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关键词： 小麦   黑麦   FISH   异染色体系   抗病性   遗传多样性  

摘要： 小麦(Triticum aestivum L.,AABBDD,2n=6x=42)作为世界上最重要的粮食作物之一,是人类主要的食物来源,为人类提供约20%的蛋白质和热量。黑麦(Secale cereale L.,RR,2n=2x=14)作为小麦的三级基因资源,是小麦的近源物种之一,携带有大量的有用基因。远缘杂交可以使不同种属之间的优良性状结合,扩大遗传变异,创制优良杂种后代。因此,为了弥补传统杂交育种中遗传资源不足的缺陷,利用远缘杂交技术将黑麦所携带的优势基因导入到普通小麦中,是提高小麦育种水平的有效育种途径之一。由于目前广泛推广的小麦品种大多为小麦-黑麦T1RS.1BL易位系,并且黑麦亲本几乎均为Petkus,来源单一,缺乏遗传多样性,因此随着病原菌新的生理小种的出现,T1RS.1BL易位系抗病基因的抗性逐渐减弱甚至丧失。为了对普通小麦品种进行改良,增加小麦的遗传多样性,本研究探究了不同黑麦间的亲缘关系,继续创制并鉴定黑麦来源不同的新小麦-黑麦易位系,并对它们的细胞遗传学特性及农艺性状、抗病性等性状进行了研究,进而为黑麦及小麦育种工程提供更多优良的种质资源和理论基础。本研究最终获得以下结果:1.对包括已测序的威宁黑麦在内的15种野生黑麦、杂草黑麦及栽培黑麦进行细胞学鉴定及探针信号位点及强度的聚类分析,结果表明,5种重复序列在这15种黑麦中75%的位点上并没有表现出很高的多态性,即变异率未超过60%,说明这些位点所处的染色体区段有着较为保守的序列,较为稳定,不会轻易发生变化;同时,还存在25%的位点上表现出较高的多态性,这些位点几乎都位于染色体的端部或亚端部,说明端部和亚端部有较大的变异。该结果可以初步揭示不同黑麦品种染色体区段的不同以及不同黑麦之间的亲缘关系;除此之外,证明了黑麦内部较高的遗传多样性,这为未来的黑麦育种以及进一步利用不同黑麦作为亲本进而培育新的优良小麦-黑麦易位系材料的应用提供了理论基础。2.在秦岭黑麦与川农25的杂交后代中,鉴定得到了3个6RS双端体附加系、3个6RL双端体附加系、2个6R纯合二体附加系及1个T6RS.6AL易位系117-6。对这些材料进行了条锈病及白粉病的抗性鉴定,结果发现这些材料均表现为高抗。与小麦亲本CN25相比,117-6的产量显著增高,实验证明在6R染色体上存在可以利用的抗病基因和增产因子,是小麦遗传改良的重要遗传资源。而这些新品系可作为小麦抗病高产遗传改良的桥梁亲本和育种资源。3.在白粒黑麦和绵阳11的杂交后代中,鉴定得到了一个T7BS.7RL易位系RT14-245。抗病性鉴定结果显示,RT14-245高抗条锈病、白粉病和赤霉病且抗病基因应位于7RL染色体臂上。RT14-245是一个抗病育种潜在的优良种质资源。4.为了对其7RL染色体臂上的抗病基因进行进一步的应用及对抗病基因进行初步定位,对RT14-245进行了辐射处理。在M及M中鉴定得到了7RL端部明显变小的T7BS.7RL缺失系、同时含有7BS.7RL-7DS和7RL-7DS.7DL的易位系以及只含有7RL-7DS.7DL的小片段易位系这3类纯合材料,有些材料还发生了小麦3B/4B易位。对纯合变异体进行了田间成株期的条锈病抗性鉴定,结果发现相对于辐射亲本,部分材料的条锈病抗性减弱。说明可能在辐射过程中染色体结构的变异,导致了抗病性的变化。这些新材料为7RL上抗条锈病基因的定位奠定了物质基础。5.为了确认白粒黑麦7RL染色体臂的导入对株高的影响,对RT14-245和M进行了株高及穗颈长的测定及分析。结果表明,7RL的导入显著增高了株高及穗颈长,并且株高和穗颈长呈极显著相关。6.对秦岭黑麦、威宁黑麦、***及***分别与川农25及川农27的杂交后代进行了鉴定,得到了不同黑麦来源的新的小麦-黑麦易位系,包括T1RS.1BL、T1RS.1AL、T6RS.6AL等纯合易位系材料,以及大量涉及1R-7R的杂合异染色体系。本研究将秦岭黑麦和威宁黑麦基因导入到小麦中,对中国本土黑麦资源进行了充分发掘和利用;将***和***的基因导入到小麦中,成功的实现了杂草黑麦基因的成功转移。除此之外,还从染色体层面及田间调查证明了抗病基因的遗传多样性。这些含有不同黑麦染色质的新型种质资源为将来的小麦抗病、高产育种提供了重要的育种材料。

关键词： 慢性髓系白血病   PYCR1   能量代谢   活性氧   BCR-ABL  

摘要： 背景:慢性髓系白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一种克隆性骨髓增殖性肿瘤,其特征是9号和22号染色体易位t(9:22)(q34:q11),并形成BCR/ABL融合基因。BCR/ABL融合基因编码的BCR/ABL融合蛋白具有组成型酪氨酸激酶活性,激活下游一系列的信号通路,从而促进CML细胞增殖。伊马替尼(Imatinib,IM)等酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)的问世,极大地改善了CML患者的生存和预后。然而,随着临床上TKI的广泛应用,部分患者却出现了治疗效果不佳和耐药现象,因此探索CML进展的具体机制和新的治疗靶点具有重要意义。脯氨酸代谢在肿瘤代谢重编程中起重要作用,并与肿瘤细胞中ATP、蛋白质和核苷酸的合成以及氧化还原稳态有关。吡咯啉-5-羧酸还原酶1(Pyrroline-5-carboxylate reductase,PYCR1)作为脯氨酸生物合成重要的关键酶,与多种实体肿瘤的进展密切相关,已被认为是抗癌药物开发的潜在靶点,但是PYCR1在CML中的研究尚未见报道。目的:本研究旨在探究PYCR1对CML细胞生物学表型的影响及其作用的机制,为探索CML治疗的新靶点、新思路提供理论和实验基础。方法:1.采用生物信息学方法分析GEO、TCGA等数据库CML细胞中PYCR1的表达水平,然后收集临床样本分离单个核细胞,通过RT-q PCR检测PYCR1 m RNA的实际表达水平。2.通过慢病毒转染技术,构建沉默和过表达PYCR1的CML细胞稳转株;采用RT-q PCR和Western blot检测转染的效果;通过CCK-8、流式细胞术、Transwell、细胞毒实验检测沉默和过表达PYCR1对CML细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移、伊马替尼敏感性的影响。3.采用Western blot检测沉默PYCR1对BCR-ABL通路的影响;通过RNA-seq筛选沉默PYCR1后的差异表达基因和影响的相关通路;进一步通过RT-q PCR验证RNA-seq中所鉴定相关通路的基因表达水平;最后利用流式细胞术检测沉默PYCR1对CML细胞线粒体ROS水平的影响。结果:***数据库分析结果表明,PYCR1在健康人、CML慢性期和CML急变期的表达依次上调,且在CML患者骨髓干、祖细胞中的表达显著高于正常人。在TCGA数据库中的泛癌分析也显示PYCR1在大多数肿瘤中高表达;进一步临床样本验证CML病人中的PYCR1 m RNA的表达,结果显示PYCR1呈现高表达的水平。2.成功构建沉默和过表达PYCR1的CML细胞稳转株。沉默PYCR1可抑制CML细胞增殖、迁移,促进细胞凋亡、细胞周期阻滞于G1期,并增强CML细胞对伊马替尼的敏感性;过表达PYCR1可促进CML细胞增殖、迁移和细胞周期G1期向S期的转变,抑制CML细胞凋亡和对伊马替尼的敏感性。3.沉默PYCR1可抑制BCR-ABL及其下游的Stat5、Crkl信号通路。转录组测序分析发现,沉默PYCR1可抑制CML细胞中三羧酸循环、氧化磷酸化等线粒体能量代谢通路,并诱导线粒体ROS水平升高。结论:PYCR1在CML中高表达,并且促进了CML细胞的增殖、迁移,抑制了CML细胞的凋亡和对伊马替尼的敏感性。抑制PYCR1的表达,可通过下调BCR-ABL下游信号通路、破坏线粒体能量代谢、诱导线粒体ROS水平升高等机制诱导CML细胞的凋亡,从而抑制CML的恶性表型。

关键词： 子痫前期   胎盘   水肿   炎性因子   脐带间充质干细胞   增殖分化  

摘要： 目的:子痫前期(Preeclampsia,PE)是一种以胎盘血流灌注不足引起缺血缺氧为重要发病基础的常见妊娠并发症。本实验通过对比观察PE及正常产妇胎盘组织中炎性因子(IL-2/4/6/10/17、TNF-α、INF-γ)水平及脐带间充质干细胞生物学特性的变化,探讨子痫前期宫内炎性微环境对子代脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)的生物学特性的影响,为临床改善子痫前期母胎健康提供参考。方法:1.试验分组及组织预处理:收集山西省妇幼保健院2021年10月至2022年10月生产的孕妇10例,分为PE组5例和健康对照组5例。三组孕妇均在剖宫产手术后立即采集脐带和胎盘组织,脐带进行UC-MSCs提取培养,胎盘组织冻存;***-MSCs的分离和培养:两组脐带组织均在采集后短时间内低温运送到实验室,在超净工作台下剔除脐带的被膜和血管后,将内部的华通氏胶组织分离出来,剪碎至1mm以下,采用组织贴壁法进行原代培养,细胞爬出至融合度达80%后消化传代,部分冻存,部分传代至P3代用于后续实验;***-MSCs的形态学:用倒置显微镜观察两组UC-MSCs的形态特征并拍照记录;***-MSCs的增殖能力:采用细胞计数法比较两组UC-MSCs增殖能力。用24孔板进行细胞增殖培养,种板48h后次日开始每天取三个孔进行细胞计数并取平均值,连续7天记录并绘制生长曲线;***-MSCs的迁移能力:采用细胞划线法比较两组UC-MSCs的迁移能力,并在不同时间点进行(0,6,12,24h)拍照记录,Image J软件进行分析比较;***-MSCs的分化能力:两组细胞进行成骨成脂诱导,21天后茜素红染色测定成骨情况,油红O染色测定成脂情况。用IPP图文软件分析其积光分光密度值(Integrated optical density,IOD);7.胎盘组织含水量的比较:通过干重法测定胎盘组织的含水量,以此指标衡量两组胎盘组织的水肿情况;8.胎盘组织炎性因子的表达水平:采用双抗体夹心法磁性微球流式免疫荧光技术检测胎盘组织中炎性因子的表达。磁珠表面包被IL-2/4/6/10/17、TNF-α、INF-γ捕获抗体,分别与样本中的相应因子特异性结合后再结合藻红蛋白标记的检测抗体,每种微球藻红蛋白通道的荧光强度与样本中对应抗原含量水平相关。通过流式细胞仪测定荧光强度,参照标准曲线,计算样本中相应因子的含量水平。结果:1.两组脐带组织肉眼观察和UC-MSCs镜下观察肉眼观察:正常组的脐带组织形状如绳索、表面光滑透明,切面少见华通氏胶组织水肿、血管扩张和血管内淤血现象;PE组的脐带组织形状多如扭曲绳索,切面见脐带组织明显水肿,华通氏胶呈透明、拉丝状态,血管明显扩张,常见较大淤血块。UC-MSCs镜下观察:正常组UC-MSCs在组织贴壁5-7天后相继爬出,细胞呈细长的小梭形,相互平行或漩涡状排列,细胞密度增加时细胞形态变细长,传代后的细胞以均一的长梭形细胞为主,呈漩涡状排列;PE组UC-MSCs在组织贴壁8-10天后缓慢爬出,细胞多相互分离并呈现分散分布,细胞形态呈多角形,胞体较大,增殖缓慢,传代后细胞胞体变大呈扁平状,排列较为紊乱,呈现老化状态,且细胞密度增长较为缓慢。2.两组UC-MSCs的增殖能力比较连续7天采用细胞计数法检测两组UC-MSCs的增殖能力。结果显示,正常组和PE组UC-MSCs生长曲线走势大致相同,均经过了潜伏期、指数生长期、停滞期,但PE组较正常组UC-MSCs整体增殖缓慢且提前进入停滞期。3.两组UC-MSCs的迁移能力比较倒置显微镜拍照并用Image J软件测量细胞划痕的面积发现,PE组UC-MSCs的迁移能力明显弱于正常组。4.两组UC-MSCs的分化能力比较两组UC-MSCs经成骨成脂诱导,均能观察到有矿化结节和脂滴形成,说明两组的UC-MSCs均具备成骨成脂分化能力;经IOD值测定,PE组成骨分化程度(2224.54±62.29)低于正常组成骨分化程度(5087.52±95.00),PE组成脂(8631.60±102.58)分化程度低于正常组成脂分化程度(13030.58±727.60),成骨成脂分化程度差异具有显著性(P<0.001)。5.两组胎盘组织含水量比较PE组胎盘组织的含水量(0.8540±0.019)明显高于正常组(0.8424±0.006),差异具有显著性(P<0.001),说明PE组胎盘组织存在水肿现象。6.两组胎盘组织炎性因子表达水平比较经流式测定两组胎盘组织炎性因子的含量水平发现,IL-2的含量PE组为1.65±0.13 pg/g,正常组为1.53±0.14 pg/g;IL-4的含量PE组为2.52±0.19 pg/g,正常组为2.49±0.51 pg

关键词： 热疗   实体瘤   系统性免疫炎症指数   预后  

摘要： 目的研究不同热疗条件对肺癌A549细胞、结肠癌HCT116细胞生物学行为的影响。探讨热疗对中晚期实体肿瘤患者炎性指标、凝血指标和预后营养指数(Prognostic Nutritional Index,PNI)的影响,并分析上述指标与患者预后的相关性。为中晚期恶性实体肿瘤综合治疗提供更多依据和选择。方法1基础研究:根据不同热处理温度(40℃、41℃、42℃、43℃、44℃)和时长(同一温度加热时长分别为30min、60min、90min)进行细胞实验分组,对照组为37℃(培养箱培养对应时长)。通过CCK-8法、克隆实验、伤口愈合实验、Transwell实验检测热疗对A549、HCT116细胞增殖和迁移的影响;蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测不同实验组HSP70、p53、PCNA、Bcl-2、Bax蛋白的表达水平。2临床研究:1)收集我院经治的74例中晚期实体肿瘤患者的临床资料,根据是否应用热疗分为热疗组和非热疗组,比较两组患者6个月无进展生存(Progression-Free-Survival,PFS)率、炎性指标[淋巴细胞计数(Total Lymphocyte Count,TLC)、血小板与淋巴细胞比值(Platelet to Lymphocyte Ratio,PLR)、中性粒细胞与淋巴细胞比值(Neutrophil to Lymphocyte Ratio,NLR)、淋巴细胞与单核细胞计数比值(Lymphocyte to Monocyte Ratio,LMR)、系统免疫炎症指数(Systemic Immune-inflammation Index,SII)]、凝血指标[活化部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time,APTT)、纤维蛋白原(Fibrinogen,FIB)、凝血酶原时间(Prothrombin Time,PT)、凝血酶时间(Thrombin Time,TT)、D-二聚体]及PNI的差异;2)根据患者治疗结束后6个月内疾病是否进展,将热疗组分为疾病进展组和疾病控制组,分析两组患者治疗前血液学炎性指标、凝血指标及PNI的差异,并对有意义的指标SII进行受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲线分析,进一步采用Logistics回归分析SII与6个月PFS的关系。结果1基础研究结果:除应用40℃热处理30 min的A549细胞实验组外,其余各实验组细胞存活率均显著低于对照组(P<0.05);两种细胞实验组的克隆形成率、迁移率显著低于对照组(P<0.05);两种细胞各实验组HSP70、p53、Bax的蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05),PCNA和Bcl-2的蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05),上述细胞相关蛋白的表达呈温度依赖性。2临床研究结果:1)热疗组6个月PFS率、TLC显著高于非热疗组,PLR、SII、APTT显著低于非热疗组,均具有统计学差异(P<0.05);余指标无统计学差异(P>0.05)。2)热疗治疗前疾病进展组SII值显著高于疾病控制组(P<0.05),余指标无统计学差异(P>0.05),ROC曲线分析显示SII对预后有一定预测价值。Logistics回归分析显示热疗前SII值每增加1,疾病进展发生率增加1.007倍。结论1热疗的抗肿瘤作用机制可能与抑制A549、HCT116细胞的增殖和迁移,促进HSP70、p53和Bax的蛋白表达,降低PCNA和Bcl-2的蛋白表达有关。2热疗能够改善中晚期实体肿瘤患者预后相关血液学指标TLC、PLR、SII、APTT,提高6个月PFS率。SII对热疗治疗中晚期实体肿瘤患者的预后具有一定的预测功能,出现明显升高时,提示疾病进展风险可能性大,预后较差。图 13 幅;表 9 个;参 153 篇。

摘要： 随着医学教育的改革和发展，如何培养医学生的基础学科核心素养已成为医学教育需要探讨的问题。医学细胞生物学是医学专业中的重要基础学科之一，其核心素养涉及基础学科知识和实践技能等多个方面。本文以医学细胞生物学为例，针对医学专业背景的学生，如何培养其基础学科的核心素养，提出了以下几点建议：一是，加强基础学科教育，提高医学生的细胞生物学知识和实践技能；二是，注重医学生综合素质的培养，培养学生的创新思维和团队合作能力；三是，加强实践教学，让学生在实践中掌握医学细胞生物学知识和技能。通过以上建议，可以有效提高医学专业学生的基础学科核心素养，为医学教育的发展和进步做出贡献。

关键词： 富含亮氨酸重复激酶2   Ⅱ型P21活化激酶   蛋白相互作用   荧光共振能量转移   线粒体蛋白共定位分析  

摘要： 目的:本研究以富含亮氨酸重复激酶2(Leucine-rich repeat kinase 2,LRRK2)蛋白及其相互作用蛋白质分子(PAK5、PAK6)为研究对象,从细胞生物学角度阐明LRRK2蛋白与PAKs蛋白的相互作用机制及其内在联系,为了解LRRK2在帕金森病中的致病机制提供新的理论基础。方法:利用分子克隆技术制备本实验中所需要的重组蛋白表达质粒,包括带HA标签、GFP荧光标签的LRRK2全长蛋白,带Cy Pet荧光标签的LRRK2蛋白,带Myc标签、GFP、YPet荧光标签的PAK5、PAK6蛋白,通过转染在哺乳动物细胞系(HEK293T)中瞬时表达蛋白。利用荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)检测LRRK2与PAKs蛋白的相互作用及其相互作用程度。通过蛋白免疫印迹检测蛋白表达情况并探究其激酶活性变化。利用线粒体红色荧光探针检测二者在线粒体中的定位情况。结果:FRET结果显示,LRRK2与PAK6及PAK5在细胞中会发生相互作用,与野生型相比,LRRK2的Roc结构域的致病突变和保护突变会增强其与PAK5、PAK6的相互作用,差异具有统计学意义(P<0.05)。蛋白免疫印迹结果显示LRRK2与PAKs在HEK293T细胞中共表达后对PAKs的磷酸化水平没有显著影响。过表达PAK5或PAK6对内源性LRRK2及过表达野生型LRRK2及LRRK2的磷酸化水平无明显影响,对过表达LRRK2的磷酸化水平有下降的趋势,对过表达LRRK2的磷酸化水平有升高的趋势。荧光探针染色后皮尔森相关系数分析显示,PAK6及LRRK2与线粒体共定位信号强于PAK5,二者在细胞中共表达后,LRRK2在细胞中的分布形态由弥散分布变为散在聚集性分布。过表达野生型LRRK2及R1398H、R1441H突变体增强了PAK5与线粒体的共定位荧光信号,而N1437H、R1441C突变体则对PAK5在线粒体中的定位没有明显改变,过表达LRRK2(野生型及突变体)对PAK6与线粒体的共定位荧光信号没有明显改变。结论:LRRK2可以和PAK6及PAK5在细胞中发生相互作用;二者在细胞中共表达会改变LRRK2在细胞中的分布形态;PAK6与LRRK2定位在线粒体上,PAK5在线粒体上没有明显定位;LRRK2的Roc结构域的致病突变和保护突变会增强其与PAK5、PAK6的相互作用,同时会改变PAK5在线粒体上的定位,对PAK6在线粒体上的定位没有明显改变。

关键词： 结直肠癌   循环肿瘤细胞   甲基化   miR-486-5p   miR-34c-5p  

摘要： 第一部分结直肠癌循环肿瘤细胞（CTC）分选捕获系统的建立目的:构建针对结直肠癌CTC的多功能高效纳米免疫脂质磁球,用于结直肠癌CTC的分选捕获及数量统计。方法:通过反向蒸发法制备Ep CAM（Ep CAM Magnetic liposome,EP-IML）和EGFR免疫脂质磁球（EGFR Magnetic liposome,EG-IML）,采用粒径电位分析仪、蛋白电泳仪、原子力显微镜、紫外分光光度仪、磁性能分析仪和X射线衍射仪等对构建的免疫脂质磁球系统进行分子结构和性能的表征,初步建立一套针对结直肠癌CTC分选捕获系统。结果:成功制备了EP-IML和EG-IML两种免疫脂质磁球;粒径分别为227.8±5.6 nm和200.8±7.2 nm,电位分别为30.3±2.7 m V和32.5±3.7 m V,免疫磁球在水溶液中分散均匀稳定（分布分散且不团聚）。此系统磁球表面抗体纯度较高,饱和磁化强度分别为26.7和49.2 Am2/Kg,具备FeO磁性颗粒的结晶性能。结直肠癌细胞毒性实验结果显示该磁球系统细胞毒性较低,生物相容性好,能达到临床使用要求。结论:完成结直肠癌CTC的多功能高效纳米免疫脂质磁球的制备,并完成对其功能特性的表征,可用于结直肠癌CTC的分选捕获及数量鉴定。第二部分结直肠癌CTC分选捕获系统的精准和稳定性研究目的:开展循环肿瘤細胞高效磁分选捕获系统相关结直肠癌辅助诊断功能验证;并进行功能优化。方法:对建立的结直肠癌CTC分选捕获系统;选取部分有代表性的病例作为重点考察,分析捕获系统与临床病理的一致性。此外,进行此系统与Cell Search检测系统的比对,进一步证明检测体系的可行性和稳定性。结果:对建立的结直肠癌CTC分选捕获系统所用试剂用量和反应条件等作出优化和完善调试后,成功构建针对结直肠癌循环肿瘤细胞捕获系统:高精度、高稳定性的分选、捕获、鉴定系统。细胞实验显示EP-IML和EG-IML对结直肠癌细胞均有较高的捕获能力,捕获率可达90%以上。临床实验证实:EP-IML和EG-IML能有效地捕获结直肠癌患者外周血中的CTC,染色效果清晰可辨。与Cell Search检测系统进行比对,发现此检测体系有较强的精确度和更高的稳定性。结论:通过对建立的结直肠癌CTC分选捕获系统各项参数进行逐步优化,一系列综合验证后,此结直肠癌CTC分选捕获系统具有精确度高,稳定性好的特点。第三部分微小RNA mi R-486-5p/mi R-34c-5p在CRC单细胞和组织中的表达目的:临床入组结直肠癌样本,开展对外周血CTC及对应组织样本mi R-486-5p/mi R-34c-5p表达水平及甲基化水平的检测。方法:通过EP-IML和EG-IML磁分选获得的细胞分别提取DNA和RNA,通过荧光定量PCR及q MSP分别进行mi R-486-5p/mi R-34c-5p的表达水平及甲基化水平的检测。选取入组检测结直肠癌CTC患者的配对组织样本,提取DNA和RNA进行反转录后通过荧光定量PCR及q MSP分别进行mi R-486-5p/mi R-34c-5p的表达水平及甲基化水平的检测。检测与之对应的循环肿瘤细胞mi R-486-5p/mi R-34c-5p表达水平及甲基化水平的一致性,建立结直肠癌来源的组织层面与血液层面的一致性分析及引起动态差异的因素。结果:基于CTC分离获得的核酸样本,荧光定量PCR结果显示:来源于结直肠癌患者的mi R-486-5p/mi R-34c-5p的表达水平低于正常人群（P<0.05）;q MSP结果显示:来源于结直肠癌患者的mi R-486-5p/mi R-34c-5p的甲基化水平明显增高（P<0.05）。此外,与CTC对应的组织样本中mi R-486-5p/mi R-34c-5p表达水平及甲基化水平的检测结果显示,与CTC获得的mi R-486-5p/mi R-34c-5p表达水平及甲基化水平一致。结论:通过对来源于临床入组的结直肠癌样本中mi R-486-5p/mi R-34c-5p表达水平及甲基化水平的检测,来源于CTC与来源于组织样本的mi R-486-5p/mi R-34c-5p表达水平及甲基化水平变化趋势一致。第四部分微小RNA mi R-486-5p/mi R-34c-5p过表达及去甲基化对CRC细胞功能的影响目的:分别在mi R-486-5p/mi R-34c-5p过表达及去甲基化状态下对结直肠癌细胞增殖,侵袭,迁移以及凋亡的影响。方法:设置:对照组（NC组）,采用5-Aza进行去甲基化处理,构建mi R-486-5p/mi R-34c-5p的去甲基化组（5-Aza组）,通过慢病毒构建mi R-486-5p/mi R-34c-5p过表达组（mimics组）。在SW480和LOVO结直肠癌

关键词： Schlafen3   内皮祖细胞   增殖   迁移   周期蛋白D1  

摘要： 1目的研究斯拉芬3(Schlafen3,Slfn3)对内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)迁移,增殖等生物学功能的影响及机制。2方法离体培养小鼠脾源EPCs,利用免疫荧光检测Slfn3在小鼠脾源EPCs的表达和定位。通过过表达及RNA干扰的方法过表达及沉默EPCs中的Slfn3基因,将细胞分为五个组:control、Ad-control、Ad-Slfn3、sh RNA-control、sh RNA-Slfn3。在转染48小时后,分别用CCK-8检测细胞增殖情况、transwell小室及流式细胞术检测Slfn3基因表达的改变对EPCs迁移及周期的影响。通过q RT-PCR对CDK2、p27kip1、PCNA、Rb、Cyclin D1的m RNA表达水平进行检测,进一步明确Slfn3调控EPCs生物学功能可能的作用机制。3结果1.成功分离培养小鼠脾源EPCs。用FITC-UEA-I和Dil-Ac-LDL进行鉴定,激光共聚焦结果提示,同时摄取Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-I的细胞占细胞总数79.3%。流式细胞术结果提示细胞CD34阳性表达(33.55±0.35)%、CD133阳性表达(14.81±1.12)%、FLK-1阳性表达(16.48±1.48)%,故分离的小鼠脾源细胞被鉴定为内皮祖细胞。2成功构建小鼠Ad-Slfn3重组腺病毒载体及小鼠sh RNA-Slfn3重组腺病毒载体,并将其成功感染EPCs,其在EPCs中的中的转染效率分别为(90.64±2.08)%、(91.64±1.98)%。3.免疫荧光共定位结果提示,Slfn3在原代EPCs中表达,主要定位在EPCs的细胞质中,在细胞核中也有少量定位。***-8法、transwell小室结果提示,在EPCs中过表达Slfn3抑制EPCs的增殖及迁移(P<0.05),而在EPCs沉默Slfn3的表达,促进EPCs的增殖及迁移(P<0.05)。5.细胞周期结果显示,与Ad-control组相比,Ad-Slfn3增加了G1期EPCs的比例,而与sh RNA-control组相比,sh RNA-Slfn3减少了G1期EPCs的比例。6.通过q RT-PCR检测CDK2、p27kip1、PCNA、Rb、Cyclin D1的m RNA表达水平,结果提示Ad-Slfn3转染可显著降低cyclin D1 m RNA表达(P<0.05),sh RNA-Slfn3转染显著增加cyclin D1 m RNA表达(P<0.05),CDK2、p27kip1、PCNA、Rb的m RNA表达在各组之间无明显差异(P>0.05)。通过Western blot分析各组细胞cyclin D1的表达水平,结果显示Ad-Slfn3转染可显着降低cyclin D1蛋白水平的表达(P<0.05),与之相反,与对照组相比,sh RNA-Slfn3转染显著增加了cyclin D1蛋白水平的表达(P<0.05)。4结论沉默Slfn3的表达显著促进EPCs的增殖、迁移;反之,过表达Slfn3,则抑制EPCs的增殖、迁移,且EPCs被停滞在细胞周期的G1期,其机制可能与调控cyclin D1的表达有关。

关键词： miR-485-5p   MFGE8   膀胱癌  

摘要： 背景和目的:膀胱癌(Bladder cancer,BC)是泌尿系统最常见恶性肿瘤之一,近年来发病率逐渐升高。虽然初诊患者中约75%为非肌层浸润性尿路上皮癌,但因其具有高复发特点,且随着膀胱癌的复发,恶性程度逐渐进展。当前膀胱癌综合治疗取得了一定疗效,但对于浸润性、高级别、分期晚的膀胱癌患者预后仍较差,肿瘤特异性死亡率仍较高。目前认为肿瘤相关基因的研究对于肿瘤的诊治非常重要,大部分肿瘤已经有靶向药物用于临床,但膀胱癌目前仍没有非常合适的靶向药物。故对膀胱癌基因靶点的研究亟待加强。目前在恶性肿瘤的研究中,肿瘤的发生被认为与多种基因的异常表达密切相关,抑癌基因和促癌基因在肿瘤的发展中扮演着重要的角色,对肿瘤相关基因的研究已逐渐成为肿瘤治疗领域的前沿。Micro RNA是一种长约22个核苷酸的短链非编码RNA分子,可与信使RNA的3’非翻译区互补结合,通过靶向调节m RNA的翻译和降解来调控基因表达,发挥着抑癌基因或促癌基因的作用。研究显示,miR-485-5p参与多种肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭,与肿瘤的发生发展密切相关,并证实其在肿瘤中低表达,发挥抑癌基因作用。但是,miR-485-5p在卡波西肉瘤患者血清和卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染细胞中表达升高,对细胞的增殖、迁移等起促进作用。可见miR-485-5p在不同肿瘤中的表达不同,发挥作用不同。目前,miR-485-5p在膀胱癌中的作用及分子机制不明确。研究表明,MFGE8可以增强巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬和清除。MFGE8是否是miR-485-5p的靶基因,是否影响膀胱癌发生、发展,目前暂不明确。本课题研究miR-485-5p对膀胱癌增殖、迁移等生物学行为的影响,证实MFGE8作为miR-485-5p的靶基因之一参与膀胱癌的发生、发展,并阐述其分子机制。方法:1.通过qRT-PCR检测16对膀胱癌及癌旁组织中miR-485-5p的表达水平。2.通过qRT-PCR检测膀胱癌细胞(T24、EJ、J82、5637、UMUC-3)及膀胱上皮永生细胞(SV-HUC-1)中miR-485-5p表达水平,并选取miR-485-5p表达最低的2个膀胱癌细胞系(T24、EJ)进行过表达、选择表达相对较高的2个膀胱癌细胞系(5637、UMUC-3)进行抑制表达以开展后续实验。3.过表达和敲减膀胱癌细胞中miR-485-5p,并检测miR-485-5p表达情况。利用CCK-8实验观察细胞的生长曲线,通过平板克隆实验检测细胞集落形成能力,Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力,并通过Western Blot实验检测与细胞凋亡相关蛋白的表达。4.通过miRBase、Target Scan和miRanda数据库筛选miR-485-5p潜在的靶基因:MFGE8。双荧光素酶实验验证miR-485-5p与MFGE8的靶向关系。过表达和敲减膀胱癌细胞miR-485-5p,WB实验检测MFGE8蛋白水平变化。5.T24及EJ转染MFGE8过表达质粒,5637及UMUC-3转染siMFGE8,WB实验检测MFGE8蛋白水平变化。***-485-5p与MFGE8共转染实验:CCK-8实验观察细胞的生长曲线,通过平板克隆实验检测细胞集落形成能力,Transwell细胞迁移实验来观察细胞的迁移能力,并通过WB实验检测与细胞凋亡相关蛋白的表达。结果:1.完成16对膀胱癌与癌旁组织miR-485-5p的qRT-PCR检测,发现miR-485-5p在膀胱癌中较相对应的癌旁组织表达明显降低。***-485-5p在膀胱癌细胞系(5637、UMUC-3、J82、EJ、T24)中表达较正常膀胱上皮细胞系(SV-HUC-1)明显降低。3.T24及EJ膀胱癌细胞转染miR-485-5p mimic,膀胱癌细胞miR-485-5p表达量明显升高,进行功能实验发现膀胱癌细胞增殖、迁移能力减弱;5637及U MUC-3膀胱癌细胞转染miR-485-5p inhibitor,miR-485-5p表达明显下降,进行功能实验发现膀胱癌细胞增殖、迁移能力增强。进行WB实验发现转染miR-485-5p mimic的细胞Bcl2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高;转染miR-485-5p inhi bitor的细胞Bcl2蛋白表达升高,Bax蛋白表达降低。4.双荧光素酶实验验证了miR-485-5p与MFGE8的靶向关系,T24及EJ膀胱癌细胞转染miR-485-5p mimic,WB检测MFGE8蛋白水平降低,5637及UMUC-3膀胱癌细胞转染miR-485-5p inhibitor,WB实验检测MFGE8蛋白水平升高。5.T24及EJ细胞转染MFGE8过表达质粒,Western Blot检测MFGE8蛋白水平升高,5637及UMUC-3转染M