关键词:
吴茱萸次碱
血管平滑肌细胞(A7r5)
缝隙连接蛋白
氧化型密度脂蛋白(Ox-LDL)
辣椒素受体(TRPV1)
摘要:
目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块形成涉及全血管的病变,其中血管平滑肌细胞(VSMC)异常增殖是导致AS血管壁狭窄、痉挛的重要的病理基础。近年来缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)在动脉粥样硬化(AS)血管病变中的作用受到了广泛的关注。在整体动物模型发现,AS斑块形成早期Cx43表达升高,并伴有Cx43磷酸化水平改变。本课题在培养的大鼠血管平滑肌细胞上观察Ox-LDL对Cx43表达及磷酸化水平影响的时效和量效关系,并初步探讨其机制。大量研究表明Cx43促进VSMC的增殖,可作为药物调节SMC增殖的重要靶点。吴茱萸次碱(rutaecarpine,Rut)是传统中药吴茱萸主要活性成分,为一种吲哚喹唑啉类生物碱。Rut激活辣椒素受体(Transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)介导心血管保护效应。本课题在Ox-LDL诱导的平滑肌细胞增殖模型进一步研究Rut对Cx43表达和平滑肌细胞增殖的影响,并确定其机制是否涉及TRPV1途径。方法:在培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞株A7r5,加入不同浓度Ox-LDL(2500mg/L),Western blot检测Ox-LDL对Cx43蛋白表达和磷酸化水平(ser279/282)的影响,及Ox-LDL处理后不同时间点的Cx43表达变化。预先给予氧自由基清除剂NAC、抗氧化剂PDTC和NF-κb阻断剂BAY11-7082,观察Ox-LDL上调的Cx43表达是否涉及ROS或NF-κb通路。采用Ox-LDL诱导的VSMC增殖模型,预先给予不同浓度的Rut(1×10-6mol/L,3×10-6mol/L,1×10-5mol/L)处理细胞,并使用TRPV1拮抗剂Capsazepine(1×10-5mol/L)确定Rut的效应是否涉及TRPV1途径。给予GJ通道阻断剂18α-GA,观察阻断GJ对Ox-LDL诱导VSMC增殖的影响。Western blot检测Cx43表达,CCK8检测细胞活力,Ed U测定细胞增殖中DNA复制情况,流式细胞仪检测细胞周期,荧光酶标仪检测细胞内ROS的含量。结果:Western blot结果表明不同浓度Ox-LDL(2500mg/L)均可显著诱导Cx43的表达增加,其中100mg/L最为显著,但各剂量Ox-LDL对Cx43的磷酸化水平的影响均不明显。Ox-LDL诱导的Cx43表达12小时就显著增加,48h最为明显。氧自由基清除剂NAC不能取消Ox-LDL诱导的Cx43表达,而兼有NF-κb抑制作用的抗氧化剂PDTC和NF-κb阻断剂BAY11-7082则可逆转Ox-LDL诱导Cx43表达的作用,提示Ox-LDL这一效应可能与激活NF-κb途径有关,而与氧化应激途径无关联。CCK8,流式检测细胞周期和Ed U检测发现Ox-LDL促进血管平滑肌的增殖,GJ阻断剂18α-GA可取消Ox-LDL该作用。预先给予Rut剂量依赖性地抑制Ox-LDL诱导Cx43的表达增加,并抑制VSMC增殖,表现为减少VSMCs数量(CCK),抑制Ed U阳性细胞数量,流式细胞周期检测显示Rut可减少VSMCs的增殖期(S期和G2/M)的百分比。预先给予辣椒素受体阻断剂CAPZ可取消Rut这些效应。结论:Ox-LDL可显著升高Cx43的表达水平,但对Cx43的磷酸化无显著影响;Rut可抑制Ox-LDL诱导血管平滑肌细胞的增殖,该机制与激活TRPV1抑制Cx43表达有关。