关键词:
IL-35
滋养细胞
自噬
低氧饥饿
妊娠结局
摘要:
目的:在妊娠早期(孕期<12周),胎盘内无明显的血液流动,导致胚胎氧气、营养供应缺乏。因此,胎盘在早期形成过程中处于一个生理性低氧、营养物质缺乏的环境中。作为胎盘组成的重要部分,绒毛外滋养细胞(Extravillous trophoblast,EVT)需要积极扩张,侵入子宫蜕膜组织,破坏其平滑肌层,重塑母体螺旋动脉,形成血管网络,创造一个低阻力和高流量的子宫胎盘循环模式,才能够有效地进行气体和营养物质交换,为胚胎创造最佳的生长发育条件。然而,在如此恶劣的生存条件下,滋养细胞要在妊娠早期发挥此类作用,就需要有适应这种压力的机制。自噬(Autophagy)是一种细胞生存策略,它允许细胞克服饥饿、缺氧、病毒感染等各种应激因素,是细胞内一个关键的分解代谢过程,为自身的存活提供能量。因此,在恶劣环境下滋养细胞通过增强自噬来避免凋亡,是滋养细胞应对生存压力的一种方式。白细胞介素-35(Interleukin-35,IL-35)是近年发现的IL-12家族中的一种细胞因子,由IL-12亚基α链(P35)和IL-27亚基EB病毒诱导基因3(EBI3)β链组成。我们前期研究发现IL-35在人早期滋养层细胞中呈组成性高表达,妊娠早期外周血中高水平的IL-35,可诱导B细胞转化为IL-35+Breg细胞,参与妊娠期外周免疫耐受的调节,是维持正常妊娠的关键角色。但滋养细胞来源的IL-35对自身生物学功能有何影响?目前尚无文献报道。在妊娠早期低氧饥饿的环境下,是否可通过自噬促进胚胎的生长发育?IL-35对滋养细胞生物学行为有何作用?均有待于进一步的研究证实。为解决上述科学问题,本研究深入探讨了在低氧饥饿条件下IL-35通过促进自噬对滋养细胞生物学功能影响的机制及相关信号通路,为早期治疗及预防不良妊娠结局提供了新靶点与新思路。方法:1.利用qRT-PCR方法检测在常氧培养条件(5%CO2,37℃,20%O2)与低氧饥饿条件(5%CO2,37℃,2%O2)下滋养细胞中IL-35及其受体gp130、IL-12Rβ2的表达水平。2.利用EdU、CCK8实验以及Transwell实验检测在低氧饥饿条件下IL-35对滋养细胞增殖、迁移、侵袭功能的影响。3.采用流式细胞术检测在低氧饥饿条件下IL-35对滋养细胞周期及凋亡的影响。4.收集在低氧饥饿条件下外源性IL-35干预后的滋养细胞上清,与脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)细胞共培养,观察在低氧饥饿条件下IL-35对HUVEC细胞血管生成能力的影响。5.采用MDC染色及Western blotting实验检测在低氧饥饿条件下IL-35对滋养细胞自噬水平的影响。6.利用CCK8、Western blotting实验筛选自噬抑制剂(3-MA)作用于滋养细胞的浓度。7.通过3-MA阻断自噬后,用CCK8、流式细胞术检测阻断自噬后IL-35对滋养细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。8.采用Western blotting实验检测在低氧饥饿条件下IL-35对滋养细胞mTOR-PI3K-AKT信号通路的影响。结果:1.四种滋养细胞系HTR-8/SVneo、JAR、JEG3、BEWO均可表达IL-35的亚基P35与 EBI3。2.在低氧饥饿条件下IL-35受体gp130、IL-12Rβ2表达上调,但IL-35的表达水平未见明显变化,提示在低氧饥饿条件下IL-35对滋养细胞的作用更敏感。3.低氧饥饿条件下,可显著抑制滋养细胞的增殖能力,而IL-35则有效促进滋养细胞增殖,扭转低氧饥饿导致的细胞周期G1期阻滞,促进细胞进入S期,抑制细胞凋亡,与此同时,IL-35可以上调HTR-8/SVneo与JAR细胞促增殖分子CDK2、CyclinE1、Bcl-2的表达,下调抑制分子P27、Bax、cleaved caspase3蛋白水平的表达。4.在低氧饥饿条件下,滋养细胞穿过基质胶的能力下降,迁移、侵袭功能被抑制,而IL-35可以逆转这种作用。5.在低氧饥饿条件下,IL-35可以显著促进HUVEC细胞血管生成,增强其成管能力,调节滋养细胞与血管内皮细胞之间的细胞-细胞通信,促进胎盘微血管网络的形成。6.在低氧饥饿条件下,IL-35可以增强滋养细胞自噬,利用3-MA抑制自噬后,IL-35 对滋养细胞的保护能力减弱,细胞增殖受到抑制,凋亡率明显增加。7.通过Western blotting实验证明了在低氧饥饿条件下,IL-35可能通过下调p-mTOR、P13K、p-AKT蛋白的磷酸化水平促进滋养细胞自噬。结论:1.本研究证明IL-35在滋养细胞系中高表达。在妊娠早期低氧饥饿的条件下,滋养细胞可通过IL-35自分泌的方式促进自身的增殖、迁移、侵袭能力,并作用于血管内皮细胞,促进螺旋动脉