关键词： 电针   埋线   视交叉上核   Per1   Per2  

摘要： 目的： 探讨电针、埋线对吗啡成瘾小鼠自发性活动昼夜节律的调整作用及大脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)内周期基因Per1、Per2的表达的变化,以期为电针、埋线治疗药物成瘾的临床应用提供实验依据。 方法： 筛选出符合实验要求的雄性C57BL/6J近交系小鼠42只,随机分为空白组(Control, n=14)、模型组(Model, n=14)、电针组(EA, electro-acupuncture, n=7)、埋线组(CI, catgut implantation, n=7).动物模型根据“七天递增成瘾法”皮下注射盐酸吗啡注射液(20mg/kg,40mg/kg,60mg/kg,80mg/kg,100mg/kg,100mg/kg,100mg/kg),空白组在相同时间点(8am,8pm)皮下注射等量生理盐水。选取双侧“肾俞”穴(BL23),电针组小鼠每次注射完盐酸吗啡注射液15mmin后,使用韩式穴位神经刺激仪(]HANS-200)电针刺激双侧“肾俞”穴,治疗频率2/15Hz,电流0.2mA,15min/次,2次/日;埋线组小鼠于造模第一天早上8点注射盐酸吗啡注射液15mmin后,将0.5cm铬肠线埋入双侧“肾俞”穴内。第7天上午10点,腹腔注射盐酸纳洛酮注射液催瘾(4mg/kg),密切观察记录1小时内每组小鼠的戒断症状并评分。取小鼠视交叉,采用实时荧光定量PCR法检测SCN内周期基因Per1、Per2的表达水平。 结果： (1)行为学结果 ①戒断评分：空白组小鼠经纳洛酮催瘾后,无明显戒断症状表现,1小时内与平日活动时无异;模型组小鼠催瘾后1小时中,表现异常亢奋,出现戒断症状反应,如跳跃、湿狗样颤抖、腹泻、舔阴、竖尾、体重降低等,其中,跳跃、湿狗样颤抖、腹泻发生率为100%,体重减少值均大于2%,与空白小鼠相比其差异具有统计学意义(P<0.05);电针组小鼠和埋线组小鼠催瘾后1小时内虽不如模型组小鼠亢奋,但同样出现典型戒断症状表现,且分别与空白组、模型组戒断症状评分比较均有统计学意义(P<0.05)。电针组与埋线组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。 ②七天中体重：实验前每组小鼠间体重无明显差异(P>0.05),造模开始后,空白组小鼠体重无异常,随着时间增加正常波动;模型组小鼠体重七天中明显下降,且七天前后体重差值与空白组相比有统计学意义(P<0.05);电针组小鼠和埋线组小鼠七天内体重均呈下降趋势,与空白组相比差异有统计学意义(P<0.05),与模型组相比分别从第六天、第七天开始有上升恢复趋势,但其差异均无统计学意义(P>0.05);电针组与埋线组相比,其差异无统计学意义(P>0.05)。 ③昼夜节律：实验前各组小鼠间周期、振幅、活动度比较均无明显差异(P>0.05),实验开始后,空白组小鼠昼夜节律与实验前相比无异常;模型组小鼠具有明显的昼夜节律改变,表现在振幅和活动度与空白组相比具有明显差异(P<0.05),但周期比较无统计学意义(P>0.05);电针后,小鼠振幅及活动度与空白组和模型组相比均有明显改变(P<0.05),但周期比较无统计学意义(P>0.05);埋线后,振幅与空白组和模型组相比均有统计学意义(P<0.05),但周期和活动度无统计学意义(P>0.05);电针组与埋线组相比,其差异无统计学意义(P>0.05)。 (2)Per基因表达：与空白组小鼠相比,模型组小鼠SCN内Per1、Per2基因表达均下调,且差异具有统计学意义(P<0.05);电针组小鼠与空白组小鼠相比,Per1、Per2基因表达均有差异(P<0.05),与模型组小鼠相比,Per2基因表达明显上调(P<0.05),但Perl基因表达无明显差异(P>0.05);埋线组小鼠与空白组小鼠相比,Per1、Per2基因表达均有差异(P<0.05),与模型组小鼠相比,Perl基因表达明显上调(P<0.05),但Per2基因表达无统计学意义(P>0.05);电针组与埋线组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明,埋线和电针可以分别调节Per1、Per2基因的表达从而改善吗啡成瘾小鼠紊乱的节律,缓解戒断症状的形成。 结论： (1)电针、埋线都可以缓解吗啡成瘾小鼠戒断症状的严重程度,降低戒断症状的评分,减轻吗啡成瘾小鼠体重下降的趋势。 (2)电针和埋线可以明显改善吗啡成瘾小鼠昼夜节律的紊乱,电针主要表现在降低振幅和活动度,埋线主要表现在降低振幅。 (3) Per1、Per2基因的表达与成瘾行为的形成相关,吗啡成瘾后,可分别通过埋线、电针将基因的表达上调,从而达到缓解戒断症状的目的,电针治疗与埋线治疗差异不明显。

关键词： 小肠   昼夜节律基因   热应激   大鼠  

摘要： 采用石蜡切片H.E染色观察热应激大鼠小肠形态学变化,利用Realtime-PCR技术对小肠中昼夜节律相关基因的表达进行研究。结果:大鼠小肠上皮出现严重损伤,肠黏膜绒毛顶端上皮细胞脱落,固有层裸露;热应激导致Per2和DBP基因瞬时表达极大升高,节律性受到严重影响,Bmal1基因瞬时表达差异不明显,其mRNA表达量峰值后移。

关键词： 脑钠肽   慢性肾脏病   动脉粥样硬化   动态血压监测  

摘要： 目的研究脑钠肽(BNP)与慢性肾脏病(CKD)患者动脉粥样硬化及血压昼夜节律异常的关系。方法采用免疫荧光法检测108例CKD患者与18例对照组血浆脑钠肽(BNP)水平,动态血压监测(ABPM)采用携带式的动态血压检测仪。分析BNP水平与动脉粥样硬化及血压昼夜节律的关系。结果CKD患者BNP水平与对照组相比显著升高(P<0.01),Spearman相关分析提示CKD患者BNP水平和颈动脉内膜中层厚度(IMT)呈正相关,存在颈动脉斑块的患者血BNP水平显著升高。与对照组相比,CKD患者夜间收缩压和舒张压下降数值较小,血压呈明显的非勺型模式;血压昼夜节律异常的患者血BNP水平显著升高(P<0.01)。多元回归分析显示,动脉粥样硬化和血压昼夜节律异常均是影响BNP水平的危险因素。结论CKD患者BNP水平和动脉粥样硬化及血压昼夜节律异常相关,提示BNP水平可作为一项评价CKD患者动脉粥样硬化及血压节律异常的生物学指标。

关键词： 动脉粥样硬化   冠心康   ApoE基因敲小鼠   时钟基因   Bmal1   Per2  

摘要： 目的:观察中药复方制剂冠心康对Apo E基因敲除动脉粥样硬化小鼠血管壁保护及斑块的稳定作用及心脏时钟基因的调节,探讨中药干预高脂血症、动脉粥样硬化,防止心血管疾病发生的可能机制。方法:在12 h光照/黑暗条件下,54只Apo E-/-小鼠西方膳食饲料饲养至12周龄并随机分为3组,模型组、冠心康组以及辛伐他汀组,每组18只。另18只C57BL/6/J小鼠直接分至正常组。正常组及模型组每日给予生理盐水灌胃,辛伐他汀以及冠心康组每日分别予以相应药物灌胃。观察至19周龄取材。设定昼夜时点(Zeitgeber time,ZT),并根据ZT于ZT0、ZT4、ZT8、ZT12、ZT16与ZT20依次取材;采用HE染色法观察载脂蛋白E基因敲除动脉粥样硬化小鼠主动脉壁损伤情况;运用RT-PCR检测技术,检测载脂蛋白E基因敲除动脉粥样硬化小鼠心脏时钟基因Bmal1、Per2 mRNA表达水平。结果:病理研究结果提示冠心康具有一定的抗动脉粥样硬化作用。ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠心脏时钟基因昼夜表达节律与正常组比较,显著改变,提示Bmal1、Per2存在昼夜表达异常;冠心康可显著调节Bmal1及Per2基因表达昼夜节律。其中与模型组相比,冠心康组小鼠心脏Per2基因在早上8点、下午16点以及午夜0点表达含量有显著差异,P<0.05。其中在下午16点表达显著升高,而在上午8点及午夜0点表达显著降低。与模型组相比,冠心康组小鼠心脏Bmal1基因在早上8点及午夜0点表达含量均显著升高,P<0.05,其基因表达水平与正常组较为相似。结论:冠心康对ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠存在抗动脉粥样硬化的作用;冠心康对ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠心脏时钟基因Bmal1、Per2基因表达节律存在干预作用,可能是中药干预动脉粥样硬化的分子机制之一。

关键词： arrhythmia   suprachiasmatic nuclei   autonomic nervous system   circadian rhythm   METABOLISM  

摘要： Significant circadian variations exist in the frequency of cardiac arrhythmia, but few studies have examined the relation between cardiac ion channels genes and biological clocks. We investigated this relation using suprachiasmatic nuclei lesion (SCNX) and pharmacological autonomic nervous system block (ANSB) mice. Significant 24-h variations were observed in the expression of clock genes Per2, Bmal1, and Dbp and ion channel genes KCNA5, KCND2, KCHIP2, and KCNK3 in the control mice hearts. In the SCNX mice, all genes examined lost circadian rhythm. In the ANSB mice, the expressions of the three clock genes were dampened significantly but still had circadian rhythm, whereas the four ion channel gene expressions lost rhythm. Heart rate also lost circadian rhythm in both the SCNX and ANSB mice. These results suggest that some ion channel gene expressions might be regulated by the central clock in the SCN through the ANS but not the peripheral clock in the heart.

关键词： 同病异证   肝癌   下丘脑   垂体   肾上腺   昼夜节律   小鼠  

摘要： 目的揭示同病异证H22肝癌小鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)昼夜节律通路基因的表达特征。方法采用小鼠计量化四诊和辨证方法筛选获得正常小鼠、早期邪毒壅盛证和气虚证肝癌小鼠,处死取其下丘脑、垂体和肾上腺。以GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array等技术检测各组织的基因表达谱。重点分析3组织各自芯片中昼夜节律通路基因的表达特征。结果肝癌发生后,同病异证肝癌小鼠昼夜节律通路基因在①下丘脑不同程度的表达下降,且以邪毒证为甚。其中气虚证的隐铬1(光解酶样)(Cry1)、阶段基因同源物1(果蝇)(Per1)、阶段基因同源物2(果蝇)(Per2)和核受体亚家族1/组D/成员1(Nr1d1)的表达明显高于邪毒组。②垂体的表达有高有低,但在两证候中表达高低趋势一致,表达下降基因中只有邪毒组的昼夜节律运动输出周期故障(Clock)基因下调明显,而表达升高基因中除气虚证的Per1外,其他均上调明显,且邪毒高于气虚。其中气虚组的Per1和Per2表达明显低于邪毒组。③肾上腺中的表达也有高有低,其中核心基因Clock和芳烃受体核转位因子样(Arntl)均明显下调(除邪毒证的Amtl),且以气虚证为甚。而其他基因的表达与本证候Clock和Arntl基因的表达趋势,以及其在两证候间的表达趋势均显示较差的一致性。其中气虚组的Clock和Per1明显低于邪毒组,而其Nr1d1明显高于邪毒组。以上Per1基因为HPA轴共有的证候特征性基因。结论肝癌小鼠HPA轴的昼夜节律均不同程度受到影响,各组织的变化不仅与疾病本身有关,还具有明显的证候差异,其中Per1可能是HPA轴昼夜节律出现证候差异的关键基因。

关键词： PER1基因   昼夜节律   鳞状细胞   癌  

摘要： 目的探讨生物钟PER1基因在口腔鳞癌中的昼夜节律变化情况和与肿瘤体内生长的关系。方法 60只裸鼠置于12 h光照和12 h黑暗交替环境中饲养3周后,将人颊鳞癌BcaCD885细胞接种于裸鼠颊部,建立口腔颊鳞癌模型。3周成瘤后,在24 h内按灯亮后4、10、16、22 h(4 HALO、10 HALO、16 HALO、22 HALO)的4个时间点分别处死15只裸鼠,取出肿瘤,称量,常规切片在HE染色下计算各时间点肿瘤的有丝分裂指数(MI);分别用S-P免疫组化、Western blot和Real-time RT-PCR检测各时间点癌细胞中PER1蛋白和mRNA的表达;分别用方差分析和余弦分析检验各指标在4个时间点的差异性和是否具有昼夜节律性。结果颊鳞癌细胞PER1蛋白、PER1 mRNA、肿瘤MI和肿瘤质量在昼夜不同时间点具有显著性差异(P<0.01),其变化波动具有昼夜节律性特征(P<0.05);肿瘤MI和肿瘤质量与PER1的表达水平呈反比关系,PER1 mRNA表达的峰值与肿瘤MI和质量的谷值均位于活动相的中期,而PER1 mRNA表达的谷值与肿瘤MI和质量的峰值均位于休息相中期。结论口腔鳞癌中PER1的表达、肿瘤MI和质量在昼夜不同时间点的波动具有24 h昼夜节律性规律,PER1在口腔鳞癌中为抑癌基因。

关键词： STELLATE CELLS EXPRESS   AFFINITY NGF RECEPTOR   SUPRACHIASMATIC NUCLEUS   PLASMA-GLUCOSE   TARGETED MUTATION   AUTONOMIC OUTPUT   RAT   LIVER   RHYTHMS   TISSUE  

摘要： The p75 neurotrophin receptor (p75(NTR)) is a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily with a widespread pattern of expression in tissues such as the brain, liver, lung, and muscle. The mechanisms that regulate p75(NTR) transcription in the nervous system and its expression in other tissues remain largely unknown. Here we show that p75(NTR) is an oscillating gene regulated by the helix-loop-helix transcription factors CLOCK and BMAL1. The p75(NTR) promoter contains evolutionarily conserved noncanonical E-box enhancers. Deletion mutagenesis of the p75(NTR)-luciferase reporter identified the -1039 conserved E-box necessary for the regulation of p75(NTR) by CLOCK and BMAL1. Accordingly, gel-shift assays confirmed the binding of CLOCK and BMAL1 to the p75(NTR-) 1039 E-box. Studies in mice revealed that p75(NTR) transcription oscillates during dark and light cycles not only in the suprachiasmatic nucleus (SCN), but also in peripheral tissues including the liver. Oscillation of p75(NTR) is disrupted in Clock-deficient and mutant mice, is E-box dependent, and is in phase with clock genes, such as Per1 and Per2. Intriguingly, p75(NTR) is required for circadian clock oscillation, since loss of p75(NTR) alters the circadian oscillation of clock genes in the SCN, liver, and fibroblasts. Consistent with this, Per2:: Luc/p75(NTR-/-) liver explants showed reduced circadian oscillation amplitude compared with those of Per2:: Luc/p75(NTR+/+). Moreover, deletion of p75(NTR) also alters the circadian oscillation of glucose and lipid homeostasis genes. Overall, our findings reveal that the transcriptional activation of p75(NTR) is under circadian regulation in the nervous system and peripheral tissues, and plays an important role in the maintenance of clock and metabolic gene oscillation.

关键词： 细胞色素P450   CYP1A1   昼夜节律   性别特性   基因表达  

摘要： 目的探究昆明种小鼠细胞色素氧化酶1A1(CYP1A1)的昼夜节律、性别差异以及对肝毒物毒性变化的影响。方法昆明小鼠在环境控制的SPF饲养室内适应性饲养2周后,于06:00,10:00,14:00,18:00,22:00和次日02:00处死取肝,用逆转录PCR方法检测24h内核激素孤儿受体α(Rev-erbα),时钟基因(Per)1,Per2和CYP1A1,CYP1A2及其调控核受体基因AhR的表达。另取小鼠于6:00和18:00 ip给予对乙酰氨基酚500mg·kg-1,12h后检测血清中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性。结果细胞色素氧化酶基因CYP1A1,CYP1A2及其调节基因AhR在18:00左右表达最高,且雌鼠的表达高于雄鼠,在6:00左右表达最低,表达峰谷差为4～7倍,其节律变化的差异与Rev-erbα,Per1,Per2的节律差异大致相符。与此节律相对应,对乙酰氨基酚引起的肝毒性在18:00给药高于6:00给药。结论昆明种小鼠细胞色素氧化酶CYP1A1基因表达存在昼夜节律及性别差异,该差异可影响肝毒物如对乙酰氨基酚的代谢和毒性。

关键词： TRANSCRIPTION FACTOR   EXPRESSION   CLOCK   LIGHT   REVEALS   MOUSE   DIFFERENTIATION   ENTRAINMENT   ACTIVATION   MECHANISMS  

摘要： In the study of circadian rhythms, it has been a puzzle how a limited number of circadian clock genes can control diverse aspects of physiology. Here we investigate circadian gene expression genome-wide using larval zebrafish as a model system. We made use of a spatial gene expression atlas to investigate the expression of circadian genes in various tissues and cell types. Comparison of genome-wide circadian gene expression data between zebrafish and mouse revealed a nearly anti-phase relationship and allowed us to detect novel evolutionarily conserved circadian genes in vertebrates. We identified three groups of zebrafish genes with distinct responses to light entrainment: fast light-induced genes, slow light-induced genes, and dark-induced genes. Our computational analysis of the circadian gene regulatory network revealed several transcription factors (TFs) involved in diverse aspects of circadian physiology through transcriptional cascade. Of these, microphthalmia-associated transcription factor a (mitfa), a dark-induced TF, mediates a circadian rhythm of melanin synthesis, which may be involved in zebrafish's adaptation to daily light cycling. Our study describes a systematic method to discover previously unidentified TFs involved in circadian physiology in complex organisms.