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关键词： PKMYT1   乳腺癌   细胞增殖   生物信息学分析   生物学行为  

摘要： 目的通过生物信息学分析预测PKMYT1在乳腺癌中的表达情况以及对乳腺癌生物学行为的影响,综合临床相关性分析、GSEA功能富集分析及生存分析探索PKMYT1在乳腺癌中发挥的作用及对乳腺癌发生发展的影响。且通过调节PKMYT1的表达探究其对乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法1.生物信息学分析:利用TCGA、GEPIA 2以及TIMER2.0等多种生物信息学分析数据库研究PKMYT1在乳腺癌患者体内的表达水平,并且分析了与PKMYT1表达有关的临床特征相关性以及功能富集等情况。利用Cancersea数据库预测PKMYT1对乳腺癌生物学行为的影响,且根据Kaplan-Meier Plotter数据库的生存分析预测PKMYT1的表达与乳腺癌患者预后的关系。通过PINA数据库分析PKMYT1蛋白互作网络为了解其在乳腺癌进展中的作用机制及与其相关的癌症驱动靶点及药物靶点的预测。2.经实时荧光定量q RT-PCT实验检测PKMYT1在一种人类乳腺上皮细胞系MCF10A和四种人类乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC1937以及四种小鼠乳腺癌细胞系C127、4T1、EMT6、E0771中的相对表达水平。3.通过RNA干扰技术—脂质体转染法,将特异性的si-RNA和阴性对照序列si-Negative Control转染到MCF-7和MDA-MB-231细胞中,从而构建出具有特定功能的si-PKMYT1和si-NC细胞组,以实现对PKMYT1基因有效表达的抑制。4.通过q RT-PCR实验,验证si-PKMYT1的转染效果。5.通过Western Blot技术验证PKMYT1在转染MCF-7和MDA-MB-231后蛋白表达水平的变化。*** Counting Kit细胞实验探究了PKMYT1对乳腺癌细胞增殖功能的影响。7.经平板克隆实验探究PKMYT1对乳腺癌细胞集落形成和增殖能力的影响。8.通过划痕损伤实验,检测转染后细胞迁移愈合能力的变化。***细胞侵袭实验,验证转染si-RNA后对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。10.流式细胞术实验检测降低PKMYT1的表达对MCF-7、MDA-MB-231细胞其细胞周期的变化。11.经流式细胞术研究PKMYT1在乳腺癌细胞中对细胞凋亡的影响。12.使用SPSS25.0进行数据统计学分析。结果1.经生物信息学分析,PKMYT1在乳腺癌样本中的表达水平明显高于正常样本,P<0.001;对于同一个样本PKMYT1在癌组织中的表达远高于癌旁组织,P=<2e-16具有统计学差异;GEPIA2和TIMER2.0在线分析工具也进一步验证了PKMYT1在乳腺癌中的差异表达,结果表明,PKMYT1在乳腺癌样本中高表达。临床相关性分析发现,PKMYT1在乳腺癌中的表达与患者的年龄、肿瘤分期(Ⅰ～Ⅱ及Ⅰ～Ⅲ)以及原发肿瘤大小(T,T1～2、T1～3、T1～4)有显著相关性,P<0.05具有统计学意义,而与性别、远处移动(M)和淋巴结转移(N)无相关性,P>0.05无统计学差异;经GSEA功能富集分析发现PKMYT1高表达时与细胞周期、DNA复制、同源重组等功能相关性较高,说明PKMYT1在乳腺癌中可能对癌细胞的生长、增殖相关,以上P值均小于0.05,具有统计学意义;通过Cancersea数据库预测PKMYT1对乳腺癌生物学行为的影响,发现PKMYT1在乳腺癌发生发展中对其细胞周期、DNA损伤及修复、增殖、侵袭、转移、EMT以及凋亡均有不同程度的影响,且呈正相关关系;Kaplan-Meier Plotter数据库分析研究发现HR>1表明PKMYT1是乳腺癌的高风险因素,且PKMYT1的高表达会导致乳腺癌患者预后不良。蛋白互作网络分析发现与PKMYT1显著相关的蛋白在乳腺癌的发生发展过程中与细胞周期及细胞增殖机制密切相关,且发现PKMYT1相关的肿瘤药物靶点包括:MAPK10、MAPK8、CDK1、BCL2和PLK1。2.q RT-PCR结果分析,PKMYT1在人乳腺癌细胞系中的表达水平由高到低依次为MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和HCC1937,在小鼠乳腺癌细胞系中由高到低依次为4T1、E0771、C127和EMT6。3.在检测转染效率的实验中发现,与Control组和si-NC组比较,转染si-PKMYT1-2组中PKMYT1的表达水平显著降低P<0.05。4.经Western Blot实验显示PKMYT1在si-PKMYT1-2组中的蛋白表达水平显著降低P<0.05。*** Counting Kit细胞实验结果发现,与MCF-7、MDA-MB-231两种细胞的Control组及si-NC细胞组相比,转染si-PKMYT1-2细胞组的细胞增殖能力被显

关键词： 医学细胞生物学   教学内容   教学改革  

摘要： 随着医学的进步和发展，其专业化程度也逐步提升。原有存在的一些传统的教学模式存在一定的弊端，不能适应现代医学发展的步伐，在“新医科”以及信息化的时代背景之下，提升医学相关专业的教学质量尤为重要。本文将从教学内容的优化、教学方法和教学手段的改革、改革成效三方面展开探讨，针对医学细胞生物学的教学设计及改革进行分析论述。

关键词： 羽扇豆醇   鼻咽癌   放射   顺铂   凋亡  

摘要： 目的:探讨羽扇豆醇对人鼻咽癌CNE2细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、周期及对放、化疗敏感性的影响,同时探讨其凋亡机制。方法:选用人鼻咽癌低分化鳞状细胞株CNE2细胞进行实验。CCK-8法检测羽扇豆醇对CNE2细胞增殖的影响以及羽扇豆醇联合顺铂对CNE2细胞的增殖抑制作用有无增强;细胞划痕、Transwell实验、流式细胞术分别用于检测羽扇豆醇对CNE2细胞迁移、侵袭、凋亡及周期的影响;平板细胞克隆形成实验用于检测羽扇豆醇联合X线放射处理对CNE2细胞克隆形成能力的影响;Western bloting法检测羽扇豆醇对CNE2细胞凋亡信号通路中关键蛋白Bcl-2、Bax及Cleaved caspase-3的影响,进而探究羽扇豆醇的抗肿瘤机制。结果:羽扇豆醇呈药物浓度和时间依赖性地抑制CNE2细胞的增殖,选取羽扇豆醇40、60、80μmol/L用于后续实验。羽扇豆醇显著降低了CNE2细胞的迁移、侵袭能力。羽扇豆醇处理后的CNE2细胞出现典型的凋亡特征,G1期延长,S期、G2期缩短。羽扇豆醇提高了顺铂或X线放射对CNE2细胞增殖及克隆形成的抑制能力,同时引起CNE2细胞中Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达下调(所有实验结果均P<0.05或P<0.0001,差异具有统计学意义)。结论:1、羽扇豆醇可显著抑制鼻咽癌CNE2细胞的增殖、迁移、侵袭能力,诱导CNE2细胞的凋亡,引起细胞周期阻滞在G1期;2、羽扇豆醇可明显提高顺铂对鼻咽癌CNE2细胞的化疗敏感性及X射线对CNE2细胞的放疗敏感性。3、羽扇豆醇诱导CNE2细胞凋亡的发生可能与调控凋亡信号通路中凋亡蛋白Bax、凋亡启动因子Cleaved caspase-3升高及抗凋亡蛋白Bcl-2降低有关。

关键词： 胶质瘤   泛癌   LAMC1基因   细胞生物学   生物信息学   低氧诱导因子1α  

摘要： 【目的】　　1.分析公共数据库中泛癌组织中LAMC1基因表达、预后及临床病理相关性。　　2.生物信息学预测胶质瘤中LAMC1的潜在的生物学功能和作用机制。　　3.分析LAMC1基因对胶质瘤细胞株生物学功能的影响。　　4.探索低氧诱导因子1α（HIF-1α）对LAMC1基因表达的调控作用。　　【方法】　　1.采用生物信息学技术检测GTEx、CCLE、TCGA和CGGA泛癌数据集中LAMC1mRNA表达及其与预后的关系，并以胶质瘤为例来验证LAMC1基因表达与临床病理参数的相关性。　　2.采用生物信息学技术分别预测LAMC1基因表达与肿瘤突变负荷、肿瘤微卫星不稳定性、错配修复基因突变、DNA甲基转移酶的相关性，LAMC1表达与免疫的关系，并进行基因集富集分析。　　3.利用临床样本组织芯片和免疫组化方法检测胶质瘤组织中LAMC1蛋白的表达并分析其与预后的相关性。　　4.采用qRT-PCR、Westernblot和免疫荧光检测LAMC1基因在U87MG、U251、A172和Hs683胶质瘤细胞株中的表达情况。　　5.以LAMC1基因高表达的Hs683为对象，采用RNAi技术敲减其表达。　　6.利用CCK-8、损伤划痕修复实验、transwell法检测敲减Hs683细胞LAMC1表达后，其细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化。　　7.生物信息学预测HIF-1α与肿瘤进展的关联性，分析HIF-1α及与LAMC1结合的可能性。　　8.物理性低氧（2%O2）诱导HIF-1α表达和YC-1（HIF-1α抑制剂）抑制HIF-1α表达对胶质瘤细胞株LAMC1蛋白表达的影响;采用双荧光素酶报告基因检测HIF-1α与LAMC1启动子的结合和活性的调控作用。　　【结果】　　1.基于多个国内外公开数据库结果，多种TCGA肿瘤中癌与正常组织相比，LAMC1基因表达明显升高，并提示预后不良。　　2.生物信息学技术预测结果显示LAMC1与多种免疫调节基因表达正相关。　　3.与正常脑组织相比，临床胶质瘤组织中LAMC1蛋白高表达，并与预后不良显著正相关。　　4.在U87MG、U251、A172和Hs683四种胶质瘤细胞株中，Hs683细胞株具有最高水平的LAMC1表达。　　5.构建了LAMC1敲减质粒并包装了相应慢病毒颗粒，筛选了具有敲减效应的RNAi靶点，并顺利获得LAMC1表达下降的Hs683细胞株。　　***-8、损伤划痕修复实验、transwell法证实LAMC1基因敲减后抑制胶质瘤细胞系Hs683的增殖、迁移与侵袭。　　7.生物信息学分析表明，HIF-1α高表达与大多少TCGA肿瘤进展正相关，并与LAMC1水平存在正相关。　　8.生物信息学分析表明LAMC1基因启动子具有多个HIF-1α接合位点。　　***结果证实，缺氧微环境可诱导胶质瘤Hs683和U251细胞表达HIF-1α和LAMC1，并且两者都能被HIF-1α抑制剂（YC-1）所抑制。　　10.双荧光素酶报告基因检测HIF-1α可激活LAMC1基因启动子活性。　　【结论】　　***1基因在包括胶质瘤在内的泛癌中普遍高表达。　　***1基因的高表达与胶质瘤患者高病理分级和不良预后正相关。　　3.敲低LAMC1基因抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力。　　4.缺氧微环境通过HIF-1α直接调控LAMC1基因表达而促进胶质瘤的临床进展。

关键词： 维奈托克   人脐带间充质干细胞   BCL-2基因   成骨分化  

摘要： 目的:探究BCL-2抑制剂维奈托克(venetoclax,ABT-199)治疗白血病诱导白血病细胞凋亡的同时,对骨髓微环境中间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的影响。方法:以人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)作为本研究对象,用含0、0.5、2.5、5、10、20和40μmol/L维奈托克的hUC-MSCs完全培养基分别培养hUC-MSCs 24h、48h、72h后,通过CCK-8法检测不同浓度维奈托克对hUC-MSCs细胞活力的影响,确定后期实验的最适宜浓度。最终确定维奈托克实验组的浓度,分别为0.5、2.5、5μmol/L,并设立对照组的浓度为0μmol/L。用流式细胞术检测hUC-MSCs细胞周期、细胞凋亡率;通过碱性磷酸酶染色检测各组成骨分化7天后碱性磷酸酶活性;茜素红染色检测各组成骨分化21天后钙结节的形成量;RT-qPCR法分别测定体外诱导成骨分化第7天、第14天各组BCL-2m RNA的表达情况。结果:***-8检测结果显示,与对照组(0μmol/L维奈托克)相比,0.5、2.5、5、10、20和40μmol/L维奈托克组作用下hUC-MSCs在24h、48h和72h后细胞活力均下降。且在48h时,hUC-MSCs细胞活力随药物浓度的增加下降更明显,表明维奈托克对hUC-MSCs平均在48h增殖抑制率最高(P<0.01)。2.细胞周期结果显示:维奈托克浓度为5μmol/L时,G0/G1期细胞占41.4333±1.283%,S期细胞占14.9333±0.7767%,G2/M期细胞占20.6±1.2124%。维奈托克使大部分hUC-MSCs处于G0/G1期,少部分hUC-MSCs处于S期、G2/M期。细胞凋亡结果示:随着维奈托克浓度的增大,hUC-MSCs凋亡率增大,与对照组对比差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。3.成骨分化7天后行碱性磷酸酶染色法检测结果提示,随着维奈托克浓度的增加阳性区域逐渐变小,且与对照组对比,差异具有统计学意义(P<0.01)。4.成骨分化21天后行茜素红染色检测结果表明,与对照组(0μmol/L维奈托克)相比,0.5、2.5、5μmol/L维奈托克实验组钙结节沉淀的阳性区域均降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。***-qPCR检测结果显示,与成骨组比较,低浓度组BCL-2基因表达量在第14天下降,差异无统计学意义(P>0.05),低浓度组在第7天BCL-2基因表达量下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。与成骨组比较,中、高浓度组在第7天、第14天BCL-2基因表达量均下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:1.维奈托克可影响hUC-MSCs增殖活力,及促进细胞凋亡,并使大部分hUCMSCs处于G0/G1期;2.维奈托克影响hUC-MSCs分化为成骨细胞能力;***-MSCs中有BCL-2基因的表达,维奈托克影响hUC-MSCs的增殖、分化与BCL-2基因的表达有一定相关性。

关键词： 二甲双胍   HIF-1a   糖酵解   胰腺癌  

摘要： [背景及目的]二甲双胍,作为2型糖尿病的一线用药,同时也是世界范围内最常见的处方药。它具有降糖,改善胰岛素抵抗,改善肥胖状态和改善衰老等作用。自从流行病学研究表明二甲双胍具有抗肿瘤特性,就引起了世界范围内的广泛关注。胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一,死亡率和转移率高,且对放化疗的敏感性低。缺氧是肿瘤微环境的特征之一,在胰腺癌中特别突出。研究表明缺氧与胰腺癌血管的新生、代谢的重建、早期的浸润转移有着明显的关联。HIF-1α(缺氧诱导因子-1)在胰腺癌中高水平表达,使肿瘤细胞对放化疗的敏感性降低,并表现出更强的增殖和迁移性。除此之外,HIF-1α还可以活化肿瘤细胞代谢相关的基因,从而激活糖酵解的过程。因此二甲双胍、胰腺癌和糖酵解之间可能存在一定关联。本实验是通过体外培养胰腺癌细胞系PANC-1、BXPC-3,研究二甲双胍对胰腺癌细胞生物学特性的影响,然后在进一步探究相关机制。[方法]1.我们体外培养人胰腺癌细胞株PANC-1、BXPC-3,使用0,5,10,15,20,40mmol/l的二甲双胍作用于这两种细胞系。24h,48h和72h后用CCK-8增殖实验,检测二甲双胍对细胞增殖能力的影响。获取细胞抑制率及半数抑制浓度(halfinhibition concentration,IC50)。2.使用现配置的20,40mmol/l二甲双胍培养基处理两种细胞,将未加二甲双胍处理的作为空白对照组,并采用划痕实验和Transwell小室实验,来测定二甲双胍对胰腺癌细胞迁移能力的影响。3.设置空白对照组、低浓度组(20mmol/l二甲双胍处理组)和高浓度组(40mmol/l二甲双胍处理组)。用Transwell小室实验来检测二甲双胍对胰腺癌细胞侵袭能力的影响。4.选用Td T-medinted Dutp Nick-End labelmg(TUNEL)方法来验证PANC-1、BXPC-3细胞经二甲双胍处理后凋亡能力的改变。5.用葡萄糖氧化酶的方法和MTT还原法来检测二甲双胍对胰腺癌细胞葡萄糖消耗量及乳酸生成量的影响。6.通过蛋白印迹法测定二甲双胍对胰腺癌细胞中HIF-1a(缺氧诱导因子-1)、GLUT1(葡萄糖转运蛋白)和LDH(乳酸脱氢酶蛋白)的影响。[结果]1.经二甲双胍处理后,胰腺癌细胞PANC-1、BXPC-3的增殖能力受到了抑制。这种抑制能力随着作用的二甲双胍浓度的增加而增强。故二甲双胍能明显抑制PANC-1、BXPC-3细胞的增殖,且具有浓度依赖性。***-1、BXPC-3细胞经20mmol/l,40mmol/l的二甲双胍处理后发现,未经二甲双胍处理组的细胞在划痕处愈合较快,24h后划痕愈合大于50%,经药物处理后伤口愈合较慢,且40mmol/l与20mmo/l处理组相比细胞愈合更慢。Transwell小室迁移实验显示未经二甲双胍处理组的穿膜细胞数量明显多于药物处理组,且高浓度组的穿膜细胞数量明显少于低浓度组。故二甲双胍能抑制PANC-1、BXPC-3细胞的迁移能力,并呈浓度依赖性。3.侵袭实验结果证明空白对照组的穿膜细胞数量明显高于药物处理组,且40mmol/l的药物处理组的穿膜细胞数量明显少于20mmol/l的二甲双胍处理组。因此,二甲双胍明显抑制PANC-1、BXPC-3细胞的体外侵袭能力,呈现浓度依赖性。4.凋亡实验显示PANC-1、BXPC-3细胞经二甲双胍处理24h后,在荧光显微镜下观察。与空白对照组相比,二甲双胍处理组的凋亡的细胞数明显增多,且高浓度组明显多于低浓度组。5.葡萄糖、乳酸检测试剂结果显示PANC-1、BXPC-3细胞经二甲双胍药物处理后,两种细胞对葡萄糖摄取量和乳酸的生成能量明显减少。40mmol/l二甲双胍处理的PANC-1、BXPC-3胰腺癌细胞的葡萄糖摄取量和乳酸生成量明显低于20mmol/l的二甲双胍处理组。证明二甲双胍可以抑制胰腺癌细胞的糖酵解能力,呈浓度依赖性。***结果显示PANC-1、BXPC-3细胞经二甲双胍药物处理后,其HIF-1a的表达量,GLUT1(葡萄糖转运蛋白)和LDH(乳酸脱氢酶)的蛋白表达量明显降低。40mmol/l的二甲双胍实验组HIF-1a、GLUT1和LDH蛋白的表达量明显低于20mmol/l的二甲双胍实验组。表明二甲双胍可以抑制HIF-1a蛋白、GLUT1(葡萄糖转运蛋白)和LDH(乳酸氢酶蛋白)的表达。[结论]二甲双胍对胰腺癌PANC-1、BXPC-3细胞的增殖,迁移和侵袭能力是抑制的,而对其凋亡能力是促进的。二甲双胍通过下调HIF-1a的表达影响糖酵解来影响胰腺癌的生物学行为。

关键词： 宫颈癌   E3泛素连接酶   AKT/mTOR通路   生物学功能   肿瘤细胞  

摘要： 研究背景　　宫颈癌是全球女性第四高发的恶性肿瘤，据全球肿瘤流行病学研究报道，每年约有五十七万人新诊断出患宫颈癌，其中约三十一万人因宫颈癌死亡。我国是宫颈癌的高发地之一，每年约新增十一万病例。宫颈癌的发生和发展比较迟缓，往往需要持续10-30年的时间，这给宫颈癌的筛查和防治提供了绝佳的时间窗口。目前治疗手段包括手术和放化疗，在早期宫颈癌中具有一定的疗效，但对晚期和复发性宫颈癌中作用比较有限。因此有必要开发一个新发肿瘤标志物，应用于宫颈癌的诊疗和预后中。Siah2是RINGE3泛素连接酶家族的主要成员，在DNA损伤调节、缺氧适应、凋亡、血管生成和细胞增殖等中发挥关键作用。Siah2可以单独或与其他蛋白质结合作为E3泛素连接酶发挥作用。它靶向调控多种蛋白底物以供泛素-蛋白酶体系统（UPS）降解，从而对许多细胞途径起调节作用。UPS紊乱会导致底物蛋白质水平异常，从而导致癌症发生。已知Siah2在多种肿瘤中表达上调并具有临床价值。本课题通过构建siah2敲低和过表达模型以及组织芯片染色，探究siah2在宫颈癌中表达情况及机制探讨。　　目的Siah2作为一种E3泛素连接酶，在多种恶性肿瘤中发挥促癌功能，但对其在宫颈癌中的作用研究的较少。本课题旨在探究siah2在宫颈癌中的表达情况及临床价值、对宫颈癌细胞系生物学功能的影响以及作用机制探讨。　　方法1.通过RNA干扰技术，敲低siah2在宫颈癌细胞Siha、C33a中的表达。2通过CCK-8、伤口愈合、平板克隆和Transwell实验，研究siah2对宫颈癌细胞生物学功能的影响。3.通过质粒转染使siah2过表达后进行免疫沉淀实验，检测GSK3β是否作为siah2的泛素化底物。4.在siah2过表达细胞中转染GSK3β过表达质粒，通过CCK-8、伤口愈合、平板克隆和Transwell实验研究其促癌作用。5.对宫颈癌患者的宫颈组织芯片进行免疫组化染色并积分，研究siah2表达与临床病理学参数的关系。　　结果***2敲低后宫颈癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力受到抑制。***2敲低后细胞凋亡蛋白Caspase3、Bax和Caspase9的表达水平显著增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平显著受抑，细胞的凋亡水平增加。***2敲低后N-cadherin、Vimentin和Snail1的表达水平显著受抑，E-cadherin表达水平显著增加，细胞上皮间充质转化(EMT)过程发生逆转。***2敲低后p-AKT和p-mTOR表达水平显著下降，说明siah2可能通过AKT信号通路参与细胞增殖和凋亡的调节。***2过表达显著促进了GSK3β的泛素化，证明siah2可以泛素化降解GSK3β。***3β可以拯救由siah2过表达引起的细胞增殖和侵袭增加，进一步证明了GSK3β为siah2的泛素化靶标。***2蛋白在siah2在宫颈炎、上皮内瘤变(CIN)、宫颈癌患者中表达逐渐增加，且siah2表达程度与宫颈癌分化程度有关，与患者的年龄、肿瘤直径、浸润深度、是否淋巴结转移无关。　　结论***2/GSK3β轴的下调可能通过抑制AKT/mTOR通路和逆转EMT进程来抑制宫颈癌细胞的生物学功能。***2宫颈癌患者组织中表达显著增加，且与肿瘤分化程度有关，可作为宫颈癌诊断的潜在蛋白标记物。

关键词： RPS15A基因   前列腺癌   生物学功能   顺铂   耐药性  

摘要： 【目的】前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是男性癌症疾病中最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在世界范围内高居老年男性泌尿生殖系统恶性肿瘤第1位及男性全身恶性肿瘤第2位。在我国,近年来PCa的发病率和死亡率都呈显著增加的趋势,其主要原因包括人口老龄化加剧及PCa早期诊断和有效治疗手段的欠缺等。许多PCa患者在初次就诊时就已经发现了转移,目前晚期转移性PCa的治疗以新型内分泌治疗为主,但内分泌治疗最终会导致PCa的去势抵抗性,治疗效果大大降低。化学治疗是治疗转移性去势抵抗性前列腺癌(Metastatic castration resistant prostate cancer,m CRPC)患者不可或缺的疗法,但大部分的m CRPC患者在治疗后期会产生耐药性而导致化疗失败。因此,研究克服化疗药物耐药性的方法对m CRPC患者具有重要意义。RPS15A属于核糖体蛋白质(ribosomal proteins,RPs)家族,其参与许多肿瘤的发生发展。大量研究发现,许多RPs家族蛋白能影响肿瘤的耐药性。顺铂(Cisplatin,DDP)主要通过诱导DNA损伤发挥作用,而RPs家族具备DNA修复等核糖体外功能,也有许多研究表明,多种RPs家族蛋白与肿瘤细胞产生DDP耐药性相关。本课题组前期研究已经发现,RPS15A在PCa细胞中呈高表达,RPS15A敲低能抑制PCa细胞DU145的增殖、侵袭等,促进细胞凋亡。因此,RPS15A可能与PCa细胞产生DDP耐药性有关。本课题拟在细胞水平上检测RPS15A过表达对PCa细胞DU145生物学功能的影响及探索RPS15A与PCa细胞产生DDP耐药性的相关性。【方法】1.通过RNA慢病毒载体转染实验构建RPS15A敲低和过表达的PCa细胞系DU145稳转株shRPS15A-DU145和oeRPS15A-DU145,通过荧光显微镜观察慢病毒转染效率,用荧光定量PCR和WB实验分别检测转染细胞中RPS15A的RNA和蛋白表达水平;2.通过平板克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测RPS15A过表达后对DU145细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响;通过流式细胞术检测RPS15A过表达DU145细胞的凋亡情况;3.通过CCK-8法检测shRPS15A-DU145、oeRPS15A-DU145及正常DU145细胞经DDP处理后的细胞存活率,计算半数抑制浓度及耐药指数,评价各细胞株对DDP耐药性的差异;4.通过平板克隆形成实验和流式细胞术检测RPS15A过表达及敲低后DU145细胞对DDP耐药性的影响;5.通过蛋白质印迹法(Western Blot,WB)实验检测shRPS15A-DU145、oeRPS15A-DU145及正常DU145细胞经DDP处理后凋亡蛋白的表达情况。【结果】***细胞系DU145在RNA慢病毒载体感染72h后,荧光显微镜观察可见shRPS15A-DU145组、oeRPS15A-DU145组和空载组细胞感染效率达80%以上,细胞生长良好;荧光定量PCR结果显示,shRPS15A-DU145组中RPS15A的m RNA表达量显著低于sh Ctrl-DU145组,oeRPS15A-DU145组中RPS15A的m RNA表达量明显高于oe Vec-DU145组(P<0.01);WB实验结果显示,shRPS15A-DU145组中RPS15A的蛋白表达水平相比sh Ctrl-DU145组得到了明显的抑制,oeRPS15A-DU145组相比oe Vec-DU145组RPS15A的蛋白表达水平上升;2.平板克隆形成实验结果显示,DU145细胞过表达RPS15A后,细胞克隆数及克隆形成率增加(P<0.05);细胞划痕实验结果表明,DU145细胞过表达RPS15A后,与对照组比较,细胞迁移率升高9%(P<0.01);Transwell侵袭实验结果表明,DU145细胞过表达RPS15A后,与对照组比较,细胞转移率升高16%(P<0.01);流式细胞术检测结果表明,DU145细胞过表达RPS15A后,相比对照组,细胞凋亡数减少(P<0.01);***-8法检测结果显示,shRPS15A-DU145、oeRPS15A-DU145及正常DU145细胞经DDP处理后,同等浓度下shRPS15A-DU145组的细胞存活率明显降低,半数抑制浓度和耐药指数也明显比oeRPS15A-DU145及正常DU145组细胞较低(P<0.01);4.平板克隆形成实验结果显示,用DDP处理后,shRPS15A-DU145组细胞克隆形成的数量及大小均明显不如oeRPS15A-DU145及空载组DU145细胞(P<0.01);5.流式细胞术检测结果表明,用DDP处理后,shRPS15A-DU145组细胞的早期

关键词： 膀胱癌   lncRNAs   细胞生物学   细胞周期   化疗  

摘要： 【目的】膀胱癌(BCa)发病率高且易于复发。在大多数情况下,晚期BCa患者5年生存率较低通常是由术后复发和耐药引起的。长链非编码RNA(lnc RNA)可以通过调节影响肿瘤发生的基因表达来参与许多生物学功能。一种新的lnc RNA LINC02321与膀胱癌预后密切相关。但LINC02321对肿瘤的影响及调控机制尚不清楚。研究目的是阐述LINC02321/RUVBL2信号轴在膀胱癌进展中的重要作用,开发LINC02321作为新的生物标志物在预测肿瘤进展和干预肿瘤治疗中的临床价值,为膀胱癌靶向药物的开发提供参考依据。【方法】1、使用生物信息学评测LINC02321在所有肿瘤的表达水平,分析LINC02321在膀胱癌组织中的表达水平及其与患者生存预后的关系。2、检测LINC02321在膀胱癌组织及膀胱癌细胞系中的表达水平。3、膀胱癌细胞中应用慢病毒载体感染技术及转染技术上调或下调LNC02321和RUVBL2的表达。4、利用CCK-8技术、菌落形成实验及流式细胞术分别用来研究LNC02321和RUVBL2的表达对肿瘤细胞增殖、菌落形成、细胞周期及顺铂敏感性的调控作用。5、RNA pulldown及质谱分析证实LINC02321和RUVBL2相互作用。通过蛋白印迹实验验证了LINC02321调控RUVBL2蛋白质的表达水平及蛋白的半衰期。6、裸鼠成瘤实验证实LINC02321/RUVBL2轴在体内调控膀胱癌细胞的生长和顺铂敏感性。【结果】1、LINC02321在膀胱癌中高表达,并与膀胱癌患者较短的总生存期和无病生存期正相关。LINC02321高表达和低表达组中的差异表达基因,在肿瘤相关通路中富集。LINC02321在膀胱癌细胞系UMUC3和RT112中表达水平较高,并主要分布在细胞核。2、在膀胱癌细胞株UMUC3和RT112中敲降LINC02321后,细胞的增殖和菌落形成受到抑制,细胞周期阻滞在G0/G1期。并且在敲降LINC02321后膀胱癌细胞对顺铂的敏感性增强。3、在膀胱癌细胞中LINC02321与RUVBL2蛋白直接结合,敲降和过表达LINC02321后不影响RUVBL2 m RNA水平,但下调或上调RUVBL2蛋白的表达水平,敲降LINC02321导致RUVBL2蛋白半衰期缩短。在膀胱癌中RUVBL2表达上调与患者较差的总生存期和无病生存期显著相关。4、在UMUC3和RT112细胞中,敲降LINC02321的基础上过表达RUVBL2一定程度上回复了LINC02321下调导致的膀胱癌细胞增殖抑制和细胞周期阻滞,并抑制了LINC02321下调导致的膀胱癌细胞对顺铂敏感性增强。5、通过裸鼠成瘤模型,敲降LINC02321的膀胱癌细胞成瘤体积和质量相较对照组显著减少,LINC02321敲降增强了体内膀胱癌细胞对顺铂的敏感性。【结论】我们证实了LINC02321/RUVBL2信号轴在膀胱癌增殖和顺铂敏感性中起重要作用。RUVBL2可能通过调控DNA修复参与膀胱癌细胞对顺铂的敏感性。顺铂耐药的BCa患者可能从RUVBL2抑制剂联合化疗中获益。LINC02321可能是评估肿瘤预后和干预癌症治疗的潜在靶点。

关键词： 间充质干细胞   CD200   生物学特性   免疫调节   急性移植物抗宿主病  

摘要： 目的：　　探讨高表达CD200人脐带来源间充质干细胞（humanumbilicalcordderivedmesenchymalstemcell，hUC-MSC）生物学特性及其治疗急性移植物抗宿主病（acutegraftversushostdisease，aGvHD）的作用。　　内容：　　1.培养鉴定hUC-MSC，流式细胞术分选CD200highhUC-MSC和CD200lowhUC-MSC细胞亚群;2.体外实验探讨CD200highhUC-MSC生物学特性和免疫调节功能;3.建立小鼠aGvHD模型，探讨CD200highhUC-MSC治疗aGvHD的疗效。　　方法：　　1.体外分离培养hUC-MSC，采用吉姆萨染色观察细胞形态、流式细胞术分析细胞表型、碱性磷酸酶（ALP）染色和油红O染色分别检测细胞的体外成骨和成脂分化能力，实时荧光定量PCR(qPCR)检测成骨和成脂关键转录因子的表达。　　2.流式细胞分选仪分选CD200highhUC-MSC和CD200lowhUC-MSC两群细胞，通过流式细胞术检测分选效率，Western印迹检测CD200在蛋白水平的表达情况，吉姆萨染色和流式细胞术检测CD200highhUC-MSC和CD200lowhUC-MSC的细胞形态与细胞表型。　　3.将CD200highhUC-MSC和CD200lowhUC-MSC进行体外诱导分化，碱性磷酸酶染色和油红O染色分别检测细胞的体外成骨和成脂分化能力，qPCR检测成骨和成脂关键转录因子的表达。CCK-8实验、流式细胞术、CFU-F实验和细胞划痕实验检测CD200highhUC-MSC、CD200lowhUC-MSC和hUC-MSC的细胞增殖能力、细胞周期、细胞克隆形成能力和迁移能力。　　4.将CD200highhUC-MSC、hUC-MSC和CD200lowhUC-MSC分别与小鼠T淋巴细胞共培养，采用流式细胞术CFSE染色法检测各组细胞对T细胞增殖能力的影响，qPCR检测T细胞炎症因子在mRNA水平的表达。　　5.构建小鼠急性移植物抗宿主病（aGvHD）模型，尾静脉注射CD200highhUC-MSC、hUC-MSC、CD200lowhUC-MSC进行治疗。通过记录小鼠的体重、临床Cook评分、生存率评估各组小鼠的生存状态;HE染色检测各组小鼠的肺、肝、肛周皮肤、小肠的病理学变化;流式细胞术检测各组小鼠脾脏T淋巴细胞向Th1细胞极化的比例;qPCR检测各组小鼠脾脏T淋巴细胞炎症因子在mRNA水平的表达。　　结果：　　1.对分离培养的hUC-MSC进行鉴定，结果表明，倒置显微镜下可见细胞均呈纤维样、长梭形，贴壁生长;流式细胞术检测细胞表型，细胞高表达CD73、CD90、CD105，低表达或不表达CD14、CD34、CD45;经体外成脂成骨诱导分化后，相较于自分化组，成骨诱导组ALP染色阳性，且ALP和OPN的mRNA表达水平显著升高，而成脂诱导组油红O染色阳性，且ADI和PPAR-γ的mRNA表达水平亦显著升高。以上结果表明，成功分离培养人脐带来源MSC，且符合国际MSC的认定标准。　　2.采用流式细胞术成功分选获得CD200highhUC-MSC和CD200-hUC-MSC，流式细胞术检测CD200highhUC-MSC中CD200表达率为(97.3±0.01)%。Western印迹结果证实CD200highhUC-MSC中CD200的表达明显高于hUC-MSC组与CD200lowhUC-MSC组。对CD200highhUC-MSC和CD200lowhUC-MSC进行生物学特性鉴定，结果表明，两种细胞的形态和表型均未发生改变，均可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。　　3.对CD200highhUC-MSC、hUC-MSC、CD200lowhUC-MSC进行CCK-8和细胞周期实验，结果显示，CD200highhUC-MSC的细胞增殖能力强;CFU-F实验和细胞划痕实验结果显示，CD200highhUC-MSC的克隆形成能力和迁移能力均较CD200lowhUC-MSC显著增强。　　4.体外T淋巴细胞增殖实验结果显示，CD200highhUC-MSC可显著抑制CD3+T细胞的增殖，同时促炎因子IL-17A的表达亦显著降低。　　5.成功建立小鼠aGvHD模型，CD200highhUC-MSC治疗组小鼠体重恢复较快，生存率升高，Cook评分值降低;HE染色结果表明，CD200highhUC-MSC组小鼠的肺、肝、肛周皮肤以及小肠的病理损伤恢复较CD200lowhUC-MSC组、hUC-MSC组明显增强;流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞中Th1比例的变化，结果显示，CD200highhUC-MSC可有效抑制小鼠脾脏T淋巴细胞向Th1细胞极化;qPCR检测各组小鼠