2和Si-KIF21B-3转染至AGS细胞株后,发现转染Si-KIF21B-3的AGS细胞株中KIF21B蛋白和m RNA的表达水平最低,转染效率最高;成功转染si-KIF21B-3后,与对照组RNAi-Ctrl相比,胃癌细胞AGS的增殖、侵袭和迁移能力受到抑制,而凋亡能力受到促进。与KIF21B表达相关的差异表达基因共有321个,其中前10个差异表达基因分别为SERPINA9、CALCA、FCRL1、MIR4537、CD22、SPRR2E、VCX2、PNLIP、KRT5和KRTDAP;参与的生物过程(BP)包括B细胞受体信号通路、B细胞激活、免疫反应受体信号激活通路、淋巴细胞体液免疫反应激活的调节,参与构成的细胞成分(CC)包括免疫球蛋白复合物、质膜受体复合物、T细胞受体复合物、外侧质膜、循环免疫球蛋白复合物,参与的分子功能(MF)包括结合免疫球蛋白受体、结合抗原b、细胞因子受体活性、受体配体活性、嘌呤能核苷酸受体活性,KEGG包括细胞因子与其受体的相互作用、原发性免疫缺陷、造血细胞谱系、病毒蛋白与细胞因子受体的相互作用、趋化因子信号通路;KIF21B高低表达组中,多种免疫细胞的表达存在显著差异(P<0.05),且KIF21B的表达与Tem细胞、T细胞、B细胞、TFH细胞和Treg细胞呈显著正相关(P<0.05)。结论:KIF21B基因在GC组织的表达明显高于癌旁组织,且高表达的KIF21B与肿瘤大小、病理分期有关,并显示不良预后;沉默KIF21B基因使胃癌细胞凋亡能力增强,增殖、侵袭和迁移能力降低,KIF21B促进了胃癌的进展;KIF21B基因可能通过影响胃癌免疫细胞浸润进而影响胃癌的进展

关键词： 结直肠癌   BASP1基因   细胞生物学功能   早期诊断  

摘要： 【目的】　　脑酸性可溶性蛋白1(Brainacidsolubleprotein1，BASP1)是一种神经生长相关蛋白，主要通过对细胞骨架相关蛋白的影响，调节其生物学功能，从而促进神经细胞轴突生长发育。在已发表的文献中显示BASP1参与多个系统肿瘤的发生与发展，且与临床预后相关，而在结直肠癌（CRC）中尚无相关研究。本研究拟通过实验验证BASP1基因在CRC组织中的表达情况，并研究BASP1基因对CRC细胞生物学功能的影响，评估BASP1是否可以作为CRC患者的独立危险因素，以期为CRC的早期发现、疾病诊治等方面提供新的思路。　　【方法】　　1.收集内镜及手术中CRC患者、大肠腺瘤患者以及正常人大肠粘膜组织共166例，使用荧光定量PCR实验技术手段检测BASP1mRNA的表达情况，用GraphpadPrism统计软件统计并分析BASP1mRNA的表达水平。收集临床病理资料，分析BASP1与CRC患者各类临床指标之间的关系。　　2.将BASP1过表达质粒（pcDNA3.1-BASP1）及空载质粒（pcDNA3.1）分别转染至人HCT116细胞株中。分别采用CCK-8法、流式细胞术方法、Transwell小室法分别检测细胞增殖情况、细胞凋亡能力、细胞周期阻滞情况及细胞迁移能力。　　【结果】　　1.各组中BASP1mRNA表达情况及与临床病理指标关系　　结果显示：CRC组分别与CRC癌旁组、大肠腺瘤组及正常对照组相比较，CRC组的BASP1mRNA的表达显著下调，且与各组相比较均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05）;正常对照组、CRC癌旁组、大肠腺瘤组三组间两两比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。　　收集所有CRC患者临床病理资料，应用Fisher检验分析。结果显示：BASP1mRNA的表达量在肿瘤大小有统计学意义（P＜0.05），但在不同的年龄、性别、分化程度、分期、是否有淋巴结及远处转移等方面，差异均无统计学意义（P＞0.05）。　　***1对CRC细胞增殖、凋亡、周期和迁移的影响　　将BASP1过表达质粒（pcDNA3.1-BASP1）及空载质粒（pcDNA3.1）分别转染至HCT116细胞中，结果显示：pcDNA3.1-BASP1转染组的细胞增殖率显著降低(P＜0.001)，细胞周期被明显阻滞于G0/G1期（P＜0.01），细胞凋亡率显著升高（P＜0.0001），细胞迁移显著减少（P＜0.0001），以上试验差异均有显著统计学意义。　　【结论】　　***1在CRC组织中表达显著下调，BASP1的表达与CRC患者的肿瘤大小相关。　　***1基因能抑制CRC细胞增殖和迁移，促进CRC细胞调亡，并使细胞周期明显阻滞于G0/G1期，提示BASP1可能发挥抑癌作用。

关键词： 盐酸青藤碱   胃癌   细胞增殖   细胞凋亡   细胞焦亡   泛凋亡  

摘要： 目的:胃癌是全球常见恶性肿瘤之一,已有研究发现盐酸青藤碱(sinomenine hydrochloride,SIN)能够抑制胃癌细胞增殖,多种程序性细胞死亡方式同时存在,对胃癌发生或发展的影响研究尚浅。本研究旨在进一步探讨SIN对人胃癌AGS细胞的生物学特性的影响,初步探索SIN对胃癌细胞是否同时存在多种细胞死亡,为胃癌药物治疗的研究提供新的思路和证据。方法:1.通过CCK-8法检测SIN对人胃癌AGS细胞活力的影响,并确定作用于人胃癌AGS细胞的半数抑制浓度(IC50),以确定后续实验的药物浓度。2.通过LDH释放实验明确SIN对人胃癌AGS细胞的损伤情况;采用划痕实验和Transwell侵袭实验验证SIN对人胃癌AGS细胞迁移和侵袭的影响;使用流式细胞术评价SIN对人胃癌AGS细胞周期的影响。3.利用流式细胞术和蛋白质免疫印迹实验(Western blot)分别检测凋亡细胞和细胞焦亡相关蛋白cleaved Caspase-1以及炎性因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-18(Interleukin-18,IL-18)的表达,基于细胞凋亡和细胞焦亡的相关检测观察SIN对胃癌细胞泛凋亡现象的影响,探讨SIN对胃癌细胞是否存在泛凋亡样细胞死亡。结果:***-8实验结果显示,SIN能够降低人胃癌AGS细胞的活性(P<0.001)。与对照组比较,SIN处理组具有活性的AGS细胞数量明显降低,CCK-8法检测了不同浓度SIN处理人胃癌AGS细胞48h后的细胞活力,通过计算得出药物的IC50值为0.4876mmol/L。***释放实验结果表明,随着SIN浓度升高,LDH释放量逐渐增加,当SIN浓度达到IC50时,差异有统计学意义(P<0.01);划痕实验和Transwell细胞侵袭实验结果显示,与对照组比较,SIN处理组人胃癌AGS细胞迁移的距离明显缩短(P<0.05或P<0.001),Transwell小室细胞数目减少(P<0.01或P<0.001),且具有浓度依赖性(P<0.05),表明SIN能够抑制AGS细胞的迁移和侵袭;流式细胞术结果显示,SIN处理组AGS细胞处于G1期的比率较对照组显著升高(P<0.01或P<0.001)。3.流式细胞仪测细胞凋亡结果显示,与对照组比较,SIN处理组凋亡细胞所占比例明显升高(P<0.001),且具有浓度依赖性(P<0.001);Western blot实验结果表明,随着SIN浓度升高,细胞焦亡相关蛋白cleaved Caspase-1的表达和炎性因子IL-1β和IL-18的表达逐渐降低(P<0.05或P<0.001)。结论:***能够抑制人胃癌AGS细胞增殖,其机制可能与诱导胃癌细胞凋亡和细胞G1期阻滞有关;***可以抑制人胃癌AGS细胞的侵袭和迁移,抑制效果随药物浓度升高而增强;***可能会诱导胃癌细胞产生泛凋亡现象,其中细胞凋亡现象随药物浓度升高而增强,细胞焦亡现象可能随药物浓度升高而减弱。

关键词： 转化生长因子-β1   牙龈卟啉单胞菌来源脂多糖   IL-35亚基   Foxp3   IL-6   EBI3  

摘要： 第一部分TGF-β1对炎症下人牙周膜成纤维细胞生物学性能及细胞因子表达影响目的:探讨转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)对牙龈卟啉单胞菌来源脂多糖(Lipopolysaccharide from Porphyromonas gingivalis,Pg-LPS)刺激下人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblast,hPDLFs)的生物学性能影响以及炎症细胞因子表达。方法:获取hPDLFs并进行免疫组化鉴定,qRT-PCR与CCK-8法确定Pg-LPS炎症刺激浓度,实验分成空白对照组以及1、10、100ng/mL低中高三组浓度的TGF-β1对Pg-LPS刺激下hPDLFs进行细胞学实验,CCK-8检测72小时细胞增殖情况;划痕实验与Transwell小室实验检测24小时hPDLFs细胞迁移能力;流式细胞术检测72小时hPDLFs的细胞周期;qRT-PCR 检测 72 小时 hPDLFs 的转录因子叉头盒p3(Forkhead/winged helix transcriptional factor p3,Foxp3)、白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)及 EB 病毒诱导基因 3(Epstein-Barrvirus-induced gene 3,EBI3)mRNA 表达;western blot 检测 72 小时 hPDLFs 的 Foxp3、IL-6 及 EBI3蛋白表达。结果:免疫组化鉴定显示抗波形丝蛋白阳性及抗角蛋白阴性;Pg-LPS浓度为100μg/mL时,hPDLFs中IL-6mRNA表达相比对照组上升(P<0.05)且细胞增殖能力下降(P<0.05);10ng/mL和100ng/mL TGF-β1时能提高细胞在100μg/mL Pg-LPS刺激下的增殖(P<0.05);TGF-β1能促进hPDLFs在100μg/mL Pg-LPS 刺激下的迁移能力(P<0.05);1、10、100ng/mL 的 TGF-β1可加快hPDLFs在100μg/mL Pg-LPS刺激下的细胞周期(P<0.05);1、10、100ng/mL TGF-β1 可抑制 IL-6 基因和蛋白表达量(P<0.05);1、10ng/mL TGF-β1可提高EBI3基因及蛋白表达量(P<0.05);1、10ng/mL TGF-β1可提高Foxp3基因表达量,10ng/mL TGF-β 1可提高Foxβ3蛋白表达量(P<0.05)。结论:TGF-β1可以促进炎症下hPDLFs的增殖及迁移能力,上调EBI3抑制炎症,此过程可能与Foxp3表达有关,揭示新的炎症调控机制。第二部分病例展示:牙周序列治疗的数字化应用目的:观察数字化辅助应用对牙周序列治疗的治疗效果方法:选择5例就诊于我院牙周病诊疗中心被诊断为Ⅲ期/Ⅳ期牙周炎患者。根据患者不同的牙周病变情况,应用牙周内窥镜进行牙周基础治疗。依据后牙区根分叉病变情况采用相应的手术进行治疗;根据前牙区松动度情况,采取数字化口腔扫描设计及3D打印牙周夹板进行固定。在患者的牙周治疗过程中,定期随访复查,记录患者治疗前后的口内照片、全口牙周探诊记录表以及根尖片来评估牙周治疗效果。结果:5例患者经过牙周内窥镜下的基础治疗后,相比就诊前牙周炎症明显好转,对牙周探诊深度在6mm以上的位点具有良好的治疗效果,可一定程度上避免牙周手术治疗,但后牙区根分叉病变Ⅲ度位点仍需手术治疗。前牙松动度在Ⅰ度患牙经过3D打印牙周夹板可有效固定,无不适感;松动度Ⅱ度以上且伴随牙周牙髓联合病变患牙通过意向性再植同期3D打印牙周夹板固定可有效保留松动前牙。结论:各类数字化应用于牙周序列治疗,可有效提高牙周治疗的疗效且减轻患者不适感,为更加有效的保留天然牙提供新的治疗方案。

关键词： 声动力疗法   卵巢癌   声诺维   活性氧   凋亡  

摘要： 卵巢癌（Ovarian cancer）是世界上第三大最常见也是最致命的妇科恶性肿瘤,由于其早期阶段无明显症状,大多数患者在被诊断时就处于晚期。药物耐受性、全身毒性以及肿瘤复发导致晚期卵巢癌患者的死亡率高达70%,总体5年生存率仅为48.8%。因此,探索新的卵巢癌治疗策略势在必行。声动力疗法（Sonodynamic Therapy,SDT）是一种以超声为基础,由光动力治疗（Photodynamic Therapy,PDT）发展而来的治疗方式,近年来得到越来越广泛的应用。与PDT类似,SDT目前较为认可治疗原理也是通过产生大量活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）激活相应癌细胞死亡通路杀死肿瘤。但与PDT不同的是,SDT依赖超声强大的穿透力（>10cm）和声敏剂的肿瘤特异性积累,是卵巢癌等深部肿瘤合适的替代疗法。本研究采用低强度超声治疗仪联合声诺维（Sono Vue,注射用六氟化硫微泡）产生大量活性氧,诱导卵巢癌细胞（卵巢癌SKOV3）发生细胞凋亡,并进一步探讨声动力疗法的抗肿瘤机制。首先采用CCK-8法筛选出卵巢癌SKOV3细胞的最适超声强度,最适辐照时间以及最佳药物浓度,通过Calcein（绿色,活细胞）/PI（红色,死细胞）双染检测细胞死亡情况;再利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况。确定声诺维的最佳药物浓度是12.5μg/ml,最适超声强度是0.75W/cm,最佳辐照时间为30s,在声诺维浓度是12.5μg/ml,声强为0.75W/cm辐照30s,可显著诱导人卵巢癌SKOV3细胞产生大量活性氧,诱导细胞发生发生凋亡。在研究SDT抗肿瘤机制方面,采用CCK-8法检测细胞活力,划痕实验及Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力;通过DCFH-DA探针检测细胞内ROS产生情况,Fluo-4AM探针检测细胞内钙离子含量以及Western Blot检测细胞凋亡的相关蛋白表达;通过透射电镜观察治疗后卵巢癌SKOV3细胞的超微结构改变。最后利用RNA测序（RNA sequencing,RNA-Seq）检测转录组的差异表达,然后利用GO和KEGG通路富集和分析与凋亡相关的靶基因和通路,在卵巢癌SKOV3细胞队列中寻找差异表达基因的表达。研究发现声动力疗法能够产生ROS,诱导卵巢癌SKOV3细胞内钙离子超载,进而发生钙超载诱导的细胞凋亡。如上所述,本研究证实声动力疗法能够诱导卵巢癌SKOV3细胞发生凋亡,有效抑制增殖迁移,抑制肿瘤生长,认为其主要的机制是声动力疗法联合声诺维产生大量ROS,诱导癌细胞发生钙离子相关凋亡途径,从而发挥抗肿瘤效应。

关键词： 糖尿病难愈合创面   高糖环境   人脂肪间充质干细胞   抗菌肽   LL-37   差异表达基因  

摘要： 目的:探讨LL-37对高糖环境下人脂肪间充质干细胞(h ADSCs)增殖、迁移、分化能力、凋亡的影响,筛选差异表达基因(DEG)并对其进行功能分析与实验复证,以期为提高人脂肪间充质干细胞的治疗效果提供一种新的研究方法。方法:(1)采用CCK8法检测不同浓度的LL-37对高糖环境下人脂肪间充质干细胞增殖的影响,确定实验浓度及作用时间。(2)划痕实验、成骨成脂分化相关基因检测、流式细胞术分别检测各组细胞经LL-37干预后细胞迁移、分化潜能和凋亡水平的变化;(3)运用高通量测序中RNA-seq技术分析筛选数据集中高糖环境下h ADSCs样本与高糖环境下经LL-37处理后h ADSCs样本之间的差异表达基因(DEG)。对筛选出的DEG分别进行生物学过程、分子功能、细胞组分的基因本体论(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析;根据基因组学分析中log2FC分数(相对表达量变化倍数的对数值)的大小对DEG进行排名,倾向于将高log2FC分数的基因视为关键基因。根据细胞的体外生物学行为及显著富集筛选,本研究将上调表达基因谱中log2FC分数排名前10的DEG视为关键基因,通过Gene Cards:The Human Gene Databases数据库及相关文献查找关键基因功能及所在通路,探讨在细胞生长发育方面密切相关的差异通路并加以实验验证。(4)实时荧光定量RT-q PCR检测各组中人即刻早期反应基因2(immediate early response 2,IER2)及细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)m RNA的表达;结果:(1)经CCK-8法检测确定LL-37能在适宜范围的浓度和时间下促进在高糖环境下人脂肪间充质干细胞的增殖,确定实验浓度为25μg/m L(P<0.001),确定作用时间为48小时(P<0.0001);(2)经LL-37干预后,h ADSCs在高糖环境下的迁移能力明显增加((P<0.001);细胞分化相关基因表达显著上调(P<0.05);细胞凋亡比例明显减少(P<0.001);(3)与单一生长在高糖环境下的h ADSCs相比较,我们在高糖环境下经LL-37干预后的h ADSCs中筛选出479个差异表达显著的DEG(校正P<0.05或校正P<0.01),包括230个上调DEG和249个下调DEG。GO术语分析显示,DEG在金属/离子结合、压力感应、细胞组分调控、生长发育过程/细胞增殖正向调控等方面显著富集(校正P值均<0.01);KEGG通路分析显示,DEG在细胞凋亡信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路和核转录因子kappa B(NF-κB)等方面显著富集(校正P值均<0.01);基因组学分析显示,LL-37处理显著增加IER2表达3.75倍。LL-37处理还增加了与免疫应答、信号转导、细胞周期、细胞趋化、细胞增殖和转录等多种功能相关的几个基因(包括MATR3,IER2,UTP14C,ORAI2等)的水平。(4)LL-37干预组中IER2及ERK的表达显著高于未干预组,且高糖环境可能会在一定程度上抑制IER2及ERK的表达(P<0.05)。结论:1.经LL-37干预h ADSCs,可增加其在高糖环境下的增殖、迁移、分化以及抗凋亡的能力。***-37可能通过IER2和MAPK/ERK途径促进h ADSCs的增殖、迁移、分化及抗凋亡能力。因此,LL-37可以调节并激活h ADSCs,并可能通过加强h ADSCs的功能(例如,增殖、迁移等作用),从而为提高h ADSCs的治疗效果提供了新方法。

关键词： ZWINT   增殖   转移   凋亡   EMT  

摘要： 目的:肝细胞癌(HCC)是病死率高、预后差的恶性肿瘤。本研究旨在通过数据库探究ZWINT在HCC中的表达水平,并通过一系列实验探究ZWINT对肝癌细胞各种生物学表型的影响,并初探其潜在的作用机制。方法:1.通过公共数据库查询ZWINT与HCC的关系;利用TIMER数据库和GEPIA数据库探讨ZWINT在HCC病人癌与癌旁组织中的表达情况;使用UALCAN数据库探究在HCC病人中,ZWINT与临床病理特征的关系;KM Plotter数据库分析了ZWINT与总体生存时间(OS)和无复发生存时间(DFS)之间的关系;TIMER数据库分析ZWINT的表达与免疫细胞浸润的相关性;Linked Omics数据库对ZWINT进行基因富集分析从而识别其功能及相关信号通路。2.随后在肝癌细胞系和正常肝细胞中验证ZWINT的表达,选取ZWINT相对高表达的肝癌细胞SUN-449,利用si-RNA进行敲减,分为对照组(Control)、阴性对照组(Si-NC)、ZWINT敲低组(Si-ZWINT);选择肝癌细胞中ZWINT表达相对较低的Huh-7,利用慢病毒进行过表达稳转株构建,分组为空载对照组(Vector)和过表达组(Oe-ZWINT)。Western Blot验证转染效率,在此基础上进行后续实验。用CCK-8实验、EDU实验分别检测各组肝癌细胞的增殖情况;用划痕实验、Transwell实验来探究各组肝癌细胞的转移情况;用流式细胞技术检测各组肝癌细胞的细胞周期和凋亡水平;用WB分析在改变ZWINT的表达量后,EMT过程中相关蛋白标志物的表达情况。3进行裸鼠皮下成瘤实验,在体内探究ZWINT对HCC增殖的影响。结果:1.公共数据库显示ZWINT在HCC中高表达;ZWINT在P53突变亚组分型中具有统计学意义;ZWINT高表达的病人具有较差的术后OS与DFS;ZWINT在HCC中与B细胞、CD4T细胞、CD8T细胞、中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞等免疫细胞的浸润程度相关;基因富集分析结果显示ZWINT在DNA复制、细胞分裂和细胞周期检查点等生物过程和信号通路中高度富集。2.体外实验中:CCK-8实验和EDU实验显示,Si-ZWINT组的增殖能力相较于Control组和Si-NC组减弱,而相对于Vector组,Oe-ZWINT组增殖能力有所提升(P<0.05);划痕实验和Transwell实验表明,Si-ZWINT组的转移能力明显弱于Control组和Si-NC组,而相对于Vector组,Oe-ZWINT组的细胞转移能力增强(P<0.05);通过流式细胞实验发现,Si-ZWINT组细胞凋亡率明显高于Control组和Si-NC组,而且被阻滞在G1期的细胞比例增加,而相对于Vector组,Oe-ZWINT组细胞凋亡率较低,而且细胞周期在G1期阻滞减少(P<0.05);WB结果表明,与Control和Si-NC组相比较,Si-ZWINT组E-cadherin表达量较高,而Vimentin和N-cadherin的表达量较低,相对于Vector组,Oe-ZWINT组E-cadherin的表达量较低,而Vimentin和N-cadherin的表达量较高(P<0.05)。3.裸鼠实验表明:与对照组比较,敲低组裸鼠瘤体的生长速度明显减慢(P<0.05),瘤体质量也明显较轻(P<0.05),提示敲低组移植瘤生长明显受到抑制。结论:***基因在HCC病人中为高表达,且与病人预后不良相关;***能够促进肝癌细胞增殖和转移并抑制细胞凋亡,且ZWINT可能通过促进肝癌细胞上皮间质转化而促进其进展;***可以促进肝癌细胞在裸鼠体内生长。