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关键词： 复发性流产   滋养细胞   白细胞介素-37   巨噬细胞极化  

摘要： 研究背景及目的：复发性流产（Recurrentmiscarriage,RM）是指在妊娠20周前，与同一配偶连续发生2次及2次以上自然流产的异常妊娠，常见于妊娠早期。除发病原因明确外，依然有约60%~70%的不明原因流产，被称之为不明原因复发性流产（Unexplainedrecurrentmiscarriage,URM）。由于病因不明，无法选用针对性强的特异性治疗，成为了临床复发性流产的诊治难点。因此，对复发性流产的病因及机制研究意义重大。　　母体和胎儿的相互作用对于维持母胎免疫耐受至关重要，母胎界面的细胞类型主要有滋养细胞、蜕膜基质细胞和蜕膜免疫细胞。蜕膜基质细胞和蜕膜免疫细胞来自于母体，而滋养细胞则来自于胎盘。在母胎界面中，孕早期蜕膜巨噬细胞占蜕膜总白细胞的20％~30%，是蜕膜免疫细胞中的一个重要组成部分，可参与胚胎植入、胎盘发育等生理过程，以维持妊娠的顺利进行。　　白细胞介素-37（Interleukin37,IL-37）是IL-1家族的一员，作为炎症和免疫反应的天然抑制剂发挥作用。它的结构与IL-1家族的其他成员相似，由十二个β管状结构组成。IL-37的分子量约为17~25kDa，被广泛地表达于人体各种组织，例如肺、胸腺、骨髓、胎盘以及子宫组织等。最近的研究表明，IL-37可影响多种肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。由于人类胎盘的侵袭过程和滋养层细胞的行为与恶性肿瘤细胞相似。同时，IL-37与免疫炎症性疾病的发生和发展密切相关。因此，我们推测：母胎界面表达的细胞因子IL-37是否也参与调控滋养细胞功能以及母胎免疫耐受的形成。本研究将探讨IL-37在母胎界面的表达模式及生物学意义。　　方法：（1）临床样本实验：收集RM患者和正常对照组妊娠早期的绒毛和蜕膜组织，通过qRT-PCR实验、免疫印迹实验（Westernblot,WB）、免疫组织化学技术（IHC）以及免疫荧光技术（IF）对IL-37及其受体SIGIRR在早孕期绒毛组织以及蜕膜组织中的表达及定位进行检测。此外，通过免疫荧光（IF）技术检测正常妊娠女性和RM患者蜕膜组织中巨噬细胞表达模式，并观察其与蜕膜绒毛外滋养细胞（Extravilloustrophoblast,EVT）的关系。　　（2）体外实验：运用IL-37重组蛋白处理HTR8/SVneo滋养细胞，并运用划痕实验和Transwell实验对滋养细胞的迁移能力和侵袭能力进行检测。WB实验检测滋养细胞凋亡相关蛋白以及EMT相关标志物的表达水平。EdU实验检测IL-37对滋养细胞增殖能力的影响。绒毛外植体实验进一步检测IL-37对滋养细胞功能的影响。此外，体外建立M1巨噬细胞模型，通过观察细胞形态以及qRT-PCR实验验证IL-37是否可以抑制M1巨噬细胞极化以及炎症效应。运用生物信息学方法分析RNA-seq的测序数据，寻找M1巨噬细胞极化过程中可能涉及的信号通路，并加以验证。同时，运用IL-37重组蛋白处理M1巨噬细胞，WB检测相关信号通路的改变。　　（3）体内实验：建立正常妊娠小鼠模型和复发性流产小鼠模型，收集外周血以及蜕膜组织，原代分离获取免疫细胞，运用流式细胞术分析正常妊娠小鼠和复发性流产小鼠外周血以及蜕膜组织中CD86+巨噬细胞（M1型）及CD206+巨噬细胞（M2型）的比例。将流产小鼠分为两组，一组给予10mL/kg无菌PBS腹腔注射处理，另一组以同样的方式给予10μg/kgIL-37重组蛋白处理。孕13.5天时，分别观察两组小鼠的胚胎吸收率，并收集两组小鼠的外周血以及蜕膜组织提取免疫细胞，利用流式细胞术分析两组小鼠M1及M2巨噬细胞的比例。　　结果：（1）与对照组相比，IL-37的分子及蛋白表达水平在RM组绒毛组织中均降低。且IL-37主要定位于合体滋养层细胞（Syncytiotrophoblast,STB）和细胞滋养层细胞（Cytotrophoblast,CTB）。在体外实验时，IL-37增强了HTR8/SVneo滋养细胞的侵袭和迁移能力，并促进绒毛外植体向外生长，但对HTR8/SVneo滋养细胞的增殖和凋亡没有影响。此外，IL-37可调节HTR8/SVneo滋养细胞的上皮-间质转化（Epithelial-to-mesenchymaltransition,EMT）过程。　　（2）与正常妊娠组相比，RM患者蜕膜组织中巨噬细胞增多，且在巨噬细胞周围有EVT细胞的富集。此外，IL-37在HLA-G阳性的EVT细胞亦有表达。M0巨噬细胞经LPS诱导处理后，细胞呈M1巨噬细胞形态特征，M1巨噬细胞标志物iNOS和巨噬细胞M1极化后释放的促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平显著上调。运用IL-37重组蛋白进行干预后，细胞形态呈M0样的圆形，M1巨噬细胞标志物iNOS和巨噬细胞M1极化后释放的促炎细胞因子T

关键词： 大鼠   牙周膜   牙槽窝   间充质干细胞   P75神经营养因子受体   生物学特性  

摘要： 目的:提取大鼠牙槽窝干细胞(dental socket derived stem cells,DSCs)和大鼠牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs),在体外探讨PDLSCs和DSCs的部分生物学特性的差异,以选择更优的种子细胞,为牙发育与牙周缺损再生修复打下基础。方法:(1)建立大鼠拔牙后的牙槽窝模型,苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色观察拔牙术后即刻与拔牙后第1、3、7天的牙槽窝组织形态,并用免疫组织化学法,检测在牙槽窝内P75神经营养因子受体(P75 Neurotrophin receptor,P75NTR)的表达与分布情况。(2)细胞的制取:观察大鼠牙槽窝的愈合组织(Extraction socket-derived early healing tissue,ESEHT)的形成情况,结合HE染色与免疫组织化学染色结果,选择最佳时间点的ESEHT,提取大鼠DSCs;另拔除大鼠切牙分离出PDLSCs,流式细胞仪鉴定PDLSCs与DSCs的表型。(3)增殖、克隆形成与多向分化能力:用CCK-8法和克隆形成检测对比PDLSCs与DSCs的差异;PDLSCs与DSCs进行成脂与成骨诱导,分别用油红O染色,与ALP及茜素红染色,并用RT-PCR及Western blot检测PDLSCs与DSCs成骨相关基因及蛋白表达情况,比较成骨分化能力的差异。结果:(1)建模后的大鼠拔牙创口愈合良好,逐渐形成一定形状的ESEHT,尤其在第3天时最为明显;HE染色结果中,拔牙术后3天的牙槽窝内,观察到大量的纤维结缔组织增生,而拔牙术后第1天的牙槽窝内未见结缔组织,拔牙术后第7天则骨组织愈合明显,骨小梁数量明显增多,较多骨髓腔形成。(2)免疫组化结果显示,拔牙术后即刻和第1天时,牙槽窝内壁的骨髓孔边缘,可见P75NTR的表达;而第3天,阳性表达区域出现在牙槽窝中心的纤维结缔组织周围,而牙槽窝内壁亦可见少量着色;拔牙术后7天,P75NTR表达于骨小梁边缘的纤维结缔组织。(3)培养出来的PDLSCs与DSCs形态较为类似,细胞呈长梭形和多角形,均高表达间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)相关表型。CCK-8法检测DSCs的增殖活力较PDLSCs强(p<0.05),且克隆形成率更高(p<0.001)。(4)PDLSCs与DSCs经油红O染色后,显示两种细胞都可形成脂滴,二者都显示出成脂分化的潜能。而ALP及茜素红染色后,DSCs的染色最深,且钙化结节形成更多,RT-PCR及Western blot检测成骨诱导7天后,DSCs的ALP、RUNX2的表达较PDLSCs高(P<0.05),结果都表明DSCs成骨分化能力较PDLSCs强。结论:大鼠拔牙后的牙槽窝内可以提取分离出DSCs,其可以在体外稳定的扩增,增殖和克隆形成能力均较PDLSCs高,DSCs有多向分化潜能,且成骨分化潜能比PDLSCs强。

关键词： 概念模型   高中生物学   细胞生物   应用研究  

摘要： 新修订的《普通高中生物课程标准》正式提出了生物学科核心素养,并明确其四个主要表现,即生命观念、理性思维、科学探究和社会责任。为了实现提升核心素养的目标,将概念教学融入高中阶段的生物教学显得格外重要,所以高中生物教师需要突出生物概念的教学。同时,《标准》的基本理念中高度重视教学过程与实践,并强调高效的生物学习需要有学生的积极参与、主动思考以及切身实践。需要教师积极引导学生体验模型构建,提升学生的科学思维能力。概念模型是生物模型的重要构成之一,是运用文字与符号,对事物本质属性进行表述的模型,重点用于明确不同生物学概念的关系,建立知识网络,对协助学生认知生物学概念、培育科学思维等有重大价值。教师积极导入概念模型,参考其具备的可视化、显性化等优点,有助于实现生物知识的系统化与结构化,建立对概念的深刻认知。尽管目前国内外对概念模型在教学中的应用已经有较多研究,然而对在高中生物学中如何利用概念模型提高教学效果,尤其是如何将其与生物学学科素养的教学目标有机结合,目前还鲜有报道。因此,本研究在教材分析和应用现状调查的基础上,研究实际存在的各类问题,并结合问题进行应用案例的优化设计,并进一步通过教学实验对其可行性和有效性开展验证,期望为概念模型在高中生物教学中更好地运用提供参照。本研究的主要结果如下:首先为了研究概念模型的构建是否能促进学生进一步理解教材中核心概念,笔者在教学实验前和教学实验后,都分别对实验班和对照班进行了前测和后测两套试题检测。并且将所得成绩记录并使用Excel、Graph Pad Prims进行平均分分析以及单因素方差分析,数据分析显示在进行构建概念模型实验前,实验班和对照班的成绩无明显差异。而在实验展开之后的后测成绩显示,实验班的成绩明显高于对照班,具有显著差异。意味着概念模型的构建,有助于深化学生对核心概念知识群的理解。其次,概念模型有助于提升学生的自主构建模型等能力。为分析该方法是有助于提升学生的自主构建能力和创新能力,笔者在实验后随机抽取了实验班30位同学进行了一对一访谈,并对其所构建的概念模型进行了检查,发现:实验班在实验教学之后,概念模型的完整性、美观性和逻辑性等都有明显改善,而对照班无明显差异,这表明概念模型的构建,有助于构建模型等素养的提升。最后,概念模型有助于提升学生对生物学的兴趣。笔者在实验前后分别对实验班和对照班进行了兴趣调查,发现在实验教学后,实验班对生物感兴趣的人数明显增加,这表明相比于“满堂灌”的传统教学,学生对加入概念模型教学策略的课堂更有兴趣。综上所述,本研究表明概念模型构建的教学应用研究,有助于学生更好地认知教材的核心概念、提升学生的自主构建模型能力以及提高学生对生物学的兴趣。这些结果对一线教师推广使用概念模型教学具有一定的参考意义。

关键词： 乳腺癌   环状RNA   hsa_circ_0006522  

摘要： 第一部分hsa＿circ＿0006522在乳腺癌组织中的表达及其与预后的关系目的:探讨hsa＿circ＿0006522在乳腺癌组织中的表达及与预后的关系。方法:1.采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)方法检测hsa＿circ＿0006522在乳腺癌组织芯片中的表达。2.结合乳腺癌患者临床病理及随访资料,分析hsa＿circ＿0006522与临床生物学指标、免疫指标、及患者预后的关系。结果:***结果表明,hsa＿circ＿0006522定位于乳腺癌的细胞质中。***＿circ＿0006522的表达与乳腺癌患者的年龄、组织学分级、肿瘤大小、人类表皮生长因子受体2(Human-epidermal growth-factor receptor-2,Her-2)、雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)、孕激素受体(Progesterone-receptor,PR)和程序性死亡配体1(Programmed death ligand 1,PD-L1)的表达无相关性(P>0.05)。hsa＿circ＿0006522高表达与乳腺癌患者的淋巴结转移(P=0.019)、临床分期(χ=7.326,P=0.026)呈正相关。***-Meier分析表明,hsa＿circ＿0006522高表达的乳腺癌患者总生存(overall survival,OS)较低表达患者缩短(P=0.0215)。4.多变量Cox回归分析显示,hsa＿circ＿0006522的表达、年龄、ER的表达是影响乳腺癌患者独立的预后因素:hsa＿circ＿0006522高表达、年龄>60岁、ER表达阴性的患者总生存较差。小结:FISH检测结果显示,环状RNA hsa＿circ＿0006522定位于乳腺癌细胞质,其高表达与腋淋巴结转移、临床分期呈正相关;生存分析结果显示,hsa＿circ＿0006522高表达、年龄>60岁、ER表达阴性患者的总生存较差。第二部分hsa＿circ＿0006522的表达对乳腺癌细胞生物学功能的影响目的:探讨hsa＿circ＿0006522的表达对乳腺癌细胞生物学功能的影响。方法:1.采用RT-PCR法检测hsa＿circ＿0006522在乳腺癌细胞中的表达。2.采用放线菌素D实验检测hsa＿circ＿0006522在乳腺癌细胞中的稳定性。3.通过qRT-PCR法进一步检测不同类型的乳腺癌细胞中hsa＿circ＿0006522的表达。4.采用CCK-8法和平板克隆形成实验检测hsa＿circ＿0006522的表达变化对乳腺癌细胞增殖能力的影响。5.采用划痕愈合实验和Transwell实验检测hsa＿circ＿0006522的表达变化对乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力的影响。结果:***-PCR结果表明,以乳腺癌细胞的c DNA和g DNA为模板,环状转录本只能通过发散引物在c DNA中扩增,而线性转录本可通过聚合引物在c DNA和g DNA中同时扩增。2.放线菌素D实验结果显示,hsa＿circ＿0006522比其对应的线性转录本更稳定,半衰期更长。***-PCR结果显示,在4种乳腺癌细胞系中(MDA-MB-453,MCF-7,BT-549,MDA-MB-231),hsa＿circ＿0006522在MDA-MB-453中表达量最低,而在MDA-MB-231细胞中表达量最高。***-8法和平板克隆形成实验结果显示hsa＿circ＿0006522表达升高使乳腺癌细胞增殖能力显著增强(P<0.05)。5.划痕愈合实验和Transwell实验结果显示hsa＿circ＿0006522表达升高使乳腺癌细胞迁移和侵袭能力显著增强(P<0.05)。小结:hsa＿circ＿0006522比相应线性转录本稳定,hsa＿circ＿0006522表达升高可促进乳腺癌细胞MDA-MB-453的增殖、迁移和侵袭能力,hsa＿circ＿0006522表达下降抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖、迁移和侵袭能力。结论:***＿circ＿0006522在乳腺癌组织中高表达,其表达水平与乳腺癌患者的淋巴结转移、临床分期呈正相关;hsa＿circ＿0006522高表达、年龄>60岁、ER表达阴性预示着乳腺癌患者的总体生存期较短。***＿circ＿0006522在乳腺癌细胞中稳定表达,其高表达促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

关键词： 凝血因子Ⅱ   肝癌   增殖   迁移   侵袭  

摘要： 目的 本研究以肝癌细胞为研究对象，探索凝血因子Ⅱ（简称F2）对肝癌细胞系的增殖、迁移、侵袭以及凋亡等生物学行为的影响，寻找新的肝癌预后标志物，为肝癌治疗提供潜在靶点。方法 利用ICGC数据库验证F2在肝癌中的表达水平及其与预后的关系。通过重组慢病毒载体构建稳定过表达和稳定敲低的肝癌细胞株，后通过CCK-8实验、平板克隆实验、划痕实验、Transwell细胞侵袭实验、流式细胞术、免疫印迹实验检测F2对肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡能力的影响。最后利用生物学信息方法进行通路富集分析。结果 F2在肝癌组织中表达下调（P<0.001），且与患者总生存时间更短有关（P<0.01）。CCK-8、平板克隆实验结果显示，F2对肝癌细胞的增殖起抑制作用（P<0.05）；划痕实验、Transwell细胞侵袭实验结果显示，F2对肝癌细胞的迁移和侵袭起抑制作用（P<0.05）；流式细胞术和免疫印迹结果显示，F2诱导肝癌细胞凋亡（P<0.05）。F2的潜在相关基因主要参与胆固醇代谢、PPAR信号通路、凝血等过程。结论F2对肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭有一定的抑制作用，并诱导肝癌细胞凋亡，其可能在肝癌的发生发展中起抑制作用。

关键词： miR-593-5p   PLK1   胃癌   生物学功能  

摘要： 目的:MicroRNA-593-5p(miR-593-5p)靶向保罗样激酶1(Polo-like kinase1,PLK1)调控胃癌细胞发生、发展的作用机制尚不明确。本研究旨在通过体外细胞实验观察miR-593-5p及PLK1在胃癌细胞中的表达情况,并且分别过表达和抑制miR-593-5p后靶向PLK1对人胃癌细胞生物学功能的影响,为揭示胃癌的分子致病机理提供新的见解和思路,也为探索一种潜在的肿瘤标记物和新的肿瘤治疗靶点提供了理论基础。方法:(1)培养四种人胃癌细胞系(分别是MGC-803、AGS、HGC27、MKN-45)及一株正常的人胃黏膜上皮细胞系(GES-1)。(2)采用反转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction,RT-PCR)技术分别检测miR-593-5p、PLK1在上述各细胞系中RNA的表达情况,并筛选出一株miR-593-5p表达量较高和一株miR-593-5p表达量较低的细胞系做为工具细胞用于转染及功能实验。(3)通过生物信息学网站Target Scans Human 7.2检测miR-593-5p与PLK1基因二者是否存在结合位点。(4)采用脂质体转染胃癌工具细胞,将构建的miR-593-5p模拟物(mimic)及其miR-593-5p模拟物阴性对照(mimic NC)分别瞬时转染至miR-593-5p表达量低的细胞系MGC-803中,将miR-593-5p抑制物(inhibitor)及其抑制物阴性对照(inhibitor NC)分别瞬时转染至miR-593-5p表达量高的细胞系MKN-45中,构建过表达和抑制miR-593-5p的胃癌细胞。荧光显微镜下观察转染荧光效果,并采用RT-PCR技术验证并检测miR-593-5p是否转染成功。(5)蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)实验检测分别过表达及抑制miR-593-5p后胃癌细胞系MGC-803和MKN-45中PLK1蛋白表达水平。(6)采用划痕实验、Transwell实验、CCK8实验及流式细胞技术分别检测在胃癌细胞系中成功过表达和抑制miR-593-5p前后对胃癌细胞迁移、侵袭、增殖及凋亡能力的影响。结果:(1)RT-PCR结果表明在HGC27、MGC-803、AGS、和MKN-45胃癌细胞系中PLK1 mRNA的表达水平相较于正常的胃黏膜细胞(GES-1)显著增加。而miR-593-5p在上述四种胃癌细胞系中的表达量则显著低于GES-1,其中以MGC-803细胞系中miR-593-5p的表达量最低,MKN-45细胞系中miR-593-5p的表达量最高,并将这两株细胞作为我们的工具细胞进行转染和一系列功能实验。(2)经生物信息学网站Target Scans Human 7.2检测miR-593-5p与PLK1基因存在相应的3’UTRs结合位点。(3)脂质体将miR-593-5p mimic及mimic NC分别转染至胃癌细胞MGC-803后,RT-PCR检测结果显示:与空白对照组和mimic NC组相比,mimic组中miR-593-5p的表达量显著增加,表明转染成功。将miR-593-5p inhibitor及inhibitor NC分别转染至胃癌细胞MKN-45后,RT-PCR检测结果显示:与空白对照组和inhibitor NC组相比,在inhibitor组中miR-593-5p的表达量显著降低,表明转染成功。(4)WB结果显示:在胃癌细胞MGC-803中过表达miR-593-5p后,MGC-803细胞系mimic组PLK1蛋白表达量显著降低;在胃癌细胞MKN-45中抑制miR-593-5p后,MKN-45细胞系inhibitor组PLK1蛋白表达量显著增加。(5)细胞划痕实验结果显示:脂质体转染miR-593-5p mimic至胃癌细胞系MGC-803后,与对照组相比,MGC-803细胞系mimic组中胃癌细胞的迁移能力降低;相反,转染miR-593-5p inhibitor至胃癌细胞系MKN-45后,与对照组相比,MKN-45细胞系miR-593-5p inhibitor组中胃癌细胞的迁移能力增强。(6)Transwell实验结果显示:在胃癌细胞系MGC-803中成功转染miR-593-5p mimic后,与对照组相比,MGC-803细胞系组胃癌细胞的侵袭能力降低;相反,在胃癌细胞系MKN-45中成功转染miR-593-5p inhibitor后,与对照组相比,MKN-45细胞系inhibitor组中的侵袭能力随之增强。(7)CCk-8实验结果显示:在胃癌细胞系MGC-803中成功转染miR-593-5p mimic后,与对照组相比,MGC-803细胞系中mim

关键词： 肝细胞癌   KIF20A基因   免疫治疗   预后分析   肝癌细胞   生物学功能  

摘要： 背景:　　近几十年来，各种恶性肿瘤在世界范围内呈现出惊人的发病率和死亡率，其中，肝癌为全球死亡率高居第三位的恶性肿瘤。经过从放疗、化疗到靶向治疗和免疫治疗的不懈努力，我们提高了对肿瘤复杂发病机制的认识，也提高了治疗的水平。但仍有大量的病人经历了治疗失败。大规模的基因组学项目，有助于探索新的预后生物标志物和治疗靶点。驱动蛋白家族成员20A(KIF20A),是一类分子运动蛋白，在细胞有丝分裂、迁移和细胞内运输中起着关键作用。最近，多项研究表明KIF20A被认为是一种新型的肿瘤相关基因。然而，对KIF20A在泛癌方面一直缺乏全面的研究，且KIF20A在肝细胞癌(HCC)生长和发展中的作用和可能的机制仍然未知。　　目的:　　1.探讨KIF20A在泛癌中的表达情况及诊断、预后和免疫治疗意义。　　2.探究KIF20A在HCC中的临床相关性、预后预测价值及表达情况。　　3.探究KIF20A对HCC细胞生物学功能的影响及相关机制。　　方法:　　1. 通过HPA数据库、CCLE数据库和UCSC Xena平台获取数据，分析KIF20A在人类正常组织、肿瘤细胞系和泛癌中的mRNA表达情况和分布特异性。分别探究33种癌症中不同临床分期或组织学分级中KIF20A的表达情况。。使用ROC曲线下面积(AUC)来评估KIF20A对33种癌症的诊断效能。使用Cox回归和Kaplan-Meier法分析KIF20A的表达在33种癌症中对OS、DSS和PFI的影响。使用ESTIMATE算法、ssGSEA算法、TIDE算法计算在33种癌症中KIF20A的表达与免疫细胞浸润、免疫治疗相关指标和TIDE评分的相关性,进而评估其免疫治疗价值。获取免疫治疗队列IMvigor210数据，分析其中KIF20A高表达患者与低表达患者的生存情况差异。　　2.使用肝癌多队列数据(TCGA-LIHC,ICGC,GSE14520)来分析KIF20A与HCC的预后生存和各种临床特征的相关性，以及在临床预后预测上的价值。分析公共数据集(TCGA-LIHC,ICGC,GSE14520,GSE36376,GSE76427,GSE54236)中肿瘤组织和正常组织的KIF20A表达差异。采用qRT-PCR、IHC、和Western Blotting实验技术来验证癌和癌旁组织中KIF20A的mRNA水平和蛋白水平的表达差异。　　3. 对TCGA队列中KIF20A高低表达组进行差异基因分析，并对其进行富集分析,挖掘KIF20A可能参与的生物学过程和通路。构建慢病毒介导的KIF20A敲低和过表达稳定细胞系，运用流式细胞术探究KIF20A与HCC细胞凋亡的关系及KIF20A对细胞周期进程的影响，使用Western Blotting验证细胞周期相关蛋白、p53通路蛋白和凋亡相关蛋白随KIF20A敲低或过表达的变化。运用克隆形成、CCK-8、裸鼠皮下成瘤实验方法验证KIF20A对HCC细胞在体内及体外增殖的影响。　　结果:　　***20A在各种组织中广泛表达但水平较低。TCGA联合GTEx分析结果显示，KIF20A的表达水平在29种癌症中异常上调，包括肝细胞癌(LIHC),仅在急性骨髓性白血病(LAML)中下调。　　2. KIF20A在13种癌症中临床分期晚期或组织学分级高的患者中表达明显增加。KIF20A在29种癌症中诊断效能的AUC＞0.7,在20种癌症中的诊断效果优异(AUC＞0.9)。　　3. Cox回归分析和KM生存分析共同表明，在LGG、MESO、KIRC、ACC、PAAD、KIRP、LUAD、LIHC、SARC、SKCM、BRCA、UVM、GBM 患者中,KIF20A的高表达者预后较差，而在LAML患者中相反。　　4. KIF20A在多种癌症中与Th2细胞浸润正相关。KIF20A的高表达同时存在肿瘤免疫原性的增强，预示更好的免疫治疗效果。在IMvigor210免疫治疗队列中，KIF20A高表达的患者具有更长的生存时间。　　5.肝癌多队列分析结果显示,KIF20A的高表达组患者的总体生存期(OS)、疾病特异性生存期(DSS)、无进展间隔期(PFI)都较短(P＜0.05)。临床分期较晚、组织学分级较高、血浆AFP水平较高的肝癌患者组织的KIF20A mRNA表达水平较高。Cox回归分析显示KIF20A是一个独立的预后危险因子。　　6.在6个肝癌公共数据集及28对本中心样本中，肿瘤组织中KIF20A的mRNA表达水平都显著高于癌旁组织。18对肝癌组织样本的Western Blotting实验结果显示，肿瘤组织中的KIF20A蛋白表达明显高于癌旁组织。　　7.在Huh7及MHCC97H细胞中，敲低KIF20A会使细胞周期停滞在G0/G1期，过表达KIF20A能够促进G1/S期的转换。敲低KIF20A会上

关键词： 颗粒细胞   N-乙酰半胱氨酸   氧化应激   绵羊  

摘要： 卵泡颗粒细胞(Granulosa cells,GCs)是卵泡的主要功能细胞,GCs的增殖和凋亡与卵泡发育和成熟密切相关。N-乙酰半胱氨酸(N-acetly-L-cysteine,NAC)在降低机体细胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS),维持细胞功能和细胞形态等方面发挥重要作用。NAC作为一种抗氧化剂已广泛应用。本研究在甘肃省武胜驿镇屠宰场采集2岁左右健康母绵羊正常发育的卵巢。待屠宰后立即取出两侧卵巢,37℃保存,4 h内送回实验室。采用卵泡液抽吸法分离GCs,免疫荧光技术进行GCs鉴定。探究最适GCs体外培养条件。通过添加不同浓度NAC(50、100、500、1000μmol/L),分析其对GCs增殖、凋亡、ROS水平、激素分泌及相关基因和蛋白表达水平的影响。使用PI3K/AKT抑制剂LY294002处理,探明NAC对绵羊GCs增殖、类固醇激素分泌的分子机制。利用HO对GCs进行处理构建氧化应激模型,通过NAC对模型进行预处理,研究NAC是否可以抑制模型细胞的凋亡。针对细胞抗氧化能力与NRF2及PI3K/AKT信号通路进行研究,探明NAC是否通过NRF2和PI3K/AKT信号通路来缓解HO诱导的氧化应激损伤。研究结果如下:1.免疫荧光鉴定结果表明体外培养绵羊GCs纯度达到99.2%;培养基加入15%血清时,细胞增殖效果显著高于其他浓度组(P<0.05),DMEM/F12组细胞的增殖效果优于DMEM组(P<0.05)。2.不同浓度NAC组GCs的增殖能力均高于对照组(P<0.05)。体外培养GCs48 h时,100μmol/L NAC能极显著提高GCs的增殖能力(P<0.01)。q RT-PCR和WB结果表明,100μmol/L NAC组的CCND1、CDK4和Bcl-2的表达水平显著上调(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著上调(P<0.05),而Bax基因和蛋白的表达水平显著下调(P<0.05)。100μmol/L NAC显著降低GCs活性氧含量(P<0.05)。q RT-PCR结果表明,100μmol/L NAC组SOD1和CAT表达水平极显著上调(P<0.01)。ELISA和q RT-PCR结果显示,100μmol/L NAC组的P、E分泌量显著升高(P<0.01),P和E相关合成基因3β-HSD和CYP19A1的表达水平显著上调(P<0.05)。用NAC预处理后,再添加PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002,抑制剂LY294002显著降低GCs的增殖能力(P<0.01),抑制GCs分泌E、P(P<0.05);用NAC处理GCs,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达显著上调(P<0.05);用NAC预处理后,LY294002能够显著下调p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达(P<0.05)。3.200μmol/L HO,作用GCs12h,成功构建氧化损伤模型。HO组ROS、MDA含量显著增加(P<0.05),GSH含量及SOD活性显著降低(P<0.05),CAT和SOD1表达水平显著下调(P<0.05);GCs增殖活力显著降低(P<0.01),PCNA和Bcl-2的表达水平显著下调(P<0.05),Bcl-2的蛋白水平显著下调(P<0.01),而Bax基因和蛋白的表达水平显著上调(P<0.05);E、P分泌量显著降低(P<0.05),炎症因子IL-18、IL-1b的含量显著升高(P<0.05);NRF2和HO-1基因和蛋白表达水平显著下调(P<0.05);p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。用NAC预处理后,再添加HO处理,ROS、MDA含量显著降低(P<0.05),GSH含量及SOD活性显著升高(P<0.05),CAT和SOD1表达水平显著上调(P<0.05);GCs增殖活力显著升高(P<0.01),PCNA和Bcl-2的表达水平显著上调(P<0.05),Bcl-2的蛋白水平显著上调(P<0.01),Bax基因和蛋白的表达水平显著下调(P<0.05);E、P分泌量显著上升(P<0.05),炎症因子IL-18、IL-1b的含量显著降低(P<0.05);NRF2和HO-1的基因和蛋白表达水平显著上调(P<0.05);p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。综上所述,绵羊GCs体外培养最佳条件为含有15%血清的DMEM/F-12培养基、培养温度为37℃;NAC激活PI3K/AKT信号通路促进体外培养的绵羊GCs增殖,E和P分泌。NAC通过NRF2及PI3K/AKT信号通路来缓解HO诱导的氧化应激损伤。