关键词:
山茱萸
多糖
ITS
cpDNA
PCR
基因测序
DNA条形码
摘要:
山茱萸(Cornus officinalis *** Zucc.)为山茱萸科(Cornaceae)山茱萸属(Cornus)植物,别名山萸肉、萸肉、枣皮等,为名贵中药材,在我国的栽培历史悠久,《神农本草经》、《本草经集注》、《吴普本草》、《范子计然》、《千金翼方》、《图经本草》等典籍中均有记载。其性味酸、涩,微温,入肝肾两经,具有补益肝肾,涩精固脱的功效。近年来还引用到园林绿化之中,因其花、果、叶、树姿具有独特的观赏特性而倍受人们的喜爱。山茱萸主要分布于我国的河南、浙江、陕西等省,四川、安徽、山东亦有分布。长期以来山茱萸大多处于半野生状态,而且由于异花授粉和生长环境条件的差异,导致种内变异大,品种良莠不齐,产量高低不一,品质差异较大。本研究以不同产区的63份山茱萸叶片样本为材料,通过对形态指标的统计分析,比较了不同产区叶片的形态差异;以西峡、内乡48份山茱萸果实为材料,通过硫酸苯酚法测定山茱萸多糖含量,分析了不同优株的多糖含量,为山茱萸新品种的选育提供参考。本研究以不同产区的100个山茱萸样本为材料,进行直接PCR测序获得ITS和叶绿体基因序列,利用生物信息学软件进行ITS和叶绿体基因序列分析,从分子水平比较了不同产区山茱萸群体间的差异,探讨了群体间的亲缘关系及ITS序列对不同群体的鉴别问题,以期从DNA水平上了解不同产区的山茱萸亲缘关系及种质资源遗传背景,为中国山茱萸资源的分类、保护和利用提供理论依据。主要研究结果如下:(1)本研究对63份山茱萸叶片的统计分析表明:山茱萸叶片变异系数较大,多样性丰富;不同主产区之间有较为明显的差异,河南(伏牛山区)的山茱萸叶片较小,平均叶长7.91cm,小于西北地区的8.48和中南地区的8.86,西北地区的叶片变幅较小,变异系数小,为11.05。叶片宽河南地区的平均值为4.35cm,也小于西北地区(4.60cm)和中南地区(4.72cm),叶片看的变幅也是西北地区的样本最小。(2)本研究通过硫酸苯酚法对48份山茱萸果实多糖含量的测定分析表明:不同山茱萸优株之间,多糖含量变异系数较大,差异显著。(3)本研究通过对山茱萸ITS、trn C-F、trn Q-rps16和trn L-trn F序列的克隆,扩增,纯化、测序,改良了针对山茱萸的DNA提取方法,确立了最优的P CR的扩增体系及程序。(4)山茱萸ITS序列长度变化范围为658-668bp(不考虑Gap),其中ITS1序列长度为238-247bp,ITS2序列长度为263-267bp。5.8S r DNA的长度非常保守,经比对,参试样本的5.8S r DNA长度为153-155bp,起始于第263个碱基,终止于第424个碱基。不同山茱萸样本ITS1和ITS2碱基含量呈现差别,其中ITS 1序列中GC含量为62.6%2.5%,ITS2中GC含量为58%7%,5.8S r DNA编码区碱基组成GC含量为51.9%6.1%各区域G+C含量都较高,而且ITSl和ITs2区域的G+C含量明显比5.8S的高。所有100条ITS的675bp中共检测到150个核苷酸变异位点,占总位点的22.2%;简约信息位点80个,占总位点的11.85%。其中ITS1区域检测到87处变异位点,占ITS1序列的34.8%;简约信息位点64个,占总位点的25.6%,而ITS2区域共检测到56处变异位点,占其总长度的20.81%,简约信息位点18个,占总位点6.7%,而5.8S r DNA编码区较为保守,仅有8个变异位点,占其总长的5.1%,无简约性信息位点。(5)对所有13省市地区群体的ITS序列单倍型多样性(h)及核苷酸多样性(π)的检测结果表明:山茱萸种质表现出较高的遗传多样性水平(h=0.735,π=0.01027),且不同群体间的核苷酸多态性水平表现出较大的差异(h=0.000~1.000,π=0.000~0.02238),综合来看山茱萸各个群体中遗传多样性水平最高的应当是浙江(ZJ)群体(h=0.853,π=0.02238)。(6)本试验通过群体内遗传距离及群体间遗传距离的研究表明:候选ITS片段的群体间平均距离大于群体内距离,且群体内和群体间存在的重叠程度较小,因此,ITS具有作为山茱萸不同产区群体间植物条形码的潜力。(7)本试验以ITS序列为基础,通过最大简约法(Maximum parsimony,MP)和邻接法(NJ)构建分子系统进化树分析表明:不同产区山茱萸引种频繁,不同群体间的亲缘关系差异显著,综合鉴定率仅1.4%。(8)本试验研究表明:山茱萸种群间遗传距离的变化范围在0.000~0.052之间,平均为0.018。其中浙江种群(ZJ)和重庆(CQ-FJ)种群之间,浙江种群(ZJ)和湖南种群(HN-GY)的遗传距离最远,分化程度最高;而湖南(HN-GY)