关键词:
腊八蒜
化学成分
抗癌
抗菌
作用机制
摘要:
腊八蒜是一种传统的中国加工大蒜,民间多用于抗菌、抗病毒、预防癌症及心脑血管疾病等。目前对腊八蒜的研究主要集中于制备方法和色素粗提物,对其化学成分和活性研究甚少。为了阐明腊八蒜的化学成分和生物活性,促进大蒜资源的综合开发利用,本研究分离并鉴定了腊八蒜的主要化学成分、评价其生物活性,进一步阐释了相关的活性作用机制,以期为大蒜资源综合利用及腊八蒜的深入研究提供一定的理论依据。本文主要内容如下:(一)研究腊八蒜的脂溶性化学成分及其生物活性。采用乙醇冷浸提取获得总浸膏。然后经过石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取得到不同极性萃取物并对其体外抗氧化及抗癌活性进行探究。结果显示,腊八蒜的乙酸乙酯提取物具有显著的DPPH自由基清除活性(P<0.05)和铁还原能力(P<0.05),并可以显著地抑制人肝癌Hep G2细胞增殖(P<0.05)。通过对其进行组成分析,发现该萃取物中黄酮类化合物含量最高。采用活性追踪的方法,用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、ODS柱色谱等技术分离乙酸乙酯萃取物,得到了10个化合物,并通过薄层色谱和核磁共振谱等方法进行鉴定,共鉴定了8个化合物,包括一种甾醇,一种苷类和6种黄酮类化合物。它们是β-谷甾醇(1),杨梅素(2),山奈酚(3),槲皮素(4),芹菜素(5),异鼠李素(6),β-胡萝卜苷(7)和异槲皮苷(8)。其中,异槲皮苷首次在大蒜中发现。(二)研究了杨梅素,异槲皮苷和异鼠李素的体外抗氧化活性、对HO诱导的L02细胞氧化损伤的保护作用及促进肝癌细胞Hep G2的凋亡作用。以Hep G2细胞为模型,采用MTT法评价三种黄酮类化合物的体外抗癌活性。并采用乳酸脱氢酶(LDH)泄漏实验、流式细胞术和蛋白质印迹法(Western blotting)评价其体外抗癌活性和细胞毒性,并阐明其抗癌机制。结果表明这三种化合物表现显著的DPPH自由基清除活性(P<0.05)和铁还原能力(P<0.05),并且对L02细胞中HO诱导的氧化损伤具有保护作用,可以修复细胞受损的线粒体,维持细胞的正常形态,显著提高细胞存活率(P<0.05)。三种黄酮类化合物可以显著的抑制Hep G2细胞增殖(P<0.05),对L02细胞无明显毒性且存在明显的剂量依赖关系。杨梅素、异槲皮苷和异鼠李素对Hep G2细胞的半数抑制浓度(IC)分别为44.32±0.213μM、49.68±0.192μM和54.32±0.176μM。对三种化合物的抗癌机制研究发现,3种化合物均能够通过上调Bax、cleaved-Caspase-3蛋白的表达量,下调Bcl-2、Bcl-x L、pro-Caspase-3和pro-Caspase-9蛋白的表达,促进Hep G2细胞的凋亡。此外,采用分子对接技术,进一步探明三种黄酮类化合物的酚羟基可以与Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白通过氢键、Pi-Pi相互作用和Pi-cation相互作用的方式结合,对Hep G2细胞凋亡起到促进作用。(三)研究了腊八蒜蓝色素中的主要化学成分,通过体外抗癌实验、抗氧化实验和细胞毒性实验评价其生物活性,通过LDH实验和流式细胞术分析检测N-反式-阿魏酸酪酰胺(FLA)的促凋亡作用并初步阐明其抗癌机制。采用AB-8大孔树脂色谱柱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱和制备液相等手段,从蓝色素中分离并鉴定化合物FLA。对FLA的生物活性研究后发现,FLA具有显著的DPPH自由基清除活性和铁还原能力(P<0.05),并且对HO诱导L02细胞的氧化损伤具有保护作用,显著提高细胞存活率(P<0.05)。MTT实验证实FLA对Hep G2细胞生长具有明显的抑制作用(P<0.05),半数抑制浓度为194±0.894μM。经FLA(320μM)处理后,Hep G2细胞凋亡率可达高达83.37±1.02%,而FLA的处理对L02细胞存活率无明显的影响(96.33±0.93%)。实验结果表明FLA对细胞具有选择性毒性作用,且主要通过诱导细胞凋亡来发挥其毒性作用。(四)研究腊八蒜中3种抗菌肽的鉴定、抑菌活性评价及其作用机理。首先利用等电点沉淀法提取腊八蒜渣中的蛋白质,然后分别制备胃蛋白酶水解物和胰蛋白酶水解物。采用牛津杯法测定蛋白、胃蛋白酶水解物和胰蛋白酶水解物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的生长抑制作用。采用活性追踪法,采用超滤、Sephadex G25凝胶色谱和制备液相技术从腊八蒜中分离纯化得到了3种抗菌肽,其氨基酸组成分别为Tyr-Asn-His-Asn-Phe(YNHNF),Trp-Pro-Thr-Ser-Phe-Thr(WPTSFT)和Ala-Val-Asp-Arg-Ala-Val(AVDRAV)。其中AVDRAV在体外能够明显抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的