关键词： 抑郁症   昼夜节律紊乱   静息态功能磁共振   TPH2基因多态性  

摘要： 目的:既往对于抑郁症昼夜节律紊乱的研究提示中枢5-HT(5-hydroxytryptamine,5-羟色胺)系统可能参与昼夜节律的调节,但具体机制仍然不清。中枢5-HT系统可能通过影响SCN(suprachiasmatic nucleus,视交叉上核)的协调功能参与昼夜节律的调节。本文从昼夜节律紊乱的角度探讨伴早醒症状抑郁症患者的遗传易感性和相应的静息态磁共振脑影像学特征,以期探索与抑郁症睡眠相关的昼夜节律紊乱有关的遗传学基础及脑功能改变。方法:从南京医科大学附属脑科医院招募符合入组标准的被试共249人,其中抑郁症患者185人,健康对照64人。根据汉密尔顿抑郁量表第6项早醒评分对患者进行分组:评分≥1分者为伴早醒症状抑郁症组(早醒组,n=123),而0分者为不伴早醒症状抑郁症组(非早醒组,n=62)。采集被试静脉血及静息态功能磁数据,数据处理及分析方法如下:1 TPH2基因多态性与抑郁症睡眠相关的昼夜节律紊乱的关联研究使用二代测序对TPH2基因的6个候选位点进行测序,根据分组情况在PLINK软件内建立逻辑回归模型探索与抑郁症早醒症状相关的风险位点,以性别、年龄、婚姻状态、受教育年限及家族史作为协变量。使用Bonferroni法进行多重比较矫正,得到具有统计学差异的位点。2 TPH2基因rs4290270位点多态性对抑郁症患者的静息态脑功能特征的影响2.1携带与不携带风险等位基因型患者静息态磁共振功能连接间的差异在Matlab软件中对所获脑影像学数据经头动校正、配准、分割、空间标准化等预处理后,从全脑活动协调性的角度考虑,计算双侧SCN对全脑其他体素的FC(functional connectivity,功能连接)值。根据所获位点的基因分型进行分组,使用双样本t检验分析携带与不携带风险等位基因患者组间FC值的差异。使用Alphasim法进行多重比较校正,得到具有有统计学意义的脑区。2.2携带与不携带风险等位基因型患者视觉网络功能连接动态属性的差异以滑动时间窗算法对预处理后所获时间序列进行处理,得到交叠的子时间序列矩阵。使用LASSO模型对矩阵进行稀疏后构建动态功能连接矩阵。使用动态模块化算法对每个窗的功能连接进行模块划分,按节点间连接的紧密程度分至同一模块或者不同模块。根据模块划分矩阵,进一步定义某个脑区的模块转换频率为flexibility值,某些脑区划分到同一个模块的概率为这些脑区的MA(module allegiance,模块忠诚度)值。患者分组情况同上,在Matlab软件中使用置换检验对所获得的视觉网络16个节点的flexibility值及视觉网络MA值进行比较,以P<0.05为存在显著性差异。使用Bonferroni法进行多重比较校正。3探讨静息态磁共振功能连接特征在rs4290270位点多态性与抑郁症患者临床表型之间的中介效应以第一步所得位点分型数据作为自变量(X),作为内表型的异常静息态磁共振指标分别做为中介变量(M),反映临床表型的量表评分别作为因变量(Y),在R软件中使用mediate包构建中介效应模型,以探索风险等位基因、部分脑区的异常影像学特征及临床特征三者之间潜在的联系。结果:1 TPH2基因多态性与抑郁症睡眠相关的昼夜节律紊乱的关联研究所有被检测的位点都符合分析要求。在抑郁症组与健康对照组中,rs4290270位点显示出关联趋势(P=0.0167),但是未能通过Bonferroni校正。进一步根据特征性症状进行分层后,该位点多态性对抑郁症早醒症状的作用具有统计学意义(P=0.0047;OR=2.0270);风险等位基因型为T)。并且,该位点在非早醒组中未显示出作用(P=0.1750;OR=1.4890)。2 TPH2基因rs4290270位点多态性对抑郁症患者的静息态脑功能特征的影响2.1携带与不携带风险等位基因型患者静息态磁共振功能连接间的差异共158例静息态功能核磁共振数据通过了数据质量控制,其中A等位基因型患者组为58例,携带T等位基因型组为100例。与A等位基因型组比,携带T等位基因组患者右侧SCN到右侧梭状回(34,-4,-44)和右侧额中回(50,46,4)的FC值增高;左侧SCN到右侧舌回(12,-60,6)和左侧距状裂(-26,-58,6)的FC值降低。所有结果均通过Alphasim多重比较校正。2.2携带与不携带风险等位基因型患者视觉网络功能连接动态属性的差异与A等位基因型组比,携带T等位基因型组右侧梭状回(30,-42,-15;P=0.0029)flexibility值在A、携带T等位基因组患者间的差异具有统计学意义,通过Bonferroni多重比较校正。视觉网络内MA值(P=0.031)在组间也具有统计学差异。3探讨静息态磁共振功能连接特征在rs4290270位点多态性与抑郁症患者

关键词： Bmal1   RAW264.7   动脉粥样硬化   基因转染  

摘要： 目的:构建过表达昼夜节律基因Bmal1腺病毒载体,体外转染巨噬细胞。采用氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)刺激巨噬细胞,观察并评价对巨噬细胞泡沫化程度、迁移、炎症、凋亡的变化。方法:(1)选取小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象。分为Control组(空白对照组)、ox-LDL组(50μg/mL ox-LDL干预组)、Ad-GFP+ox-LDL组(空载腺病毒转染3天+50μg/mL ox-LDL干预组)和Ad-Bmal1+ox-LDL组(Bmal1腺病毒转染3天+50μg/mL ox-LDL干预组)。(2)荧光显微镜观察RAW264.7中腺病毒转染效率。(3)油红O染色检测不同昼夜节律时间点(0 h、6 h、12 h、24 h)RAW264.7细胞泡沫化程度。(4)Transwell小室法及划痕实验检测RAW264.7细胞的迁移。(5)流式细胞仪检测RAW264.7细胞的凋亡。(6)q RT-PCR检测Bmal1、IL6、IL10、Bax、Mcl1 m RNA的表达。(7)Western-Blot检测Caspase3、Caspase9蛋白表达水平。结果:(1)荧光显微镜下可见Ad-GFP+ox-LDL组和Ad-Bmal1+ox-LDL组表达明显的绿色荧光蛋白,表明重组腺病毒在体外转染效率高;Ad-Bmal1转染72 h后,Bmal1m RNA表达明显升高,表明Ad-Bmal1可以有效诱导Bmal1过表达。(2)油红O染色示:ox-LDL刺激6 h、12 h、24 h后,细胞内均可见明显的脂滴,且呈时间依赖性,脂滴面积在24 h时达到最大值。12 h、24 h组分别与0 h、6 h组相比细胞内脂滴面积增加(P<0.05)。(3)Transwell小室法及划痕实验检测示:50μg/mL ox-LDL可刺激正常的细胞发生明显迁移;但Ad-GFP、Ad-Bmal1对迁移无明显抑制作用。(4)流式细胞术检测示:与Control组相比,ox-LDL组细胞的凋亡比例增加(P<0.05);与Ad-GFP+ox-LDL组相比,Ad-Bmal1+ox-LDL组细胞的凋亡比例减少(P<0.05)。(5)在ox-LDL刺激12 h,与Ad-GFP+ox-LDL组相比,Ad-Bmal1+ox-LDL组细胞IL6 m RNA的表达水平下降,IL10 m RNA的表达水平上升(P<0.05)。(6)在ox-LDL刺激24 h,与Ad-GFP+ox-LDL组相比,Ad-Bmal1+ox-LDL组细胞Bax m RNA的表达水平下降,Mcl1 m RNA的表达水平上升(P<0.05)。(7)在ox-LDL刺激6、12 h,与Ad-GFP+ox-LDL组相比,Ad-Bmal1+ox-LDL组细胞pre-caspase3、pre-caspase9的蛋白表达水平下降(P<0.05)。(8)在ox-LDL刺激6、12、24 h,与Ad-GFP+ox-LDL组相比,Ad-Bmal1+ox-LDL组细胞cleaved-caspase3的蛋白表达水平下降(P<0.05)。结论:过表达昼夜节律基因Bmal1可以抑制ox-LDL刺激下巨噬细胞的炎症反应及凋亡效应,为探索昼夜节律在动脉粥样硬化中作用提供实验依据。

关键词： Genetics   Medicine  

摘要： Non human primates as models for human diseases are of unprecedented value as they parallel the human physiology, anatomy, pathology and social structures. Albeit they have been extensively used in research in biomedical sciences, the genomic underpinnings of their fidelity (or there lack of) in simulating human diseases haven’t been elucidated. This work addresses this issue on several levels: First, by creating the non-human primate reference transcriptome resource (NHPRTR) for comparative functional genomics, which aims to catalogue the transcriptomes of non human primates used in biomedical research, and to gain qualitative and quantitative estimates of gene expression profiles of specific tissues in primates. Second, this work expands the non-human primate reference transcriptome resource by profiling the dynamics of gene expression in rhesus macaque pineal gland and retina in circadian manner. Such an effort resulted in elucidating a possible novel signaling molecule in the melatonergic signaling in primates - N-acetyltryptamine. Third, this body of work addresses the veracity of rodent and other animal models in assessment of circadian dynamic changes of transcriptome, and consequentially, physiology and pathology of melatonergic signaling and circadian behavior. From the comparative analysis of the vertebrate pineal gland transcriptomes and their circadian changes it can be inferred that rodent and zebrafish, which have been considered valuable models for research in the field of chronobiology, do not mirror the circadian dynamics observed in primates. Additionally primates seem to show unique characteristics of the circadian dynamics of the transcriptome, which have not been observed in other mammal species. Such unique features include oscillations of several mitochondrial transcripts, all of them being positioned next to each other on the primate MT chromosome, bringing the oxidative phosphorylation as a novel potential mechanism associated with the circa

关键词： 卵巢癌   昼夜节律基因   自噬   顺铂耐药   mTOR信号通路  

摘要： 目的通过研究昼夜节律基因及自噬相关基因在卵巢癌OVCAR3细胞及其顺铂耐药细胞株OVCAR3/DDP中表达的差异性与相关性,探讨细胞自噬在昼夜节律基因介导卵巢癌OVCAR3细胞对顺铂产生耐药中的作用及可能机制。方法利用表达谱芯片技术筛选卵巢癌耐药细胞株OVCAR3/DDP与非耐药细胞株OVCAR3之间表达差异明显的昼夜节律基因和自噬相关基因,通过RT-qPCR进行验证;Western blot检测OVCAR3/DDP与OVCAR3细胞株之间自噬相关基因LC3、BECN1与P62表达的差异性;细胞免疫荧光观察两种细胞LC3蛋白分布及表达量的不同;含有0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml顺铂浓度的培养基分别培养OVCAR3细胞12 h、24 h、48 h后RT-qPCR检测昼夜节律基因(CLOCK、PER1、CRY2)、自噬相关基因(LC3、BECN1、P62)及mTOR基因mRNA的表达变化,Western blot检测LC3、BECN1和P62蛋白表达的变化;雷帕霉素处理OVCAR3细胞24 h后RT-qPCR检测昼夜节律基因(CLOCK、PER1、CRY2)、自噬相关基因(LC3、BECN1、P62)及mTOR基因mRNA的表达情况,Western blot检测LC3蛋白表达变化。结果1.表达谱芯片结果显示,与OVCAR3细胞株相比,卵巢癌OVCAR3/DDP细胞株中表达差异性明显的自噬相关基因共13个(其中11个表达上调,2个表达下调),昼夜节律基因共6个(全部表达上调)。***-qPCR验证表达谱芯片结果提示差异性表达的基因mRNA在OVCAR3及其耐药细胞株OVCAR3/DDP中均有表达,其中昼夜节律基因(CLOCK、PER1、CRY2)、自噬相关基因(LC3、BECN1、P62)及mTOR基因mRNA的表达水平在两种细胞株中具有显著差异性,与芯片结果基本一致,差异有统计学意义(P<0.05)。3.细胞免疫荧光结果提示OVCAR3/DDP细胞中有大量LC3蛋白表达在细胞核周围,OVCAR3细胞中LC3蛋白表达明显较少。*** blot结果提示耐药细胞株OVCAR3/DDP与非耐药细胞株OVCAR3相比,BECN1和LC3蛋白表达升高,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化增强,P62蛋白表达减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。5.随着顺铂处理OVCAR3细胞时间的延长与浓度梯度的提高,CLOCK、PER1、CRY2、BECN1和LC3 mRNA的表达水平均上调,mTOR、P62 mRNA的表达水平下调,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果提示LC3蛋白表达增强,而mTOR、P62蛋白表达减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。6.雷帕霉素处理OVCAR3细胞后RT-qPCR检测CLOCK、PER1和CRY2mRNA的表达水平无明显变化,BECN1和LC3 mRNA的表达水平明显上调,P62和mTOR mRNA的表达水平明显下调;Western blot结果提示LC3蛋白表达显著升高。结论1.利用表达谱芯片、RT-qPCR及Western blot等不同检测方法从分子与蛋白水平检测均证明昼夜节律基因(CLOCK、PER1、CRY2)、自噬相关基因(LC3、BECN1、P62)及mTOR基因在卵巢癌OVCAR3细胞株及其顺铂耐药细胞株OVCAR3/DDP中表达具有差异性。2.昼夜节律基因与自噬相关基因在卵巢癌OVCAR3细胞株及其顺铂耐药细胞株OVCAR3/DDP中表达具有相关性。3.昼夜节律基因可能通过mTOR信号通路调控自噬影响卵巢癌OVCAR3细胞对顺铂的敏感性。

关键词： 昼夜节律   肾脏   肝俞   生物钟  

摘要： 目的:观察针刺肝俞对无昼夜节律C57BL/6J小鼠肾内Clock与Bmal1基因节律表达和蛋白量表达的影响。方法:本实验采用360°全方位视频记录仪对C57BL/6J小鼠站立次数、自发活动情况进行检测和记录。将72只小鼠随机分为4组,空白组、模型组、肝俞组、非经非穴组,每组18只。在Light:08:00-20:00Dark:20:00-08:00的明暗交替的灯光下进行7天驯化。试验进行第8天,采用短时间睡眠剥夺法即2小时黑暗、2小时光照光暗交替造模5天,获得无昼夜节律模型。确认模型成功后,于试验第13天到17天,每天对肝俞组、非经非穴组在15:00进行捆绑和电针干预治疗,肝俞组频率2-15Hz,电流0.2mA,每次20分钟,每天电针1次,模型组(样本脱落2只,及时平时补入)和空白组不针刺只捆绑,实验进行的第18天早2点开始取材,间隔4小时一次,共取6次,每次每组取3只小鼠肾脏。用PCR和Western Blot法检测小鼠肾脏内Clock和Bmal1基因mRNA的表达水平和蛋白表达含量,并用余弦定理证明其基因表达的节律性。结果:1.采用2小时睡眠剥夺法对C57BL/6J小鼠造模,造模成功后,情绪激动、躁狂,活动度提高、站立次数增加,进食量减少、活动起始时间紊乱、毛发色泽改变、排便情况改变。模型组、肝俞组、非经非穴组与空白组比较,自发活动次数与站立次数明显增多(P<0.05)。2.干预后,模型组与肝俞组行为比较,自发活动次数与站立次数明显增多(P<0.05);肝俞组与非经非穴组行为比较,自发活动次数与站立次数减少,有统计学意义(P<0.05);非经非穴组与模型组行为比较,无统计学意义(P>0.05)。3.干预后,肝俞组中小鼠肾内Clock与Bmal1的mRNA拟合余弦曲线提示昼夜节律恢复节律性,具有统计学意义(P<0.3);模型组与非经非穴组小鼠肾内Clock与Bmal1的mRNA拟合余弦曲线提示昼夜节律无节律性,无统计学意义(P>0.3)。4.干预后,肝俞组与模型组、非经非穴组与空白组比较,小鼠肾内Clock基因的蛋白表达量增多,条带变宽,(P<0.05)具有统计学意义。模型组与肝俞组比较,表达量增加,条带变宽,(P<0.05)具有统计学意义。肝俞组与非经非组比较蛋白表达量降低,条带略细,(P<0.05)具有统计学意义。模型组与非经非穴组比(P>0.05),无统计学意义。5.干预后,肝俞组与模型组、非经非穴组与空白组比较,小鼠肾内Bmal1蛋白表达量减少,条带变窄,(P<0.05)具有统计学意义。模型组与肝俞组比较,表达量增加,条带变宽,(P<0.05)具有统计学意义。肝俞组与非经非组比较蛋白表达量降低,条带略细,(P<0.05)具有统计学意义。模型组与非经非穴组比(P>0.05),无统计学意义。结论:1.采用2小时睡眠剥夺法对C57BL/6J小鼠造模,可获得无昼夜节律小鼠模型。2.电针肝俞后可降低无昼夜节律C57BL/6J小鼠的站立次数和活动次数。3.电针肝俞对无昼夜节小鼠肾脏内Clock、Bmal1蛋白具有下调作用,可能是外周肝、肾时钟系统基因参与调控的作用,从而使无昼夜节律小鼠昼夜节律恢复。

关键词： 卵巢癌   顺铂耐药   昼夜节律基因   CRY1   细胞自噬  

摘要： 目的:检测昼夜节律基因CRY1与细胞自噬在卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP及其亲本细胞株A2780中的表达差异,探讨CRY1与细胞自噬的相关性及其是否参与A2780/DDP耐药性的产生。方法:***-PCR及Western Blot检测A2780及A2780/DDP细胞株中细胞自噬和昼夜节律基因及相关蛋白表达水平;细胞免疫荧光检测LC3和CRY1的表达及分布情况。2.顺铂处理肿瘤细胞后,CCK8检测细胞1～5天的存活率;吖啶橙及Hoechst33342观察自噬囊泡和细胞核形态;Western Blot检测自噬和昼夜节律基因表达。3.3-甲基腺嘌呤处理肿瘤细胞后,Western Blot检测自噬和昼夜节律基因的表达变化。4.慢病毒介导CRY1干扰及过表达质粒分别调控A2780和A2780/DDP细胞CRY1基因的表达水平;qRT-PCR和Western Blot检测CRY1稳定转染细胞CRY1及细胞自噬相关蛋白;CCK8比较调控CRY1前后细胞顺铂敏感性变化。结果:1.与A2780细胞相比,qRT-PCR结果显示A2780/DDP中CRY1、CRY2、CLOCK、LC3表达明显上调,p62/SQSTM1下调;Western Blot结果示LC3上调,p62/SQSTM1、CRY1、CRY2、CLOCK的表达明显下调,其中CRY1和CLOCK差异最为明显;细胞免疫荧光法结果显示A2780/DDP细胞中LC3的表达明显增加、CRY1减少。2.顺铂处理A2780和A2780/DDP后,CCK8结果显示A2780/DDP的顺铂抵抗性明显强于A2780,A2780/DDP的24h和48h IC50分别为22.131μg/ml、25.378μg/ml,A2780 IC50分别为6.066μg/ml、4.316μg/ml。3.顺铂处理48h后,吖啶橙结果显示顺铂可诱导A2780和A2780/DDP的自噬效应。Hoechst33342观察细胞核形态,结果为当顺铂浓度分别为5μg/ml和10μg/ml时A2780和A2780/DDP的凋亡效应明显增加。与A2780相比,Western Blot结果显示:顺铂浓度≤5μg/ml时,诱导A2780/DDP细胞自噬效应增加不明显,CRY1呈上升趋势。但当顺铂浓度达到20μg/ml时,A2780/DDP自噬效应明显增加,CRY1下调。4.3-MA抑制细胞自噬后,Western Blot结果显示:A2780及A2780/DDP细胞CRY1表达均呈上升趋势,且两者增加程度差异相当。5.分别将慢病毒介导的shCRY1和3xflag CRY1重组质粒稳定转染到A2780和A2780/DDP细胞中并获得稳转株,前者CRY1的mRNA和蛋白水平均呈下降趋势,后者为上调显著。Western Blot检测LC3,结果显示干扰CRY1后,自噬效应变化差异均无统计学意义;CRY1过表达后,A2780自噬效应无明显变化,A2780/DDP细胞自噬效应明显增加。CCK8检测稳定转染细胞株顺铂处理后1～5天的存活率,发现CRY1过表达,自噬效应增加,但细胞的存活率下降;而CRY1敲减后,自噬表达差异无统计学意义,但其存活率却呈现上升趋势。结论:1.与A2780细胞相比,昼夜节律基因CRY1在A2780/DDP中表达明显降低,自噬效应显著增加。顺铂可诱导细胞自噬效应的增加,降低CRY1的表达。2.抑制细胞自噬CRY1表达明显增加。CRY1基因沉默使A2780和A2780/DDP细胞对顺铂的敏感性下降,且前者下降更为明显。CRY1过表达能有效逆转A2780/DDP细胞对顺铂的耐药性。3.细胞自噬可能通过下调CRY1表达在A2780/DDP细胞中发挥作用,上调CRY1可增加A2780/DDP的顺铂敏感性。CRY1可能成为难治性卵巢癌的靶向治疗的新靶点。

关键词： 昼夜节律   肾脏   节律基因   肝俞   针刺  

摘要： 目的:主要研究电针“肝俞”穴对昼夜节律紊乱C57BL/6J小鼠行为方面及肾中生物钟基因表达的影响。通过针刺“肝俞”穴,观察小鼠昼夜行为的改变,研究针刺“肝俞”穴对外周生物钟肾内特定节律基因表达的影响,进而从基因层面探讨针刺“肝俞”穴对昼夜节律紊乱C57BL/6J小鼠的作用机制。方法:将72只C57BL/6J小鼠采取随机分组的方式,平均分成四组,分别为空白组、模型组、针刺非经非穴组和针刺肝俞组,每组18只。在光照同步(L:D=12;12,Light:08:00-20:00 Dark:20:08:00)驯化7天后,将模型组、针刺非经非穴组和针刺肝俞组小鼠,采用短时间剥夺睡眠法(L:D=2:2),造模5天,造模成功,获得无昼夜节律模型,之后恢复光照同步(L:D=12;12)。空白组全程采用光照同步方式。在造模成功后,即实验第13天,空白组与模型组在每天15:00进行捆绑20分钟,余两组在每天15:00进行针刺20分钟,连续进行5天,针刺组在双侧“肝俞”穴进行毫针针刺,非经非穴组选择小鼠腹部固定的非穴位点进行毫针针刺,针刺方法均为斜向内下方刺入0.5cm,两只针柄分别连接KWD-808I脉冲电针仪的输出导线上,将电针仪参数调整为:疏密波4/20Hz;疏密周期为6秒,至针刺部位肌肉或者下肢微微抽动即可,在最后一次针刺11小时后,即第18天02:00开始,四组同时进行,每组各处死三只取肾脏,每隔4小时,处死一批,直到第18天22:00,处死最后一批,全程用360智能红外线摄像机实时远程记录观察,并对实验过程中小鼠自发站立和活动次数进行记录,应用Real-Time-PCR法测量肾脏内Cry1和Cry2基因m RNA含量和运用Western Blot法测定Cry1和Cry2的蛋白表达量。运用余弦分析法和统计学分析验证基因表达是否具有节律性。结果:1.在360摄像机远程观察记录下,模型组、非经非穴组小鼠在实验后期与起初驯化期相比,表现出狂躁、易惊、大便不规律、质稀、皮毛暗淡等特性,站立、捋毛、攀爬次数明显增多,可听到笼内明显响声,抓取时反抗明显。而针刺组在针刺肝俞穴五天后,已恢复昼伏夜出特性,性情较温顺,站立、捋毛等行为与空白组类似,皮毛柔顺、大便较正常。运用统计学分析,在治疗后,在小鼠5min内的自发活动次数与站立次数方面,针刺组与空白组比较,非经非穴组与模型组比较,结果均无统计学意义(P>0.05)。而针刺组与模型组比较,针刺组与非经非穴组比较,活动与站立次数明显减少,有统计学意义(P<0.05)。2.在Real-Time-PCR法测量下,空白组、针刺组小鼠Cry1与Cry2基因表达呈现出节律性(P<0.3),模型组、非经非穴组小鼠Cry1与Cry2基因表达未体现节律性(P>0.3)。*** Blot蛋白检测发现,模型组与空白组相比,数值差异有统计学意义(P<0.05),显示模型组基因蛋白表达不具有节律性。针刺组与模型组相比,数值差异有统计学意义(P<0.05),显示针刺组基因蛋白表达具有节律性,非经非穴组与针刺组相比,差异有统计学意义(P<0.05),显示非经非穴组基因表达未呈现节律性。结论:1.正常C57BL/6J小鼠行为学方面和肾内Cry1与Cry2基因表达具备节律性。2.针刺肝俞穴有助于小鼠行为恢复正常,而针刺非经非穴则无此作用。3.针刺肝俞穴助于节律基因Cry1与Cry2在肾内表达基本恢复正常,具有节律性,已紊乱的昼夜节律周期逐渐恢复正常。而针刺非经非穴则未体现出该作用。

关键词： 内分泌干扰物   邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯   视交叉上核   昼夜节律   下丘脑  

摘要： 目的:通过检测出生前DEHP暴露的成年后大鼠下丘脑昼夜节律调控相关基因Clock、Arntl、Dbp、Per1、Per2的表达水平,以及CLOCK和DBP蛋白在SCN核区和大脑皮质的表达水平,探讨出生前DEHP暴露对成年大鼠昼夜节律基因及其产物的影响。方法:将32只孕鼠随机分为溶剂(玉米油)对照组和2、10、50mg/kg DEHP剂量组,每组8只,从孕14至孕19天,10mL/kg/天进行灌胃染毒。将子代大鼠出生日记为PND0,于PND21断乳并分笼饲养。在子代大鼠10周龄时每窝随机选取雌、雄各1只,每组雌、雄各8只,断头处死,取出脑组织后用脑模具制成1mm厚的切片,在下丘脑包含SCN的区域打孔并提取总RNA,用实时荧光定量PCR检测昼夜节律相关基因在大鼠下丘脑SCN核区的表达水平。用同样的方法选择每组雌、雄大鼠各8只,取出脑组织,用振荡切片机制成40μm厚的脑切片。根据大鼠脑立体定位图谱,挑选含有SCN核区的脑片,用免疫荧光组织化学法结合激光扫描共聚焦显微镜检测CLOCK蛋白和DBP蛋白的表达水平。结果:(1)雄性子代大鼠各组间SCN核区Clock基因表达水平差异无统计学意义(F=0.200,P=0.896)。雌性子代大鼠各组间SCN核区Clock基因表达水平差异有统计学意义(F=5.390,P=0.007),与对照组相比,50mg/kg DEHP剂量组雌性子代大鼠SCN核区Clock基因表达水平上调(P<0.05)。(2)雄性子代大鼠各组间SCN核区Arntl基因表达水平差异无统计学意义(F=0.293,P=0.830)。雌性子代大鼠各组间SCN核区Arntl基因表达水平差异无统计学意义(F=0.688,P=0.569)。(3)雄性子代大鼠各组间SCN核区Dbp基因表达水平差异有统计学意义(F=4.179,P=0.015),与对照组相比,10、50mg/kg DEHP剂量组雄性子代大鼠SCN核区Dbp基因表达水平下调(P<0.05)。雌性子代大鼠各组间SCN核区Dbp基因表达水平差异无统计学意义(F=1.837,P=0.170)。(4)雄性子代大鼠各组间SCN核区Per1基因表达水平差异无统计学意义(F=0.341,P=0.796)。雌性子代大鼠各组间SCN核区Per1基因表达水平差异有统计学意义(F=3.535,P=0.031),与对照组相比,50mg/kg DEHP剂量组雌性子代大鼠SCN核区Per1基因表达水平上调(P<0.05)。(5)雄性子代大鼠各组间SCN核区Per2基因表达水平差异无统计学意义(F=0.673,P=0.576)。雌性子代大鼠各组间SCN核区Per2基因表达水平差异无统计学意义(F=0.688,P=0.569)。(6)雄性子代大鼠各组间SCN核区CLOCK蛋白表达水平差异有统计学意义(F=3.271,P=0.043),与对照组相比,2、50mg/kg DEHP剂量组雄性子代大鼠SCN核区CLOCK蛋白表达水平下调(P<0.05)。雌性子代大鼠各组间SCN核区CLOCK蛋白表达水平差异有统计学意义(F=4.283,P=0.017),与对照组相比,2、50mg/kg DEHP剂量组雌性子代大鼠SCN核区CLOCK蛋白表达水平上调(P<0.05)。(7)雄性子代大鼠各组间皮质CLOCK蛋白表达水平差异无统计学意义(F=0.798,P=0.510)。雌性子代大鼠各组间皮质CLOCK蛋白表达水平差异无统计学意义(F=0.743,P=0.539)。(8)雄性子代大鼠各组间SCN核区DBP蛋白表达水平差异无统计学意义(F=2.199,P=0.121)。雌性子代大鼠各组间SCN核区DBP蛋白表达水平差异无统计学意义(F=2.045,P=0.140)。结论:(1)出生前DEHP暴露可能通过改变部分SCN核区昼夜节律调控相关基因和蛋白的表达水平干扰昼夜节律调控。(2)出生前DEHP暴露对大鼠SCN核区昼夜节律相关基因表达水平的影响可能与暴露水平有关。(3)出生前DEHP暴露对大鼠昼夜节律的干扰作用呈现性别差异。

关键词： 高血压   昼夜节律   颈动脉硬化  

摘要： 目的:探讨老年高血压患者中不同类型的血压昼夜节律变化与颈动脉粥样硬化之间的相关性,为临床老年高血压及靶器官损害的防治提供依据。方法:选取2018年1月018年10月青岛某三甲医院老年科住院的老年高血压患者117例(男性44例,女性73例),所有患者均行24小时动态血压(24hABPM)监测,收集监测数据(包括24小时收缩压、24小时舒张压、日间收缩压、日间舒张压、夜间收缩压和夜间舒张压),观察老年高血压患者所出现的不同的昼夜节律变化,按照患者间不同的血压昼夜节律变化类型可分为杓型组24例和异常昼夜节律组93例(其中非杓型组67例,反杓型组26例)。所有患者均行颈部超声检查,并对颈动脉粥样硬化进行分级。此外还需采集患者多项临床检测结果的数据,其中包括患者的空腹血糖(FBG),血脂(包括甘油三酯、胆固醇)水平,同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)。将杓型组患者与异常昼夜节律组患者(包括非杓型组患者与反杓型组患者)一般资料、颈动脉内膜中层厚度、斑块发生率、颈动脉粥样硬化程度、24小时收缩压、24小时舒张压、白天收缩压、白天舒张压、夜间收缩压、夜间舒张压进行比较,将杓型组患者、非杓型组患者与反杓型组患者左右侧颈动脉内膜中层厚度、斑块发生率、颈动脉粥样硬化程度进行比较,探索不同类型血压昼夜节律变化高血压患者间的差异性。将数据使用Excel2016进行整理,采用SPSS24.0软件进行统计分析,计量资料均采用±s表示。两组计量资料比较服从正态分布的使用T检验,两组计数资料用率表示,比较服从正态分布的使用?检验。以P<0.05判定为有统计学意义。结果:老年高血压患者中,与杓型血压组相比较,异常血压昼夜节律组患者在颈动脉内膜中层厚度(左侧IMT、右侧IMT)、斑块发生率、颈动脉粥样硬化方面差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01);非杓型血压组与反杓型血压组在颈动脉内膜中层厚度(左侧IMT、右侧IMT)、斑块发生率、颈动脉粥样硬化方面相比较,差异无统计学意义(P>0.05);杓型血压组在颈动脉内膜中层厚度、斑块发生率、颈动脉粥样硬化方面,左侧颈动脉与右侧颈动脉相比,差异无统计学意义(P>0.05);非杓型血压组、反杓型血压组在颈动脉内膜中层厚度、斑块发生率、颈动脉粥样硬化方面,左侧颈动脉与右侧颈动脉相比较,差异有统计学意义(P<0.05);老年高血压患者在夜间收缩压、夜间舒张压方面,反杓型组平均血压水平高于非杓型组[(132.92±15.75)mmHg vs(122.85±14.91)mmHg,(72.38±8.75)mmHg vs(64.34±9.98)mmHg,(1mmHg=0.133kPa),P<0.01]。结论:老年高血压患者血压昼夜节律与颈动脉粥样硬化关系密切,异常血压昼夜节律损伤靶器官概率更大。并且首次说明老年高血压患者异常血压昼夜节律(非杓型、反杓型)左侧颈动脉内膜损害程度较右侧更加明显。

关键词： 哺乳动物   视交叉上核   细胞类型   基因表达   昼夜节律   调控机制  

摘要： 位于下丘脑腹侧部位的视交叉上核(Suprachiasmatic nucleus，SCN)是哺乳动物中控制昼夜节律的核心核团。但是对于组成SCN的细胞类型以及不同细胞类型对于昼夜节律的维持和调控的作用尚缺乏系统性的研究。本工作利用单细胞测序技术将小鼠的SCN系统性地分为了10种非神经元细胞类型和5种神经元亚型，并且利用了不同的技术平台对5种神经元亚类的分型进行了佐证。通过在单细胞测序的同时引入昼夜节律时间点的信息，得到了不同细胞类型中基因表达随时间的变化情况。在此基础上，通过在主观黑夜的前半夜进行光照刺激，进一步探究了光照调节昼夜节律的细胞类型基础。在本研究中，发现星形胶质细胞中存在广泛的节律基因表达，其中一些星形胶质细胞的经典功能，例如脂类代谢，氨基酸代谢等生物过程都存在昼夜节律。在此启发下，通过微透析技术发现了下丘脑细胞间隙中的谷氨酸浓度存在节律变化。此外，还发现了谷氨酸对于体外培养的星形胶质细胞存在同步化作用。在对SCN的5种神经元亚类的研究中，也发现了5种神经元的节律基因表达不仅存在强弱的差异，也存在时序结构。并且，5种亚类对于光刺激的响应并不相同。最后，通过肽段受体网络的构建和分析对5种神经元在昼夜节律稳态维持和调控中的作用机制进行了阐释。