关键词:
山茱萸多糖
秀丽隐杆线虫
抗衰老
网络药理学
抗氧化
摘要:
【目的】山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis *** Zucc.的干燥成熟果肉,主要产地分布在甘肃、河南、湖南、山西和陕西等省。山茱萸味酸涩,性微温;归肝、肾经,始载于东汉《神农本草经》,被列为滋补上品,有补益肝肾,收涩固脱的功效。本研究以山茱萸为研究对象,对山茱萸多糖(Corni Fructus polysaccharides,CFP)及其活性小分子化合物进行初步的药效学及作用机制探究。首先提取分离纯化山茱萸多糖,通过红外光谱、扫描电镜、UV-HPLC色谱等技术对山茱萸多糖表面结构和主要单糖组成进行检测和鉴定;运用网络药理学预测山茱萸抗衰老的活性小分子化合物、作用靶点以及相关信号通路;以秀丽隐杆线虫为模式生物开展系列相关实验,探究山茱萸多糖及山茱萸中主要小分子化合物的抗衰老活性及其潜在的作用机制,进一步阐释山茱萸抗衰老作用的药效物质基础,以期为开发以山茱萸为主要原料的系列新产品提供一定的理论支撑。【方法】1.山茱萸多糖的提取分离纯化、形态、单糖组成研究:选择水提醇沉法提取山茱萸多糖;采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量;通过红外吸收光谱测定山茱萸多糖的特征吸收峰,利用扫描电镜观察山茱萸多糖的形态特征;采用UV-HPLC法检测分析山茱萸多糖的单糖组成。2.山茱萸多糖抗衰老的药理活性及作用机制研究:以野生型秀丽隐杆线虫(N2线虫)作为模式生物,利用百草枯建立氧化应激模型,筛选山茱萸多糖的给药范围及最佳药效浓度;测定山茱萸多糖对N2线虫的急性热应激、寿命、生殖及咽泵运动能力的影响;再检测并比较给药组与空白组活性氧簇及脂褐素的水平;运用实时荧光定量聚合酶链式反应检测山茱萸多糖对N2线虫衰老相关基因mRNA表达的影响。3.山茱萸小分子类物质抗衰老的网络药理学研究及实验验证:基于中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP数据库及文献检索,筛选山茱萸的活性成分并构建主要活性成分表;通过Swiss Target Prediction等数据库预测活性成分的潜在靶点;利用Gene Cards等数据库获取与衰老相关的靶点,并与预测的活性成分靶点取交集得到抗衰老的潜在靶点;应用String数据库进行靶点蛋白互作网络分析,通过DAVID数据库进行GO分析和KEGG富集分析;利用Cytoscape软件进行关键靶点筛选,并构建药物-成分-靶点-通路网络。以野生型秀丽隐杆线虫(N2线虫)作为模式生物,利用百草枯氧化应激实验筛选山茱萸3个活性化合物(熊果酸、齐墩果酸、没食子酸)的给药范围及最佳药效浓度;测定熊果酸、齐墩果酸、没食子酸及阳性对照药姜黄素对N2线虫的急性热应激、寿命、生殖的影响;再检测并比较不同给药组与空白组及阳性对照组活性氧簇和脂褐素的水平。【结果】1.山茱萸多糖的提取分离纯化、形态、单糖组成研究:通过提取分离纯化得到山茱萸多糖1.48 g,得率为2.96%,采用苯酚-硫酸法测得提取物中山茱萸多糖的含量为75.78%;通过红外吸收光谱确定多糖的特征吸收峰:在3413 cm、1739 cm、1095cm左右出现的峰分别为O-H的伸缩振动、C=O伸缩振动、C-O伸缩振动引起;利用扫描电镜在×100,×300,×1000和×1500倍观察山茱萸多糖的形态特征,小倍数时观察到山茱萸多糖表面呈现不规则的碎片状,且厚薄不一,放大到1000及1500倍时多糖碎片表明略微凹凸不平;UV-HPLC色谱检测山茱萸多糖的主要单糖组成成分为葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖,其中葡萄糖为山茱萸多糖中的主要组分。2.山茱萸多糖抗衰老的药理活性及作用机制研究:研究发现,浓度低于500μg/mL的CFP给药组均能使秀丽线虫的寿命延长,其中浓度为150μg/mL的效果最显著,较空白组的平均寿命和最长寿命分别延长了26.74%和11.37%。百草枯是一种强氧化剂,急性热应激会造成线虫体内产生严重的氧化应激,两者皆会引发线虫体内的氧化损伤,不同浓度CFP给药后均有效的抑制了氧化损伤的程度,提高了线虫的存活率;CFP对秀丽线虫生殖能力并无影响,实验结果表明山茱萸多糖在延寿的同时并未损伤线虫的生殖功能;50μg/mL、150μg/mL CFP组较空白组对线虫咽泵运动频率分别提高了9.20%和18.67%;不同浓度的CFP对线虫体内ROS水平及脂褐素积累均具有抑制作用。3.山茱萸小分子类物质抗衰老的网络药理学研究:运用网络药理学方法探讨山茱萸延缓衰老的作用机制,筛选山茱萸的活性成分23个并构建主要活性成分表,预测活性成分的潜在靶点120个,与预测的活性成分靶点取交集得到抗衰老的潜在靶点,其中山茱萸活性小分子化合物总靶点87.5%都与衰老相关,得到PTGS2、TNF、IL1B、TP53、HSP90AA1、CASP3、MMP9、NOS3、CDKN1A、VEGFA、J