关键词： Clock   Per1   Cry2   载体   双荧光素酶报告基因检测系统  

摘要： 背景:结直肠癌是世界第三大恶性肿瘤,近年来的多项研究揭示了肠道菌群失调通过多种机制促进结直肠癌的发生、发展。昼夜节律钟基因影响细胞增殖的周期和凋亡,与肿瘤密切相关。目的:研究肠道微生物对结直肠癌细胞昼夜节律基因的调控,为进一步利用微生态制剂辅助治疗结直肠癌以及依据昼夜节律选择用药时机提供实验基础。方法:利用生物信息学软件UCSC Genome Browser Gateway和Promoter Scan预测人体昼夜节律基因Clock、Per1、Cry2三个基因的启动子,利用Primer Premier网站设计启动子引物。人结肠癌HCT116细胞和RKO细胞培养后提取DNA,使用上述三个基因启动子引物进行模板DNA的扩增。扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳鉴定后胶回收,回收产物与p GEM?-T Easy载体连接后转化,进行蓝白斑筛选,菌液PCR鉴定后送基因公司测序。菌液提取启动子质粒后双酶切,双荧光素酶报告基因载体（PGL3-Basic）双酶切,酶切产物PCR鉴定后利用T4 DNA连接酶连接启动子质粒与双荧光素酶报告基因。基因测序鉴定重组载体,验证重组载体构建成功。使用转染试剂将三种重组载体质粒共转染到HCT116细胞,加入大肠杆菌及其代谢产物,利用双荧光素酶基因检测系统检测活性（每4小时一次,共检测12次共48小时）,进而确定大肠杆菌对三种昼夜节律基因表达的节律性调控。结果:含有启动子的重组质粒菌液测序结果与Gene Bank的序列一致,成功构建了含有Clock、Per1、Cry2启动子的双荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因测定结果表明:大肠杆菌及其代谢产物能使Per1基因表达高峰前移,大肠杆菌及其代谢物能调控Per1基因的表达。结论:成功构建三组重组载体,双荧光素酶报告基因检测结果显示大肠杆菌及其代谢产物能调控Per1基因的表达。

关键词： 婴儿痉挛症   褪黑素   ACTH   昼夜节律   昼夜节律基因  

摘要： 研究背景及目的:婴儿痉挛症(IS)是儿童期最常见的灾难性癫痫综合征之一。该综合征主要表现为痉挛发作、脑电图高度失律和精神运动发育迟滞。其痉挛发作具有昼夜节律性。而褪黑素作为人体分泌的一种胺类激素,由昼夜节律调节,同时亦可反过来调节昼夜节律。昼夜节律形成的关键点在于昼夜节律基因的表达,其中核心基因为BMAL1和CLOCK基因,以及其靶基因Per及Cry基因。目前对婴儿痉挛症的发病机制并未完全明确,但是相关文献报道癫痫与褪黑素及昼夜节律关系密切。故本实验旨在探讨婴儿痉挛症与褪黑素及昼夜节律因子的关系,并进一步探索新的治疗方案。方法:①根据2010年婴儿痉挛症诊断标准选取解放军总医院2017年3月-2017年9月间住院3岁以内婴儿痉挛症患儿39例作为病例组,从呼吸道或泌尿系感染病人中,选取无癫痫及其他神经精神疾病42例作为对照组,使用酶联免疫法(ELISA法)检测两组血清中的褪黑素(MT)、5-羟色胺(5-HT)、催乳素(PRL)及一氧化氮(NO)水平,并比较血清中的MT、5-HT、PRL及NO水平在对照组与病例组,以及病例组ACTH治疗前后的差异。②选择雄性SD大鼠9只,雌性SD大鼠18只,部分雌鼠怀孕后给予冷水游泳产前应激,在其子代出生后给予NMDA注射,建立婴儿痉挛大鼠模型,对其痉挛发作潜伏期、频率以及严重程度予以记录,并通过Western blot对其下丘脑的昼夜节律基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Cry1、Cry2的表达水平进行分析。结果:①病例组血清MT(7.1±1.9)pg/ml及5-HT(1183.3±258.9)mIU/L水平相比对照组可见明显减低(P<0.05),而PRL(523.1±109.4)mIU/L及NO(101.3±22.1)μmol/L相比对照组可见明显增高(P<0.05)。病例组在 ACTH 治疗后 MT(9.2±1.9)pg/ml 及 5-HT(1366.0±236.9)mIU/L较治疗前升高(P<0.05);PRL(408.2±93.4)mIU/L较治疗前减低(P<0.05);NO(96.3±21.9)μmol/L与治疗前无明显差异(P=0.261)。②与健康对照组相比,可见产前应激+NMDA组大鼠的痉挛发作的发作潜伏期、痉挛程度评分均存在明显差异。对比产前应激+NMDA组,产前应激+NMDA+ACTH组、产前应激+NMDA+褪黑素组、产前应激+NMDA+ACTH+褪黑素组中大鼠的痉挛发作的发作潜伏期、临床评分在均可见明显差异。而与健康对照组相比,所有产前应激+NMDA组中大鼠的昼夜基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Cry1、Cry2均呈低表达状态,在给予ACTH或(及)MT治疗后,其表达可见明显增强。结论:婴儿痉挛症患儿的血清MT、5-HT、PRL及NO的表达水平可见明显异常,经过ACTH治疗后可以发现MT、5-HT的水平明显回升,PRL水平则出现回落,NO水平未见显著变化。推测褪黑素及其相关激素水平的异常以及互相作用,在婴儿痉挛症发病过程中可能起到重要作用;婴儿痉挛症大鼠模型中的昼夜节律因子可见明显的低表达状态,而在给予ACTH或(及)MT治疗后可见明显的回升,故昼夜节律因子的低表达可能是婴儿痉孪症发病的基础。

关键词： 职业危害因素   暴露组   昼夜节律基因   交互作用   钢铁企业   代谢综合征  

摘要： 目的 1探讨职业有害因素暴露组(高温、噪声、粉尘、一氧化碳、夜光暴露、倒班)及其交互作用与钢铁工人代谢综合征(Metabolic syndrome,MetS)及组分的关联性,寻找影响钢铁工人MetS及组分的优先可干预的职业环境因素;2探讨昼夜节律相关基因(CLOCK、RORA和PER2)、相关激素受体基因(MTNR1A和MTNR1B)多态性及其单体型与钢铁工人MetS的关联性,为钢铁工人MetS发生的遗传流行病学机制的研究提供线索;3探讨昼夜节律相关基因、相关激素受体基因多态性之间及其与职业有害因素暴露组之间的交互作用与钢铁工人MetS的关联性,为钢铁工人MetS发生的遗传和环境因素共同作用机制的研究提供线索。方法 1基于课题组在2017年2月至2017年6月建立的京津冀地区职业人群健康效应队列研究的基线资料,采用横断面研究设计,以问卷及体检信息完整的7664名钢铁工人作为研究对象。其中个体的机体因素、行为生活方式、社会经济和工作情况采用调查问卷收集;职业危害因素暴露量通过现场卫生学调查收集;血压、血糖、血脂和高密度脂蛋白胆固醇等生化指标通过实验室检测收集;人体测量学指标(腰围、腹围和颈围等)通过体格检查获取。以有害因素暴露组作为主要研究因素,采用限制性三次性样条函数(Restricted cubic spline,RCS)探索有害因素暴露组和MetS的剂量反应关系,采用非条件logistic回归方法分析有害因素暴露组和MetS的关联性(包括累积效应和交互效应),并使用健康危险因素评分法(Health risk factor score,HRFS)探讨职业有害因素联合暴露对MetS的影响。2采用病例对照研究方法,使用SAS9.4编程从7664人中根据纳入和排除标准选择621名患MetS的职工作为病例组,选择898名与病例年龄和性别匹配的健康职工作为对照组。使用聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性检测CLOCK(rs6850524和rs1801260)、RORA(rs8034880)、PER2(rs934945和rs2304672)、MTNR1A(rs2119882)和MTNR1B(rs10830963和rs1387153)基因多态性。使用非条件logistic回归方法分析不同遗传模型下昼夜节律相关基因与MetS之间的关联性。3采用病例对照研究方法,使用对数线性模型分析职业有害因素暴露组和昼夜节律相关基因两两之间的相乘和相加交互及其累积效应;采用广义多因子降维(Generalized multifactor dimensionality,GMDR)方法分析职业有害因素暴露组和昼夜节律相关基因之间的高维交互作用。结果 1横断面研究结果显示:1)钢铁工人MetS的患病率为37.0%,其中男性患病率为37.9%,女性患病率为26.1%;MetS组分中,腹型肥胖、甘油三酯升高、高密度脂蛋白胆固醇降低、血压升高和血糖水平升高的职工分别占46.6%、32.2%、21.4%、57.9%和60.8%。2)剂量反应关系分析结果显示:校正可能的混杂因素后,加权倒班作业指数(Weighted shift index,WSI)与钢铁工人MetS之间呈现线性剂量反应关系(总体关联性检验x=9.351,P=0.025;非线性检验x=0.180,P=0.915);高温累积暴露量与钢铁工人MetS之间呈现线性剂量反应关系(总体关联性检验x=8.611,P=0.035;非线性检验x=0.532,P=0.766);噪声累积暴露量与钢铁工人MetS之间呈现非线性剂量反应关系(总体关联性检验x=21.400,P<0.001;非线性检验x=7.182,P=0.028);未发现粉尘累积暴露量与钢铁工人MetS之间有关联(总体关联性检验x=2.910,P=0.406;非线性检验x=0.582,P=0.746);CO累积暴露量与钢铁工人MetS之间呈现非线性剂量反应关系(总体关联性检验x=10.070,P=0.018;非线性检验x=8.071,P=0.017)。3)有害因素暴露组与钢铁工人MetS多因素分析结果显示:与参照组(WSI<551.278天)相比,钢铁工人WSI指数在551.278475.082、1475.082384.207和≥2384.207天组时,其患MetS风险的OR(95%CI)值分别为1.075(0.929.243)、1.088(0.938.262)和1.204(1.037.397);与参照组(<393.270℃·年)相比,钢铁工人高温累积暴露量在393.27019.876,619.87669.623和≥769.623℃·年组时,其患MetS风险的OR(95%CI)值分别为1.096(0.923.301)、1.286(1.048.579)和1.455(1

关键词： 动脉粥样硬化   生物钟基因   Clock/Bmal1   昼夜节律   糖脂代谢   炎症反应   内皮细胞功能  

摘要： 越来越多的证据表明,生物钟基因在人体组织代谢、肥胖、血管功能、炎症免疫反应等方面都发挥着重要作用,而Clock/Bmal1基因在昼夜节律的调节过程中起着至关重要的作用。在动脉粥样硬化(AS)的发生发展过程中糖脂代谢异常、炎症免疫反应以及血管内皮功能障碍均发挥着重要作用,Clock/Bmal1基因可以通过调节机体的糖脂代谢、炎症反应以及内皮细胞功能来影响AS的形成,这可为寻找AS相关性疾病新的预防和治疗靶点提供理论基础。

关键词： 内分泌干扰物   邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯   昼夜节律   基因  

摘要： 目的探讨出生前邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)暴露对成年后子代大鼠的昼夜节律相关基因表达的影响。方法将32只健康SD妊娠大鼠分为对照(玉米油)组和2、10、50 mg/kg DEHP染毒组,每组8只。在母鼠妊娠第14日至19日进行灌胃染毒,每日1次。子代大鼠于10周龄时,采用实时荧光定量PCR法检测下丘脑SCN核区Clock、Arntl、Dbp、Period1和Period2 5个昼夜节律相关基因的表达水平。结果与对照组相比,10、50 mg/kg DEHP染毒组成年雄性子代大鼠下丘脑SCN核团Dbp基因的表达水平下调,差异均有统计学意义(P<0.05);而各剂量组DEHP染毒组成年雄性大鼠下丘脑SCN核团的Clock、Arntl、Per1、Per2基因的表达水平均无明显改变。与对照组比较,50mg/kg DEHP染毒组成年雌性子代大鼠下丘脑SCN核团的Clock、Per1基因的表达水平均升高,差异有统计学意义(P<0.01);而各剂量DEHP染毒组成年雌性子代大鼠下丘脑SCN核团的Arntl、Dbp、Per2基因的表达水平均无明显改变。结论出生前DEHP暴露可能通过改变大鼠下丘脑SCN核区昼夜节律相关基因的表达影响成年后大鼠的昼夜节律调控功能,且这种影响具有性别差异。

关键词： 缺血性心脏病   时钟基因   昼夜节律  

摘要： 缺血性心脏病是一种常见的临床疾病。心肌组织缺血缺氧导致心肌细胞坏死,进而产生心脏泵血功能以及循环障碍,严重影响人类健康及生活质量。研究表明,急性心肌梗死的发生率在一日中呈周期性节律振荡,并在早晨至上午这一时段达到高峰。时钟基因与昼夜节律参与缺血性心脏病病程的机制已成为近年来研究的重点。大量研究表明,时钟基因与昼夜节律的紊乱通过调节代谢、自噬与氧化应激水平,介导血管损伤,影响心肌缺血/再灌注损伤,在缺血性心脏病的发生发展中发挥着重要作用。

关键词： 异钩藤碱   AT1R-Src信号途径   时钟基因   昼夜节律   A7r5细胞系  

摘要： 【目的】探讨异钩藤碱通过血管紧张素1型受体(AT1R)对血管平滑肌细胞(A7r5细胞)时钟基因昼夜节律改变的调控作用。【方法】采用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导A7r5细胞构建时钟基因节律改变模型。实验分为正常对照组、模型组(AngⅡ剂量为0.1μmol/L)、异钩藤碱组(异钩藤碱剂量为31μmol/L)和异钩藤碱联用缬沙坦(AT1R阻滞剂)组(异钩藤碱31μmol/L、缬沙坦10μmol/L)。采用实时定量聚合酶链反应(q PCR)法检测各个时间点不同组A7r5细胞中AT1R、Per2、Bmal1、Clock基因的表达水平,建立数学模型计算不同参数间的差别。采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测各个时间点不同组A7r5细胞中Src和p-Src蛋白表达情况。【结果】A7r5细胞经AngⅡ(0.1μmol/L)作用后,AT1R、Per2、Bmal1、Clock基因出现昼夜节律改变,呈现反杓型波动;Src蛋白磷酸化表达增加。异钩藤碱(31μmol/L)作用后,上述时钟基因表达恢复正常的杓型波动。异钩藤碱(31μmol/L)与缬沙坦(10μmol/L)联用后,上述时钟基因的昼夜节律受到一定程度的抑制,各组细胞的中值、振幅和峰相位发生不同程度的改变,Src蛋白磷酸化水平下调。【结论】异钩藤碱通过AT1R-Src信号途径可调控AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞时钟基因表达的昼夜节律改变。

关键词： 天麻钩藤饮   时钟基因   AT1R信号通路   昼夜节律  

摘要： 目的观察天麻钩藤饮对AngⅡ诱导的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞A7r5中时钟基因(Per2、Bmal1、Clock)、AT1R基因及Src、p-Src蛋白昼夜节律表达的影响,探讨天麻钩藤饮通过AT1R信号途径调节时钟基因昼夜节律变化的可能机制。方法以AngⅡ诱导A7r5细胞建立时钟基因昼夜节律变化模型,将细胞模型分为AngⅡ诱导组、天麻钩藤饮组。AngⅡ诱导组以终浓度为100 nmol·L^(-1)的AngⅡ诱导24 h,天麻钩藤饮组以终浓度为100 nmol·L^(-1)的AngⅡ和200 mg·L^(-1)的天麻钩藤饮处理24 h,以加样时间为ZT0,每隔4小时收集细胞,提取蛋白和RNA,采用Q-PCR方法检测各时间点A7r5细胞中的时钟基因(Per2、Bmal1、Clock)和AT1R基因表达水平,Western Blot检测各时间点A7r5细胞中Src、p-Src蛋白表达水平。结果 AngⅡ作用于A7r5细胞后,时钟基因Bmal1和Per2表达中值升高,峰相位前移,呈现出与正常细胞不同的昼低夜高的反杓型节律变化;AT1R基因表达水平显著升高、Src、p-Src蛋白表达亦呈现出昼低夜高的反杓型节律变化;与AngⅡ诱导组相比,天麻钩藤饮组A7r5细胞Bmal1、Per2基因m RNA表达中值降低,呈现昼高夜低的杓型节律变化,AT1R基因及Src、p-Src蛋白的表达水平下降,呈现类似空白对照组的昼夜节律变化。结论天麻钩藤饮能够通过AT1R信号通路调节AngⅡ诱导的A7r5细胞时钟基因昼夜节律改变。