关键词:
肉鸡
胆汁酸
糖皮质激素
昼夜节律
摘要:
胆汁酸主要由肝脏中的胆固醇合成,是一类两性小分子,不仅在机体营养吸收中起重要作用,还是关键的信号分子参与调节葡萄糖、脂类、能量、药物和胆汁酸自身的代谢。动物胆汁酸的稳态依赖于肠肝循环的正常运行,对机体的健康有重要意义。现代生活中,昼夜颠倒、失眠和不规律的饮食等都可以导致胆汁酸昼夜节律的紊乱,诱发胆汁淤积等肝胆疾病以及肥胖等代谢综合征。
在规模化养殖过程中,肉鸡长期暴露于多种应激源,比如:高温高湿、高养殖密度、持续光照和频繁的免疫接种。这导致家禽血液中持续高水平的皮质酮,也造成了肉鸡生物节律的紊乱,从而使饲料转化效率下降,糖脂代谢紊乱以及免疫力下降,造成了巨大的经济损失。目前关于应激如何扰乱机体胆汁酸池的研究主要集中在人类以及啮齿类动物中,家禽上鲜有报道。因此,本研究拟通过连续皮质酮注射建立肉鸡慢性应激模型,探究慢性应激扰乱家禽胆汁酸池昼夜节律的可能调节机制。
1慢性皮质酮暴露对肉鸡肝脏生物钟和胆汁酸稳态的影响
本试验选用健康、体重相近的63日龄中速型矮脚黄羽公鸡,共72只,随机分为对照组(Control,Con)和皮质酮组(Corticosterone,Cort)各36只,Cort组接受2 mg每千克体重的皮质酮皮下注射(每天两次,9:00-10:00和18:00-19:00),Con组则注射同体积的溶剂,共计11天。试验期间采用12小时光照12小时黑暗的光照制度,肉鸡自由采食和饮水,每天记录采食量,每两天记录体重变化。样品采集从9:00 am(ZT 2)开始,间隔4 h采集一次,每次随机选择6只Con组和6只Cort组肉鸡,最后一个时间点是次日5:00 am(ZT 22)。采集了血浆,肝脏,小肠内容物等样品,检测了其中的胆汁酸浓度,检测了肝脏中胆汁酸相关基因和钟基因的表达。结果显示,Cort组肝脏中胆汁酸浓度和Con组呈现相反的波动形式,整体含量显著(P<0.05)减少。夜间(ZT 10以后)Cort组胆汁以及小肠中胆汁酸含量异常升高并在凌晨(ZT 22)达到峰值。不同于Con组有节律的血浆胆汁酸浓度起伏,Cort组的浓度在早上(ZT 2)显著(P<0.05)高于Con组,之后逐渐降低并在黎明前(ZT 22)显著(P<0.05)低于Con组。慢性皮质酮暴露下,鸡肝脏生物钟基因BMAL1、NPAS2的m RNA表达曲线出现振幅下降以及峰值延迟,Cry1、Per2、Per3的振幅明显减小并出现位移。Cort组肝脏中CYP7A1、CYP27A1、FXR、MRP2基因m RNA表达峰值出现时间发生变化,CYP8B1的振幅明显增加,NTCP的表达量显著(P<0.05)提高并且保持原有节律。以上结果表明:慢性皮质酮暴露导致肉鸡胆汁酸池的整体稳态被扰乱,肝脏钟基因以及胆汁酸代谢相关基因发生明显节律改变。
2慢性皮质酮暴露对肉鸡肠肝循环胆汁酸谱和肠道微生物群落的影响
由于慢性皮质酮暴露能够显著影响肉鸡胆汁酸池的大小以及胆汁酸的分布节律,我们选取胆汁酸池变化以及肝脏转录水平变化最有代表性的ZT 2时刻的样品作为研究对象,运用靶向胆汁酸代谢组学技术以及16s r RNA基因测序进一步探究慢性皮质酮暴露对肉鸡肝脏、小肠和血清胆汁酸谱以及小肠微生物群落的影响。结果显示,慢性皮质酮暴露显著(P<0.05)降低了肝脏中CDCA的含量,显著(P<0.05)提高了小肠中次级胆汁酸和初级胆汁酸的比值以及非结合型胆汁酸和结合型胆汁酸的比值,显著(P<0.05)提高了肠道CA以及血浆TCA、TLCA的含量,没有对小肠微生物组成造成影响。上述结果表明:慢性皮质酮暴露显著影响肝脏、小肠内容物和血浆胆汁酸谱,提示慢性皮质酮暴露增加了胆汁酸从肝细胞向胆管的转运。
3糖皮质激素对AML12肝细胞MRP2基因转运胆汁酸的影响
由于慢性皮质酮暴露造成了肉鸡胆汁酸池紊乱且影响了肝细胞胆汁酸外排能力,因此本章使用AML12细胞进行体外试验,通过在细胞培养基中添加500n M地塞米松(dexamethasone,DEX)模拟肝细胞应激状态来对上述问题进行体外验证。结果显示,DEX显著(P<0.05)提升了AML12细胞转运TCA的能力,显著(P<0.05)降低了MRP2的m RNA表达水平,显著(P<0.05)上调了BSEP的m RNA表达水平,显著(P<0.05)上调了MRP2的膜蛋白表达,对BSEP的总蛋白水平没有显著影响,时钟基因PER3的蛋白表达水平也显著(P<0.05)升高。这些结果表明:糖皮质激素通过增强AML12细胞MRP2基因的蛋白表达,从而增强了肝细胞内胆汁酸向顶膜外胆管转运。