关键词：
宏基因组纳米孔测序
感染性疾病
病原体鉴定
即时检验(POCT)
摘要：
感染性疾病是一种由致病微生物(病毒、细菌、真菌、部分寄生虫等)引起的局部或全身性疾病,如血流感染、中枢神经系统感染、尿路感染、下呼吸道感染和腹腔感染等,在全世界范围内都有高发病率和高死亡率。在感染性疾病的治疗中,及时精确的抗微生物治疗是至关重要的,但是致病病原体的快速鉴定一直是临床医生面临的关键问题。基因组测序技术是一种无偏好的检测方法,理论上可以覆盖所有病原体。纳米孔测序技术是一种长读长实时测序技术,相比于一代和二代测序,无需过高的测序深度和过长的测序时间即可达到准确鉴定病原体的目的,这在临床病原体诊断方面无疑有着巨大的应用潜力。基于以上认识,本研究利用大量临床样本探究了纳米孔测序在各类感染性疾病比如血流感染、脑膜炎、尿路感染和眼部感染等感染性疾病病原学诊断中的临床可行性,并初步搭建了基于宏基因组纳米孔测序的病原体测序及自动化数据分析平台,进一步探究了基于m NGS病原体即时检验的潜力。宏基因组测序技术是加快血流感染病原体诊断的一个有力工具。然而,难以处理的血液样本及大量的宿主核酸背景严重影响着病原体的检出,并且对测序深度提出了更高的要求,对测序资源造成极大浪费。因此,对样本进行特异性的人源序列去除在基于宏基因组学的病原微生物组研究中是必要而且至关重要的。基于以上认识,本研究应用并评价了一种基于叠氮溴化丙锭(PMA)光解法去除人源序列的方法,无需繁琐的洗涤步骤便可无偏倚特异性去除人源序列。此方法适用于血液,并有相当大潜力适用于尿液、肺泡灌洗液和唾液等各种样本类型,对低生物量样本的优势尤其明显,在不损失病原菌核酸的前提下最大程度地去除人源序列。此外,我们还建立了适合血流感染病原体检测的宏基因组纳米孔测序流程,最低检出限可达10CFU/m L,为临床血流感染的病原体快速诊断提供新的思路和有力工具。本研究也开发了一种宏基因组纳米孔测序(m NPS)流程,用于检测和鉴定76例急性尿路感染患者的尿样中的病原体及耐药基因。我们首先使用了其中的20个样本从多个方面(建库时间、准确度等)进行了三种不同建库方法的比较,证明了通过PCR条形码试剂盒(SQK-PBK004)制备的文库所得阳性结果与金标准-临床尿培养的符合率最高,并使下游分析中的耐药基因检测成为可能。结果表明,m NPS检测的灵敏度和特异性分别为86.7%(95%CI,73.5%～94.1%)和93.5%(95%CI,78.3%～99.2%),是一种快速、准确检测尿路感染细菌病原体的有效方法,并能够成功预测耐药表型。我们对此方法流程进行进一步优化,开发了一种无偏倚全覆盖检测尿路感染病原体的方法,通过结合可靠的DNA提取(酶解法),无偏倚的宏基因组测序,全面的病原体数据库和自动化的数据处理软件,我们将从收到样本到输出结果的周转时间减少到2小时以内,对临床上尿路感染尤其是多菌种感染的检测具有较高的灵敏度(78.9%)和特异性(100%),解决了临床上对于真菌及细菌感染定性慢,对于寄生虫及病毒感染检测难的问题。通过自动化生物信息学分析流程,极大地展现了纳米孔测序应用于临床POCT的潜力。综上所述,本研究基于宏基因组纳米孔测序技术,探索、建立并优化了对临床常见的感染性疾病病原体诊断流程,对其诊断性能进行了综合评估,并验证了其应用于临床的巨大潜力。
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