关键词:
蛋白质组学
数据库
UHT乳
内源性肽
差异分析
摘要:
随着生活水平的提高,人们对健康饮食的日益关注,牛乳作为日常消费品中高营养价值、摄取蛋白质的重要食物来源而受到广泛的关注。由于乳制品需要经过生乳验收、净化、标准化、均质、灭菌、灌装等工艺,加工方式可能会对牛乳蛋白及内源性肽等物质产生影响,因此有必要对牛乳中蛋白质和内源性肽开展系统全面的研究,为产品品质的保障提供依据。本文以超高温灭菌(UHT)乳为研究对象,应用蛋白质组学技术,研究不同奶站、批次、工艺参数等因素对牛乳蛋白质和内源性肽的影响。通过牛乳蛋白质及内源性肽样品前处理方法的优化,建立了牛乳蛋白质及内源性肽组学分析流程,构建了成品乳牛乳蛋白质与内源性肽数据库;通过对乳品中蛋白质和内源性肽数据检索及差异分析,探讨了加工方式与乳品品质的相关性;进一步结合内源性肽肽谱数据及在线预测软件,筛选潜在活性肽,并进行了体外活性验证;基于在线预测智能工具筛选乳中内源性风味肽,并建立UHT乳内源性风味肽数据库。上述研究为阐述加工方式对乳品品质的影响和作用规律,建立乳品质量控制标准提供了科学和理论依据,同时,为乳源抗菌肽以及潜在的活性肽的开发提供了思路,为后续建立乳源风味肽预测模型提供基础数据。本论文主要研究内容和结果如下:(1)以UHT乳为研究对象,应用蛋白质组学技术,建立并优化了牛乳蛋白质及内源性肽的组学分析流程,构建了成品乳牛乳蛋白质和内源性肽数据库;基于蛋白质组学的方法,采用高效液相色谱分馏技术,将洗脱时间相近的组分重新分配,鉴定蛋白数由77提高至169,显著提高复杂生物体样品中蛋白及内源性肽的鉴定数量。通过Fragpipe建库软件建立了牛乳蛋白质和内源性肽数据库。与Uniprot数据库中(Bovine,reviewed(Swiss-Prot)6035)相比,新建数据库是牛乳专用的数据库:该数据库的使用在检索时间上缩短了4倍以上,鉴定数量提高了2倍,显著提高了数据检索效率和准确度。(2)以UHT成品乳为研究对象,通过等电点法分别对不同UHT牛乳中高低丰度蛋白进行分离,分别对上清液和沉淀层进行特异性酶解和蛋白质组学差异分析。结果表明,UHT乳中上清液蛋白质种类平均有120种,沉淀层蛋白质种类平均有141种,去除共有蛋白质,每个牛乳样品平均有190种蛋白质。对不同加工参数所得UHT乳的丰度排名前15位蛋白进行差异分析,结果显示各样品间上层溶液和沉淀层的高丰度蛋白无显著性差异。(3)以UHT牛乳中内源性肽为研究对象,分别从活性和呈味的角度对样品进行差异分析。结果显示,高脱气温度的样品(D1D1,D2D5)品质优于低脱气温度样品(D1B3,D2B4),与D1B3相比,D1D1中相对丰度大于1%的鲜味肽含量差异显著,含有更多鲜味肽;与D2B4相比,D2D5中相对丰度大于1%的风味肽和抗菌肽差异显著,拥有较少苦味肽,更高含量的抗菌肽。充氮气样品(ML261)品质优于未充氮气的样品(ML232),与未充氮气的M232相比,充氮气的ML261中苦味肽含量更低,二者苦味肽含量存在显著性差异。奶站和批次的差异不影响样品品质。此外,根据肽谱数据结果和MBPDB数据库80%匹配原则,筛选出5条潜在抗菌肽,抗菌活性实验结果显示多肽PKTKVIPYVRYL和VAVALARPKHPIK具有抗菌活性,对革兰氏阴性菌和阳性菌具有良好的抑制活性,表现出广谱、高效的抗菌性能。采用在线风味肽智能工具i Bitter-fuse和UMPred-FRL对成品乳内源性肽进行风味预测并建立UHT乳内源性风味肽数据库,该数据库包含935条苦味肽和705条鲜味肽。