关键词:
吴茱萸
甘草
中药炮制
肝损伤
氧化应激
自噬
聚合酶链式反应(PCR)
摘要:
目的:通过比较吴茱萸生品及不同比例甘草炮制品在毒性剂量对小鼠肝脏氧化应激和自噬的影响,探讨甘草炮制吴茱萸的原理及科学内涵。方法:70只小鼠随机分为空白组、吴茱萸生品组、无甘草炮制品组及甘草炮制品组(吴茱萸与甘草质量比分别为100∶3、100∶6、100∶12、100∶24),依次按30 g·kg^(-1)灌胃给予纯净水、吴茱萸生品及相应炮制品水煎液。利用紫外-可见分光光度法测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平;苏木素-伊红(HE)染色法评价肝组织病理形态变化;荧光法检测肝组织中活性氧(ROS)水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测血红素加氧酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)、谷胱甘肽巯基转移酶1(GSTA1),Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)和p62的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、磷酸化核糖体p70 S6蛋白激酶(p-p70S6K)、p62、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅰ和LC3Ⅱ的蛋白表达水平。结果:与空白组比较,吴茱萸生品组给药7 d后小鼠体质量的增加开始减缓,差异逐渐增大,肝体指数显著升高(P<0.01);病理形态学观察显示肝小叶结构紊乱,局部肝窦狭窄或消失,存在炎性细胞浸润,局部出血等现象,血清中ALT、AST及肝组织中ROS水平均显著升高(P<0.01),肝组织中Keap1、HO-1、NQO1、GSTA1、p62 mRNA及p-mTOR、p-p70S6K、p62蛋白表达显著下降(P<0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显著上升(P<0.01)。与生品组比较,所有炮制品组小鼠体质量升高,肝体指数、血清中ALT和AST、肝组织中ROS水平均有所下降,其中仅甘草炮制品组(100∶6)的肝小叶结构完整,肝窦大小趋近于空白组;各炮制品组肝组织中Keap1、HO-1、NQO1、GSTA1和p62 mRNA的表达整体呈上升趋势,其中仅甘草炮制品组(100∶6)各指标均有明显上升(P<0.05,P<0.01);各炮制品组p-mTOR、p-p70S6K、p62蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均有所回调,其中甘草炮制品组(100∶6)p-mTOR、p-p70S6K的蛋白表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,以及甘草炮制品组(100∶24)p62蛋白表达回调幅度最大,除p-mTOR外差异均具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论:吴茱萸造成肝损伤与其能够诱发氧化应激,进而产生病理性自噬,造成肝细胞损伤密切相关,不同比例甘草炮制后可相应减弱该作用,尤以100∶6比例甘草炮制效果最优。