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关键词： 金纳米花   主动靶向   多酶级联反应   协同治疗   ROS效应  

摘要： 精准高效治疗是肿瘤治疗领域的核心目标之一,设计精准高效地疗效地疗效肿瘤且不影响正常组织功能的纳米材料是近年来生物医药领域的研究热点。随着人们对肿瘤细胞的深入研究发现,材料表面包覆具有生物活性的肿瘤细胞膜,可以赋予材料主动靶向能力,同时避免其在血液循环中的清除。研究表明肿瘤细胞内活性氧(ROS)升高,可以增加细胞周期抑制肿瘤生长、诱导细胞凋亡。使用高活性天然酶在肿瘤细胞内产生大量的ROS来杀伤肿瘤细胞,进行酶级联动力治疗具有广阔的应用前景。葡萄糖氧化酶(GOx)通过催化肿瘤细胞内的葡萄糖和氧气反应生成葡萄糖酸和HO,消耗胞内的葡萄糖实现饥饿疗法。然而单独的GOx在乏氧肿瘤微环境(TME)下很难通过单一的饥饿疗法实现杀伤癌细胞的目的。过氧化氢酶(CAT)的引入可以为GOx在TME中提供氧气,进一步将辣根过氧化物酶(HRP)引入可以为GOx的催化清除生成物。三酶存在条件下的级联作用,不仅加快反应速率,而且为杀伤肿瘤细胞提供大量的ROS。光热治疗作为近年来备受关注的肿瘤杀伤方式,可以借助红外热效应产生的局部高温杀伤肿瘤细胞。与此同时,局部升温可以促进酶的催化效率,从而进一步增强ROS效应。因此将三种效果加权到同一个纳米平台实现协同杀伤治疗肿瘤,便可以为精准高效抗肿瘤提高契机。综上所述,本论文制备一种具有源癌细胞主动靶向的光热/多酶级联协同治疗的纳米粒子AuNFs-GCH@CM,并对该复合靶向纳米粒子的细胞生物学进行评价。我们首先通过种子生长法制备了具有分支结构的金纳米花(AuNFs),以此为核心负载多种天然活性酶GOx、CAT HRP。然后将4T1肿瘤细胞膜(CM)包覆在AuNFs-GCH表面,制备出多功能复合金纳米粒子AuNFs-GCH@CM。通过透射电子显微镜(TEM)和激光粒度仪对AuNFs-GCH@CM进行形貌、粒径的表征,得到AuNFs-GCH@CM的直径介于200-260 nm之间,大小均一且分散性良好;采用电势测试和蛋白质印记法证实了多酶的负载和癌细胞膜(CM)的成功包覆,确认该复合纳米粒子AuNFs-GCH@CM的成功制备。通过体外试剂盒化学检测法,验证酶修饰在金表面后,仍具有多酶级联活性。优化光热转换性能实验结果显示,当AuNFs-GCH@CM的溶液浓度为200 ppm,激光照射强度为1.5 W/cm,照射300 s后,体系温度可达46.7℃。反复加热冷却循环5次过程中,最高温度均保持在43～47℃之间。表明复合纳米粒子AuNFs-GCH@CM具有良好的光热转换能力和光热稳定性。体外细胞生物学评价表明,制备的复合纳米粒子AuNFs-GCH@CM具有良好的细胞相容性和癌细胞毒性。通过CCK-8实验证实,材料与正常小鼠成纤维细胞(L-929)共孵育12 h后,细胞活力仍然保持在90%以上。而与肿瘤细胞(4T1)共培养12 h后,细胞存活率只有40%,在激光照射下,4T1细胞的存活率低于20%。通过荧光标记法证实AuNFs-GCH@CM在肿瘤细胞内生产的活性氧能够达到诱导细胞凋亡的效果,并且在激光照射下,活性氧产生更多。综上所述,我们设计制备的AuNFs-GCH@CM复合靶向纳米粒子集高细胞相容性、主动靶向性、光热性能和多酶级联活性的多重优点于一体。论文构建的新型多功能复合纳米粒子为抗肿瘤纳米材料的发展提供了思路和基础研究数据。

关键词： 刚地弓形虫   恶性肿瘤   膀胱癌   流行病学   生物学行为  

摘要： 目的:本研究通过检测大理地区恶性肿瘤患者弓形虫感染率,进一步丰富弓形虫感染数据库,为恶性肿瘤患者弓形虫感染防控提供参考依据。同时探讨弓形虫培养上清对恶性肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等生物学行为的影响,旨在为恶性肿瘤的临床治疗提供新的思路。方法:1.收集2020年至2022年期间在大理大学第一附属医院接受治疗的721例恶性肿瘤患者的血清样本,同时收集100例健康体检者血清作为对照,采用酶联免疫吸附试验检测血清中抗弓形虫IgG及IgM抗体,比较分析不同类型以及不同特征恶性肿瘤患者抗弓形虫特异性抗体阳性率差异。2.取对数生长期的人膀胱癌5637细胞接种于细胞培养板中,实验组分别加入RH型及ToxoDB#9型弓形虫速殖子培养24 h后的上清液,对照组加入等体积的RPMI1640培养基。通过显微镜观察弓形虫培养上清干预后细胞的形态变化,采用CCK-8实验检测弓形虫培养上清对细胞增殖能力的影响,利用划痕愈合实验和Transwell实验检测对细胞的迁移和侵袭能力的影响,使用TUNEL实验检测对细胞的凋亡率的影响,通过Western blot实验检测对细胞中凋亡相关蛋白Bax与Bcl-2表达情况的影响。使用统计学软件对实验结果进行统计分析以得出有效结论。结果:1.721例恶性肿瘤患者血清抗弓形虫IgG抗体阳性率为21.22%,高于健康对照组的8.00%(P<0.05),血清抗弓形虫IgM抗体阳性率与健康对照组差异无统计学意义(P>0.05)。不同类型恶性肿瘤中,胃癌、膀胱癌、结直肠癌、甲状腺癌、肺癌、子宫颈及子宫内膜癌与肝癌患者的血清抗弓形虫IgG抗体阳性率均显著高于健康对照组(P<0.05),子宫颈及子宫内膜癌患者血清抗弓形虫IgM抗体阳性率显著高于健康对照组(P<0.05),但不同类型恶性肿瘤患者的血清抗弓形虫IgG及IgM抗体阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)。不同性别、年龄、民族、职业和居住地的恶性肿瘤患者血清抗弓形虫IgG抗体阳性率的差异均无统计学意义(P>0.05),不同性别、不同年龄恶性肿瘤患者血清抗弓形虫IgM抗体阳性率的差异有统计学意义(P<0.05)。2.(1)镜下观察细胞形态,弓形虫培养上清干预24 h后,与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组细胞量减少,细胞皱缩,核浆比例降低,核固缩、破裂。(2)在CCK-8实验中,弓形虫培养上清对5637细胞的增殖能力具有抑制作用,且ToxoDB#9组抑制率高于RH组(P<0.05)。(3)在划痕愈合实验中,24 h时对照组、RH组与ToxoDB#9组的细胞迁移率分别为(19.92±8.62)%、(11.80±3.18)%、(4.02±1.73)%,36h时对照组、RH组与ToxoDB#9组的细胞迁移率分别为(64.60±5.60)%、(17.57±4.24)%、(15.47±4.82)%。与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组的细胞迁移率均降低(P<0.05),且ToxoDB#9组迁移率低于RH组(P<0.05)。(4)在Transwell迁移实验中,对照组、RH组与ToxoDB#9组的迁移细胞数分别为(899.33±28.19)、(476.00±25.96)、(439.00±31.38)。与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组的迁移细胞数均降低(P<0.05),且ToxoDB#9组迁移细胞数低于RH组(P>0.05)。(5)在Transwell侵袭实验中,对照组、RH组与ToxoDB#9组的侵袭细胞数分别为(459.67±11.61)、(343.33±20.74)、(217.33±32.42)。与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组的侵袭细胞数均降低(P<0.05),且ToxoDB#9组侵袭细胞数低于RH组(P<0.05)。(6)在TUNEL实验中,对照组、RH组与ToxoDB#9组的细胞凋亡率分别为(5.71±2.37)%、(74.35±5.88)%、(79.29±6.54)%。与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组的细胞凋亡率均上升(P<0.05),且ToxoDB#9组凋亡率高于RH组(P>0.05)。(7)在Western blot实验中,与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组的细胞中Bax蛋白表达水平明显上升,Bcl-2蛋白表达水平明显下降,且Bcl-2/Bax比值下降,经统计学分析显示,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.大理地区恶性肿瘤患者弓形虫感染率显著高于健康对照者,但不同类型恶性肿瘤患者弓形虫感染率差异无统计学意义。恶性肿瘤患者弓形虫感染率不具有性别、年龄、职业、居住地和民族特异性。提示恶性肿瘤患者合并弓形虫感染较为常见,临床治疗时应加强对弓形虫感染的防治。2.弓形虫培养上清对膀胱癌5637细胞的增殖、迁移及侵袭能力有明显的抑制作用

关键词： 贵州黑山羊   COL1A1基因   颗粒细胞   细胞增殖   产羔性能  

摘要： 贵州黑山羊(Capra hircus)是贵州省地方三大品种之一,是人工选育和自然选择的产物,具有适应性好、抗病力强、耐粗饲和肉品质优良等特点,广受养殖户及消费者喜爱。但贵州黑山羊产羔数偏低,繁殖成本高,严重制约着肉羊产业发展。研究发现,I型胶原蛋白α1链(Collagen type I alpha 1 chain,COL1A1)作为细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)I型胶原蛋白的重要组成成分,在维持人及动物卵巢正常功能中发挥作用,与动物繁殖性状密切相关,然而COL1A1基因在影响贵州黑山羊卵泡发育及卵巢细胞增殖和凋亡中的作用并不清楚。因此,为研究COL1A1基因与贵州黑山羊繁殖力间的关系,分析其对卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响,论文以贵州黑山羊为研究对象,运用RTq PCR技术检测COL1A1基因在单羔、多羔贵州黑山羊性腺轴组织中m RNA的表达水平;通过免疫组化和Western blot检测COL1A1蛋白在单羔、多羔贵州黑山羊卵巢组织中表达及定位;随后分离培养卵巢颗粒细胞,构建COL1A1基因干扰和过表达载体,转染至卵巢颗粒细胞中,通过RT-q PCR、Western blot、CCK-8、细胞划痕、流式细胞术等技术检测COL1A1基因不同表达水平对产羔相关基因的影响、颗粒细胞增殖、迁移、周期、ROS水平、以及凋亡指标蛋白和PI3K/AKT/m TOR通路蛋白表达的影响。主要研究结果如下:***1A1基因在多羔组贵州黑山羊性腺轴组织中的表达水平显著高于单羔组在同期发情处理的前提下,从形态学上来看,多羔组贵州黑山羊卵巢组织明显比单羔组体积更大,卵泡发育更为成熟;RT-q PCR试验结果发现,COL1A1基因在多羔组卵巢、下丘脑、垂体和输卵管组织中的表达均极显著高于单羔组(P<0.01),且在多羔组卵巢中的表达量最高;免疫组化及Western blot试验结果表明,COL1A1蛋白在单羔和多羔卵巢组织各级卵泡、卵巢细胞、结缔组织中均有表达,且在多羔组卵巢中高表达(P<0.01)。以上结果暗示COL1A1的表达量可能与山羊繁殖率呈正相关关系,在维持卵巢组织结构和卵泡发育中发挥积极作用。2.成功构建了COL1A1基因过表达载体和干扰载体论文通过重叠延伸PCR-酶切酶连法构建COL1A1基因过表达载体,双酶切鉴定、测序鉴定、RT-q PCR及Western blot试验结果表明,论文成功构建了pc DNA3.1(+)-COL1A1真核表达载体。根据sh RNA设计原则,构建4个干扰COL1A1基因表达的干扰载体,并通过绿色荧光蛋白发光强度、RT-q PCR及Western blot检测不同干扰载体对COL1A1基因和蛋白的抑制效率,结果表明sh RNA-COL1A1-2为抑制COL1A1基因表达的最佳干扰载体。上述结果为后续验证COL1A1基因不同表达水平影响颗粒细胞的生物学功能奠定基础。3.过表达和干扰COL1A1基因严重影响了颗粒细胞的表型及产羔相关基因的表达CCK-8、细胞划痕、流式细胞及活性氧检测试验结果表明:COL1A1基因在颗粒细胞中的过表达,显著促进了颗粒细胞的增殖能力(P<0.01)、迁移能力(P<0.05),改变了细胞周期进程,降低了细胞中ROS的水平(P<0.01);而下调COL1A1基因的表达,显著抑制了颗粒细胞的增殖(P<0.01)、迁移(P<0.05),改变细胞周期进程,促进细胞内ROS水平升高(P<0.05)。此外,RT-q PCR结果表明,上调COL1A1基因的表达,能促进颗粒细胞中产羔相关基因GDF9、BMP15和FSHβ的表达水平(P<0.01),而干扰COL1A1基因的表达,上述基因表现出明显相反的表达结果。以上结果说明,COL1A1基因与山羊颗粒细胞增殖、迁移和产羔基因的表达正相关,与细胞中ROS水平负相关。***1A1基因通过调控PI3K/AKT/m TOR通路影响颗粒细胞的增殖和凋亡对COL1A1基因影响颗粒细胞的增殖和凋亡的信号通路研究发现,上调COL1A1基因在颗粒细胞中的表达水平,促进了p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR比值及细胞增殖相关蛋白PCNA的表达(P<0.05),抑制了凋亡相关蛋白BAX、Caspase-3和Caspase-9的表达(P<0.05);而下调COL1A1基因的表达,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、pm TOR/m TOR、BAX、Caspase-3和Caspase-9蛋白,则具有相反的表达模式。综上可见,COL1A1基因可能通过激活PI3K/AKT/m TOR通路蛋白的表达,调节PCNA、BAX、Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达来调控颗粒细胞的增殖、迁移、周期和RO

关键词： 同种异体移植炎症因子-1   脉络膜新生血管   内皮细胞   炎症   信号通路  

摘要： 目的:本研究旨在探讨同种异体移植炎症因子-1(Allograft inflammatory factor-1,AIF-1)及相关信号通路在恒河猴脉络膜-视网膜内皮细胞(rhesus choroid-retinal endothelial cell line,RF/6A)化学缺氧模型中的作用,探索AIF-1与血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在RF/6A化学缺氧模型中的相互作用关系,为研究黄斑新生血管(macular neovascularization,MNV)的发病机制及为眼部新生血管疾病的治疗提供新的理论和实验基础。方法:1.通过在完全培养基中加入化学缺氧诱导剂氯化钴(cobalt chloride,Co Cl),模拟缺氧诱导下脉络膜-视网膜内皮细胞(endothelial cells,ECs)的应激损伤,建立RF/6A体外化学缺氧模型。Western blot检测RF/6A在缺氧状态下0、1h、3h、6h、12h和24h细胞蛋白样品中AIF-1和VEGF蛋白的表达趋势,并与对照组比较。2.按照实验设计进行细胞分组:(1)正常对照组;(2)缺氧组;(3)缺氧+scramble si RNA组:缺氧刺激前对RF/6A转染scramble si RNA;(4)缺氧+AIF-1 si RNA组:缺氧刺激前对RF/6A转染AIF-1 si RNA;用AIF-1 si RNA抑制AIF-1的表达,采用Western blot检测AIF-1、VEGF蛋白表达水平。3.在人视网膜色素上皮细胞(Human Retinal Epithelial Cells,ARPE-19)和RF/6A细胞共培养体系中,使用Transwell迁移实验探索缺氧条件下RF/6A细胞转染AIF-1 si RNA后的迁移能力,并与缺氧组相比较。细胞增殖活性实验(CCK-8)、管形成实验用于探究缺氧条件下不同分组处理对RF/6A的增殖能力和管形成能力的影响。4.细胞活力(活死细胞染色,Calcein AM/PI法)实验用于验证AIF-1 si RNA转染后对RF/6A细胞凋亡能力的影响。***-1 si RNA抑制AIF-1的表达后,Western blot检测p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达水平。*** 1/2特异性通路抑制剂(SCH772984)阻断ERK1/2信号通路,采用Western blot检测AIF-1、VEGF、p-ERK和总ERK1/2蛋白表达水平。结果:1.在体外细胞化学缺氧模型中,Western Blot结果显示,与正常对照组相比,AIF-1与VEGF蛋白表达水平并行上调,随缺氧时间延长逐渐升高(P<0.05),在6h达到峰值,之后逐渐降低。***/6A转染AIF-1 si RNA后对RF/6A进行缺氧诱导,提取细胞蛋白样本进行Western Blot实验,结果显示,与缺氧组相比,AIF-1 si RNA能够沉默AIF-1表达,同时能够下调VEGF蛋白表达(P<0.05)。3.在ARPE-19和RF/6A细胞共培养系统中,AIF-1 si RNA转染后,迁移细胞数量明显降低,抑制了缺氧条件下RF/6A的迁移能力(P<0.05)。CCK-8结果显示,沉默AIF-1表达,细胞存活率较正常组降低(P<0.05),证明AIF-1 si RNA能够有效降低ECs在缺氧条件下的增殖能力。同样,管形成实验中脉络膜-视网膜内皮细胞间连接数也明显减少(P<0.05),说明ECs在缺氧条件下的成管能力也可被AIF-1 si RNA抑制。4.荧光显微镜下观察不同波长下显示的细胞生存状态,发现AIF-1si RNA转染RF/6A后,凋亡细胞数比例升高,说明AIF-1si RNA在缺氧状态下促进了RF/6A的凋亡。5.缺氧条件下AIF-1 si RNA转染RF/6A后,与缺氧组相比,p-ERK1/2蛋白表达水平降低。*** 1/2特异性通路抑制剂(SCH772984)显著降低了缺氧条件下VEGF和p-ERK1/2蛋白表达水平(P<0.05),但AIF-1和总ERK1/2蛋白表达不受影响(P>0.05)。结论:AIF-1与VEGF在RF/6A细胞缺氧模型中表达,抑制缺氧状态下AIF-1表达可显著降低RF/6A的增殖、迁移、管形成能力,增强RF/6A的凋亡能力。在细胞化学缺氧模型中,AIF-1通过ERK1/2信号通路调控RF/6A生物学活性和VEGF表达。

ISBN: (纸本)9787309164459

关键词： 21岁高龄猪   成纤维细胞   细胞生物学特性   体细胞核移植  

摘要： 从多莉羊诞生至今体细胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer)技术已走过27年的历史,因其能将体细胞重编程为全能状态而备受关注。濒死老年动物成纤维细胞和新生动物成纤维细胞有何不同?两类细胞重编程效率如何?使用极度衰老的动物成纤维细胞能否成功克隆出后代?因此,本研究将探索随着个体年龄的增长,个体衰老与细胞表型、细胞增殖、细胞衰老、细胞凋亡、胚胎发育等有无必然联系,并为体细胞核移植技术在濒危动物遗传资源保护及“复活”中的应用奠定理论依据。本研究使用21岁高龄公猪为主要研究对象,3日龄、2岁龄的滇南小耳猪为对照。通过观察细胞表型、绘制生长曲线、检测细胞衰老和凋亡,并进行核移植胚胎体外培养和胚胎移植体内实验,多方面评估衰老个体细胞与新生个体细胞的差异。三种细胞的生长曲线呈典型的S型,21岁高龄猪耳成纤维细胞生长最快、数量最多、活性最好,与2岁龄、3日龄猪耳成纤维细胞数量相比差异显著,3日龄猪成纤维细胞增殖最慢且与2岁龄猪耳成纤维细胞相比差异显著。3日龄猪耳成纤维细胞衰老率(24.1%±11.8%)显著高于21岁高龄猪耳成纤维细胞衰老率(15.5%±8.1%,p<0.05),并高于2岁龄猪(17.8%±10.3%)但二者间无显著性差异(p>0.05)。21岁高龄猪耳成纤维细胞凋亡率(5.3%±0.4%)显著低于3日龄猪(6.2%±0.7%)和2岁龄猪(7.4%±2.5%,p<0.05)。凋亡水平最高发生在2岁龄猪耳成纤维细胞。3日龄猪耳成纤维细胞构建的1027个克隆胚胎卵裂率为74.6%±11.3%,囊胚率为22.4%±7.8%。21岁高龄猪耳成纤维细胞构建克隆胚胎999个,卵裂率为70.2%±15.2%,囊胚率为21.1%±9.3%,两组细胞卵裂率和囊胚率均无显著性差异(p>0.05)。21岁高龄猪耳成纤维细胞克隆胚胎囊胚细胞数(42.1±21.0)显著高于3日龄猪(32.8±11.6,p<0.05),表明21岁高龄猪耳成纤维细胞克隆囊胚质量好于3日龄新生猪。两组克隆胚胎随机均等分配合并移植进入7头代孕母猪体内,其中3头妊娠、获得克隆仔猪12头。经过DNA微卫星分析鉴定,3日龄猪耳成纤维细胞克隆猪4头,21岁高龄猪耳成纤维细胞克隆猪8头。21岁高龄、3日龄猪及其各自克隆后代耳成纤维细胞端粒酶活性水平无显著性差异。本研究通过建立21岁高龄猪和3日龄、2岁龄猪耳成纤维细胞系,对比三种细胞生长状况、衰老和凋亡,并进行核移植研究。发现21岁高龄猪细胞在生长状况、衰老、凋亡等并不比新生3日龄猪细胞差。在核移植胚胎体外发育方面也没有显著性差异,但通过胚胎移植成功获得了更多的21岁高龄猪耳成纤维细胞克隆后代,表明使用21岁高龄猪成纤维细胞可以通过体细胞核移植技术将其再度“复活”,为体细胞核移植技术在濒危动物遗传资源保护中的应用奠定基础。

关键词： 宣威肺癌   MCF2   细胞功能  

摘要： 【背景与目的】课题组前期研究发现宣威非吸烟女性肺腺癌存在独特的基因突变图谱,MCF.2细胞系衍生转化序列是其显著突变基因之一,且MCF2蛋白表达水平越高,肺腺癌的预后越差,但MCF2在肺腺癌中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨宣威非吸烟女性患者肺腺癌组织中MCF2的表达,从细胞水平探讨MCF2对肺腺癌细胞生物学功能的影响,为探索肺腺癌的新型分子标志物提供帮助。【方法】***2蛋白在宣威非吸烟女性肺腺癌组织中表达的检测方法选取2017年1月1日至2019年12月31日在昆明医科大学第三附属医院行手术治疗且术后经病理确诊为肺腺癌的30例宣威地区非吸烟女性患者癌组织及配对癌旁组织蜡块,采用免疫组化法检测MCF2蛋白表达水平,经人工半定量评分分析比较MCF2蛋白在肺腺癌组织及配对癌旁组织中的表达差异。***2对肺腺癌细胞生物学功能影响的研究方法2.1Western Blot筛选工具细胞株以人永生化支气管上皮细胞Base-2b为对照,通过Western Blot在Base-2b及PC-9、A549、H292、H838等11种肺腺癌细胞株中进行筛选,选取MCF2蛋白表达水平最高的细胞通过CRISPER-Cas9技术敲除MCF2,选取MCF2蛋白表达水平最低的细胞过表达MCF2。2.2构建MCF2敲除及过表达稳定转染细胞株(1)设计用于敲除MCF2的3条sg RNA,在构建好敲除质粒后进行U6测序以评估是否构建成功。慢病毒转染72小时后使用嘌呤霉素筛选稳转株,在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达并通过Western Blot验证敲除效率。(2)MCF2过表达慢病毒转染肺腺癌细胞72小时后使用嘌呤霉素筛选稳转株,在荧光显微镜下观察荧光蛋白表达并通过RT-q PCR技术验证过表达效率。2.3敲除及过表达MCF2肺腺癌细胞生物学功能的影响研究方法通过CCK8实验检测敲除及过表达MCF2对肺腺癌细胞增殖能力的影响;通过Transwell实验检测敲除及过表达MCF2对肺腺癌细胞侵袭及纵向迁移能力的影响;通过划痕实验检测敲除及过表达MCF2对肺腺癌细胞横向迁移能力的影响;通过流式细胞学技术检测敲除及过表达MCF2对肺腺癌细胞周期及凋亡的影响。【结果】1 MCF2蛋白在宣威非吸烟女性肺腺癌患者组织中的表达情况在宣威非吸烟女性患者肺腺癌组织中,MCF2蛋白的阳性表达率为26.6%(8/30),在配对癌旁组织中的阳性表达率为3.33%(1/30),差异具有统计学意义(χ=6.405,P≤0.05);MCF2蛋白在宣威非吸烟女性肺腺癌细胞的细胞质中表达,细胞核中不表达。2 MCF2对肺腺癌细胞生物学功能的影响2.1不同肺腺癌细胞中MCF2的表达情况以永生化人支气管上皮细胞Base-2b为对照,11种肺腺癌细胞系中PC-9细胞的MCF2蛋白表达水平最高,H1734细胞MCF2蛋白表达水平最低。因此我们选用PC-9细胞通过CRISPER-Cas9技术敲除MCF2,通过慢病毒转染H1734细胞过表达MCF2。2.2成功构建MCF2敲除及过表达稳定转染细胞株(1)U6测序结果显示,3条sg RNA均成功转入载体质粒。使用嘌呤霉素筛选稳转株后置于荧光显微镜下观察,荧光蛋白表达>90%。Western Blot验证敲除效率后,选取敲除效率最高的细胞作为后续实验的工具细胞。(2)使用嘌呤霉素筛选过表达稳转株后置于荧光显微镜下观察,荧光蛋白表达>80%,RT-q PCR显示过表达载体成功构建。2.3敲除及过表达MCF2对肺腺癌细胞生物学功能的影响敲除MCF2抑制了肺腺癌细胞的增殖能力(P≤0.05),过表达MCF2促进了细胞的增殖能力(P≤0.05);敲除MCF2抑制了细胞的纵向迁移能力(P≤0.05),过表达MCF2无明显改变(P>0.05);敲除MCF2显著抑制了肺腺癌细胞的侵袭能力(P≤0.01),过表达MCF2无明显改变(P>0.05);敲除MCF2导致肺腺癌细胞G0/G1期减少,S期比例增多,G2/M期比例增多,且差异具有显著性(P≤0.01),过表达MCF2导致肺腺癌细胞G0/G1期增多,S期比例减少,G2/M期比例减少,且差异具有显著性(P≤0.01);敲除MCF2导致肺腺癌细胞凋亡率明显增加,早期凋亡细胞(Q2)及晚期凋亡细胞(Q3)比例增加,且差异具有显著性(P≤0.01),过表达MCF2导致肺腺癌细胞凋亡率明显减少,早期凋亡细胞(Q2)及晚期凋亡细胞(Q3)比例减少,且差异具有显著性(P≤0.01)。【结论】MCF2在宣威非吸烟女性肺腺癌中异常表达,MCF2基因能够促进肺腺癌细胞的增殖、生长周期并抑制细胞的凋亡,可能是促进肺腺癌恶行生物学行为的潜在靶点。

关键词： 三阴性乳腺癌   HCF-1   CDC42   增殖   迁移  

摘要： 背景:乳腺癌(Breast cancer,BC)是一种高度异质性的疾病,患者的临床治疗和预后差异很大。三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌亚型中的一种,具有高度侵袭性和高早期复发率,总体预后非常差。因此,TNBC迫切需要新的治疗方法。宿主细胞因子1(Host cell factor 1,HCF-1)作为一种转录因子在癌症中发挥作用,但关于HCF-1在三阴性乳腺癌发生发展的具体机制尚不清楚。因此,阐明HCF-1调控TNBC的发生发展十分重要。细胞分裂周期蛋白42(Cell division cycle 42,CDC42)是一种小GTP酶,近期研究发现,CDC42可能作为HCF-1的下游靶基因在癌症发生发展中发挥作用。然而,CDC42在TNBC中这种调控机制尚不明确。目的:探讨HCF-1基因对三阴乳腺癌细胞系增殖、迁移、凋亡的影响,并探究HCF-1是否通过靶向CDC42来影响三阴性乳腺癌的生物学功能。方法:通过生物信息学对HCF-1基因在乳腺癌和正常样本之间进行差异分析和生存分析。通过蛋白印迹(Western Blot)检测敲低HCF-1后三阴乳腺癌细胞中的HCF-1和CDC42的蛋白表达水平。使用CCK8(Cell Counting Kit-8)试剂盒检测细胞增殖能力。使用流式细胞术检测细胞凋亡水平和周期差异。使用划痕实验和Transwell法检测细胞的划痕愈合能力以及迁移能力。结果:与正常乳腺组织相比,HCF-1在三阴性乳腺癌中显著上调,同时其高表达可能与患者预后不良相关。敲低HCF-1表达,可以显著抑制CDC42蛋白的表达情况。体外功能实验表明,敲低HCF-1表达可以显著抑制细胞的增殖能力、划痕愈合能力以及迁移能力;敲低HCF-1表达,细胞总凋亡率增加、细胞周期G1期比率增加。结论:本研究表明,在三阴乳腺癌两个细胞系(MDA-MB-231,MDA-MB-468)中,敲低HCF-1后,细胞的增殖能力、划痕愈合能力以及迁移能力显著被抑制,同时细胞总凋亡率增加、细胞周期G1期比率增加。我们的实验发现,HCF-1可能通过调控CDC42参与了三阴性乳腺癌的生物学功能。因此,本研究可能为三阴性乳腺癌寻找新的治疗靶点提供新的思路。

关键词： 肌源性间充质干细胞   生物学特性   细胞移植   肝损伤   组织修复  

摘要： 干细胞是再生医学研究领域的热点之一,许多研究已经在临床应用中取得很大的成果。本研究通过构建小鼠肝损伤模型,以1月龄新西兰兔为试验对象,对其后腿肌肉组织中的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)进行体外分离培养,旨在探讨兔肌源性间充质干细胞(muscle-derived mesenchymal stem cells,MDSCs)生物学特性,并研究MDSCs是否对肝损伤有修复作用,为进一步论证MDSCs对肝损伤的治疗机理提供理论依据和科学依据。本研究通过RT-PCR技术和免疫荧光鉴定分别检测分离传代细胞的表面标记物表达情况;通过生长曲线和克隆形成能力分析分离传代细胞的增殖能力;通过划痕检测分离传代细胞的迁移能力;通过核型分析检测传代细胞是否存在染色体突变;通过不同的培养条件对分离鉴定的MSCs进行体外诱导,使其分别向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞进行分化,并应用RT-PCR技术对诱导分化的细胞进行鉴定;利用腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠肝损伤,建立小鼠肝损伤模型,随后通过尾静脉注射将MDSCs移植到注射了黄孢霉素A的小鼠体内,通过观察HE病理切片分析肝脏损伤修复状况;通过CM-DIL荧光标记检测干细胞是否迁移到损伤部位;通过肝功能指标ALP、AST和ALT表达量检测是否达有修复效果。结果如下:(1)免疫荧光鉴定MDSCs表面标记物CD29、CD44、CD90和CD166呈阳性表达,不表达CD34和CD45;RT-PCR检测鉴定细胞表面标志CD29、CD73、CD166均阳性,不表达CD34。符合间充质干细胞鉴定标准;(2)三个代次MDSCs生长曲线均呈“S”型,细胞主要经历了潜伏期、对数期、稳定期以及衰亡期;细胞克隆形成能力显示,随着传代次数增加,克隆形成能力逐渐下降;同时通过细胞划痕可得,该细胞具有较强的迁移能力。符合细胞在体外培养的生长规律;(3)MDSCs在一定培养条件下具有向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化的能力;(4)核型分析得出P9代前的MDSCs染色体稳定,没有发生突变,细胞各项特征符合间充质干细胞的生物学特性;(5)MDSCs对肝损伤有缓解作用,具体表现在治疗组肝组织切片相较于损伤组中肝细胞的排列相对整齐,无明显炎性因子,损伤得到了改善;同时,MDSCs处理后降低了血清中ALP、AST和ALT表达水平。研究主要结论:(1)MDSCs可以在体外环境下分离培养,分离出来的细胞经多次传代培养后仍具有增殖和分化潜能,细胞各项特征符合间充质干细胞的生物学特性。(2)移植MDSCs后小鼠血清中ALP、AST和ALT表达水平下降,肝损伤明显得到改善。