关键词： 急性淋巴细胞白血病   Notch信号通路   调节性T细胞  

摘要： [目的]观察急性B淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)患者外周血Notch信号通路分子表达和CD4^(+)CD25^(+)CD127^(dim/-)调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)水平,评估Notch信号通路对B-ALL患者Treg活性的影响。[方法]入组31例B-ALL患者和20名对照者,分选血浆和外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),纯化CD4^(+)CD25^(+)CD127^(dim/-)Treg。实时定量PCR法检测PBMC中Notch1~4、Hes1、Hes5 mRNA相对表达量,流式细胞术检测CD4^(+)CD25^(+)CD127^(dim/-)Treg比例,酶联免疫吸附实验检测血浆白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)和IL-35水平。使用Notch信号通路抑制剂GSI刺激B-ALL患者分选的PBMC,检测细胞增殖、Treg比例、IL-10和IL-35表达变化。使用GSI刺激BALL患者纯化的Treg,与自体PBMC以1∶10比例共培养,检测细胞增殖、IL-10、IL-35、干扰素-γ水平变化。两组间比较采用独立样本t检验或配对t检验。[结果]B-ALL患者PBMC中Notch受体(包括Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)和Notch下游信号分子Hes1、Hes5 mRNA相对表达量均较对照者升高(P<0.001)。B-ALL患者CD4^(+)CD25^(+)CD127^(dim/-)Treg比例高于对照者(8.90%±2.41%vs 4.68%±1.01%,P<0.001)。B-ALL患者外周血IL-10和IL-35水平均高于对照者(P<0.05)。GSI刺激后B-ALL患者PBMC增殖水平与无GSI刺激组差异无统计学意义(P=0.689),但GSI刺激后Treg比例和IL-10、IL-35水平均较无GSI刺激组降低(P<0.05)。使用GSI刺激Treg后与自体PBMC共培养,其抑制PBMC增殖的能力减弱(P<0.001),IL-10和IL-35水平减少(P<0.05),但干扰素-γ水平增加(P<0.001)。[结论]B-ALL患者外周血中Notch受体表达升高可能诱导CD4^(+)CD25^(+)CD127^(dim/-)Treg数量增加和免疫抑制活性增强。

关键词： 幽门螺杆菌   调节性B细胞   儿童   细胞因子   转化生长因子-β  

摘要： 背景成人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)相关性消化系统疾病与儿童时期Hp感染密切相关。Hp可以在胃中定植数年,是引起慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等胃肠道疾病的主要原因。以往研究提示宿主的免疫反应在Hp诱导胃粘膜损伤中起着重要作用。先天性免疫机制依赖于模式识别受体与病原表面的病原体相关分子模式;而获得性免疫机制中,T细胞对Hp的反应主要是由胃粘膜中的辅助性T细胞决定。除此之外,Hp还可以引起调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)反应来抑制免疫和炎症反应,从而维持Hp慢性炎症反应。关于B细胞在Hp感染致病机制中的作用至今仍有很多未知。调节性B细胞(regulatory B cell,Breg)是一类通过白细胞介素(interleukin,IL)-10、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等功能性细胞因子或直接接触发挥负向调节免疫功能的,B细胞亚群。在慢性炎症过程中,Breg可以抑制T细胞增殖,诱导Treg,减少巨噬细胞吞噬和抗原呈递,并抑制细胞毒性T细胞。最近有国外文献表明成人Hp感染患者存在Breg数量及功能的变化,但鉴于成人与儿童的免疫反应差异,儿童Hp感染时期,Breg及相关细胞因子是否参与到免疫反应中以及是如何变化的,至今国内外未见有研究报道。因此,本文分析了表型为CD19+CD5+CD1d+B细胞中分泌IL-10+的调节性B细胞即CD19+CD5+CD1d+IL-10+B细胞(也叫B10细胞)及相关细胞因子TGF-β在儿童Hp感染相关胃炎的表达水平,对进一步探究儿童Hp感染的免疫机制具有重要意义。目的通过检测Hp感染患儿、非Hp感染患儿和健康儿童的外周血中B10细胞比例及相关细胞因子TGF-β的表达水平差异,探究B10、TGF-β表达水平在儿童Hp感染中的作用,同时确定B10、TGF-β与胃黏膜病理慢性炎症评分、腹痛评分即疼痛视觉模拟评分(Visual Analogue Score,VAS)、儿童Hp感染相关的不同临床结局,如胃炎、消化性溃疡等疾病的关系。方法本研究收集42例有胃肠道症状且需要进行儿童无痛电子胃镜检查的患儿,其中22例Hp感染、20例非Hp感染和同期20例健康儿童。就诊时收集患儿一般临床资料同时进行腹痛VAS评分,内镜检查时留取胃黏膜病理送检,并进行病理慢性炎症评分;留取外周静脉血2mL,应用流式细胞仪检测CD19+CD5+CD1d+Breg 比例、B10细胞比例。用酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中 TGF-β的表达水平。利用 SPSS 26.0软件行统计学分析,比较3组之间的CD19+CD5+CD1d+Breg 比例、B10细胞比例、TGF-β表达水平差异,分析儿童Hp感染与外周血B10细胞比例、TGF-β的关系,再根据内镜下诊断胃炎、消化性溃疡分组,分别比较Hp感染不同临床结局的B10细胞比例、TGF-β的变化。结果(1)Hp感染患儿、非Hp感染患儿及健康儿童之间外周血的CD19+CD5+CD1d+Breg 比例、B10细胞比例、TGF-β表达水平有差异(P<0.05)。与非Hp感染组和健康对照组相比,Hp感染组CD19+CD5+CD1d+Breg 比例、B10细胞比例、TGF-β表达水平明显升高(P<0.05)。与健康对照儿童相比,非Hp感染组CD19+CD5+CD1d+Breg比例、B10细胞比例、TGF-β表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。(2)Hp感染患儿外周血的B10细胞比例与TGF-β水平呈正相关(r=0.690,P<0.05)。Hp感染患儿外周血的B10细胞比例与腹痛评分、胃黏膜病理慢性炎症评分无明显相关性(P>0.05)。非Hp感染患儿的B10细胞比例与患儿TGF-β水平、腹痛评分、胃黏膜病理慢性炎症评分无明显相关性(P>0.05)。(3)内镜诊断为胃炎、消化性溃疡、正常的患儿,三组Hp感染率的差异无统计学意义(P>0.05)。消化性溃疡组外周血的CD19+CD5+CD1d+Breg 比例、B10细胞比例、TGF-β表达水平均明显高于正常组和胃炎组,差异均有统计学意义(P<0.05)。正常组和胃炎组外周血的CD19+CD5+CD1d+Breg比例、B10比例、TGF-β表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。(4)Hp感染患儿中,消化性溃疡组外周血的B10比例均明显高于正常组和胃炎组,消化性溃疡组外周血的TGF-β表达水平明显高于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05)。非Hp感染患儿中各组患儿外周血的CD19+CD5+CD1d+Breg比例、B10细胞比例、TGF-β表达水平均无统计学意义(P>0

关键词： PD-L1/PD-1   急性髓系白血病   调节性B细胞   T细胞  

摘要： 目的:调节性B细胞(regulatory B cell,Breg)是重要的免疫负调节细胞,在维持机体的免疫平衡状态,调节T细胞功能等方面发挥着重要作用。我们前期实验发现Breg细胞在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者中表达比例升高,且与不良预后相关。继往有文献报道Breg细胞通过白细胞介素(interleukin,IL)-10参与机体免疫调控,也有文献报道Breg细胞可能通过非IL-10途径比如程序性死亡配体-1(Programmed death-ligand 1,PD-L1)途径发挥免疫调节作用。PD-L1作为免疫检查点在多种实体肿瘤中表达升高,Breg细胞可能通过高表达PD-L1与T细胞上程序性细胞死亡蛋白-1(programmed cell death protein 1,PD-1)结合,抑制T细胞功能,使肿瘤发生免疫逃逸,但PD-L1在AML患者Breg细胞上的表达与作用尚不清楚。基于以上背景,本实验旨在研究AML患者的Breg细胞是否存在PD-L1高表达,并探究其与AML患者的不良预后是否存在相关性。方法:1、用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测10名AML患者及10名健康对照者血浆上清中IL-10、PD-1及PD-L1的表达情况;2、采用流式细胞术检测21名初诊AML患者不同阶段(初诊患者化疗前的骨髓及外周血、化疗后7天的骨髓及外周血,化疗后14天的外周血)和38例健康对照者(28例骨髓,10例外周血)的Breg细胞比例、Breg细胞PD-L1表达量及T细胞PD-1的表达情况,对各检测结果进行统计学分析;3、随访患者化疗后缓解及生存情况,评估高表达PD-L1的Breg细胞与AML患者预后的关系。结果:1、AML患者血浆中PD-1及PD-L1与健康对照者相比表达增高(P=0.0437,P=0.0009),而IL-10的表达两者无明显差异(P=0.97);2、Breg细胞在AML患者中骨髓及外周血中比例较健康对照者增高(均有P<0.0001);3、AML患者的骨髓及外周血的Breg细胞PD-L1表达量及CD3CD4T细胞PD-1表达量均高于健康对照者(分别为P<0.0001,P=0.0011,P<0.0001,P=0.0249),在经过诱导化疗后两者表达均有显著下降;4、Breg细胞PD-L1高表达组诱导化疗后完全缓解率明显降低,总生存期(overall survival,OS)降低但无统计学差异(P=0.17),无进展生存期(progression free survival,PFS)明显降低且具有显著性差异(P=0.035)。结论:AML患者的Breg细胞表达PD-L1,且表达量较健康对照显著升高;高表达PD-L1的Breg细胞与AML患者完全缓解率降低、PFS显著下降相关。

关键词： Tim-1   调节性B细胞   前房相关免疫偏离   免疫调节  

摘要： 目的:通过建立ACAID体外模型,选取调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs)为研究对象,以抗Tim-1抗体RMT1-10作为干预药物,明确角膜移植免疫排斥反应中调节性B细胞对ACAID的作用及机制。方法:F4/80APC细胞和B细胞的磁珠分选纯化后共培养,分别采用Western-blot技术、PCR技术以及FACS技术检测该共培养体系中Tim-1蛋白表达、Tim-1m RNA表达和Tim-1IL-10细胞比例;观察RMT1-10对该共培养体系的干预作用。将上述培养体系中ACAID B细胞和天然CD4T细胞分选纯化后共培养,采用FACS技术观察ACAID B细胞对CD4T细胞分化及其细胞因子分泌的影响;观察IL-10阻断对该共培养体系的干预作用;采用Luminex技术检测该共培养系统上清液中细胞因子含量。采用FACS技术观察ACAID B细胞对CD4T细胞增殖和凋亡的影响;观察IL-10阻断的干预作用。采用局部过继转移(LAT)实验检测获取自上述共培养体系的T细胞对DTH实验的影响。结果:F4/80细胞与B细胞共培养体系中:Tim-1蛋白表达发生了明显改变,其中F4/80细胞+B细胞组Tim-1蛋白相对表达量较单独B细胞培养组明显增多且对RMT1-10具有明显的剂量依赖性。F4/80细胞+B细胞组Tim-1m RNA表达量较单独B细胞培养组明显增多也对RMT1-10具有明显的剂量依赖性。F4/80细胞+B细胞组Tim-1IL-10细胞百分比与单独B细胞培养组没有明显差异,与添加RMT1-10同型对照组相比也没有明显差别,但对添加的RMT1-10同样具有明显的剂量依赖性。ACAID B细胞与CD4T细胞共培养体系中:FACS检测结果显示:CD4IFN-γ细胞比例随ACAID B细胞增加而减少。IL-10阻断后,CD4IFN-γ细胞比例较IL-10未阻断对照组明显增多。CD4IL-17细胞比例随ACAID B细胞增加而减少,但在IL-10阻断后,CD4IL-17细胞比例仅在T:B为2:1和1:1时较IL-10未阻断对照组略微增多,其他比例下没有明显差异。CD4Foxp3细胞比例随着ACAID B细胞增加而增多。IL-10阻断后,CD4Foxp3细胞比例较未阻断对照组明显减少且随ACAID B细胞增多而减少。Luminex检测结果显示:共培养体系上清液中IL-10含量随ACAID B细胞增加而增加,相反,IFN-γ和IL-17含量随着ACAID B细胞增加而减少。增殖抑制试验结果显示:CD4T细胞凋亡率随ACAID B细胞增加而减少,IL-10阻断可以升高CD4T细胞的凋亡率。CD4T细胞的增殖率随ACAID B细胞增多而上升,而阻断IL-10使CD4T细胞的增殖率明显上升。LAT检测结果显示:ACAID体外模型中的T细胞能明显抑制DTH反应,经过RMT1-10干预的ACAID模型脾细胞抑制能力较未干预组更强。结论:Tim-1Bregs参与ACAID形成,其作用为促进CD4T细胞增殖抑制其凋亡,使其分化发生由Th1和Th17偏向Tregs方向,诱导生成抑制性Tregs细胞,最终抑制DTH反应。由于这一过程可以被RMT1-10所增强,因此也为阐明RMT1-10的作用机制和优化角膜移植排斥反应防治方案制定提供了理论依据。

关键词： 调节性B细胞   过敏性紫癜   白细胞介素-10  

摘要： 目的:观察过敏性紫癜（HSP）儿童急性期外周血调节性B细胞水平的变化,探讨其在儿童过敏性紫癜发病机制中的作用。方法:选取2021年5月～2022年8月济宁医学院附属医院儿科收治的急性HSP患儿60例作为HSP组,其中男性33例,女性27例,男女比例为（1.2:1）,平均年龄7.39±2.97岁。再根据有无肾脏损伤,将HSP组分为无肾损伤组（NHSPN,35例）及HSP有肾损伤组（HSPN,25例）。同期选取医院健康管理中心健康查体的同龄儿40例作为对照组,其中男性25例,女性15例,男女比例为（1.7:1）,平均年龄7.00±2.91岁。用流式细胞术检测外周血CD19CD38B细胞（调节性B细胞,Breg）、CD19B细胞、CD4T细胞、CD8T细胞、NK细胞的百分数及CD4T/CD8T比值,流式细胞仪微球法检测血清白细胞介素-10（IL-10）水平,应用免疫比浊散射法测定外周血免疫球蛋白Ig M、Ig G、Ig A、Ig E水平及免疫比浊透射法测定24h尿蛋白定量水平。采用统计学软件SPSS25.0对资料分析,采用t检验法比较HSP组和对照组淋巴细胞亚群百分数、免疫球蛋白水平的差异,采用pearson相关性分析法对CD19CD38B细胞与以上部分淋巴细胞亚群百分数、免疫球蛋白水平等指标进行相关性分析;多组间参数比较均采用单因素方差法分析,两两比较行LSD-t检验。结果:1.各组儿童外周血CD19+CD38+B细胞百分数变化:HSP组CD19+CD38+B细胞百分数明显低于正常对照组（P<0.01）,HSPN组及NHSPN组CD19+CD38+B细胞百分数均低于正常对照组,（P<0.01,P<0.05）。HSPN组CD19+CD38+B细胞百分数低于NHSPN组（P<0.05）差异有统计学意义。2.各组儿童外周血IL-10水平变化:HSP组IL-10水平明显低于正常对照组,差异具有显著统计学意义（P<0.01）。HSPN组和NHSPN组IL-10水平均明显低于正常对照组,差异具有显著统计学意义（P均<0.01）。HSPN组IL-10水平低于NHSPN组（P<0.05）。***患儿外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD19+B细胞、NK细胞百分数、CD4+T/CD8+T比值及免疫球蛋白水平的变化:HSP组CD4+T细胞、NK细胞百分数、CD4+T/CD8+T比值、及Ig M水平均明显低于正常对照组（P均<0.01）;HSP组CD19+B细胞百分数、Ig A、Ig G、Ig E水平均明显高于正常对照组,差异均有显著统计学意义（P均<0.01）;CD8+T细胞百分数高于正常对照组（P均<0.05）。***组患儿外周血CD19CD38B细胞百分数与IL-10水平相关性分析:CD19CD38B细胞百分数与IL-10水平呈正相关（r=0.85,P=0.00）;***组患儿外周血CD19CD38B细胞百分数与部分免疫学指标（淋巴细胞亚群、免疫球蛋白）相关分析:CD19CD38B细胞百分数与CD19B细胞百分数无相关性（r=0.08,P=0.426）;CD19CD38B细胞百分数与CD4T细胞百分数无相关性（r=0.09,P=0.371）;CD19CD38B细胞百分数与CD8T细胞百分数无相关性（r=0.048,P=0.635）;CD19CD38B细胞百分数与Ig G、Ig A水平均呈负相关（Ig G r=0.203P=0.043,Ig A r=0.245 P=0.014）。***组患儿CD19CD38B细胞百分数与24小时尿蛋白定量相关性分析:CD19CD38B细胞百分数与24小时尿蛋白定量呈负相关性（r=0.317,P=0.029）。结论:***患儿外周血调节性B细胞百分数明显降低,HSPN组调节性B细胞百分数亦明显低于NHSPN组,提示调节性B细胞在HSP及HSPN的发病机制中具有重要意义;***患儿外周血调节性B细胞百分数及血清IL-10水平均明显降低,且两者水平呈正相关,提示调节性B细胞可能通过分泌IL-10发挥作用,参与HSP的免疫发病机制;***患儿调节性B细胞百分数与部分免疫学指标存在相关性,提示HSP儿童调节性B细胞数量减低与免疫功能紊乱间存在一定关联性。

关键词： 原发免疫性血小板减少症   骨髓   调节性B细胞   浆细胞   细胞因子   Bruton酪氨酸激酶   B细胞   Fcγ受体   巨噬细胞   克隆造血   鉴别诊断   预后  

摘要： 第一部分:ITP骨髓B细胞微环境失衡及其机制研究研究背景:原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)是常见的自身免疫性出血性疾病,以外周血血小板数目减少和出血风险增加为临床特点。ITP的发病机制复杂且具有异质性,主要包括细胞免疫和体液免疫介导的血小板破坏过多,以及巨核细胞成熟障碍引起的血小板生成减少两大类。尽管ITP的诸多异常靶点已经被挖掘,其诊断依然缺乏特异性“金标准”,依赖于排除其他导致血小板减少的原因。同时,仅约2/3的患者对一线治疗反应,相当一部分患者经多线联合治疗仍无效,进展为难治性病例。因此,有必要进一步探究ITP的发病机制,为其精准诊疗提供新的策略。B细胞作为抗体的来源和产生免疫记忆的淋巴细胞,在自身免疫病中的作用不容小觑。一方面,B细胞对自身抗原失耐受后分化为浆细胞产生致病的自身抗体;另一方面,调节性B细胞(regulatory B cell,Breg)也可以通过其免疫抑制特性发挥抗炎作用。自身反应性B细胞在ITP的发生发展中处于核心地位。前期已有研究表明ITP患者外周血B细胞亚群紊乱,但覆盖群体不全面,趋势也存在争议;关于骨髓的研究多聚焦于T细胞和间充质干细胞,B细胞则鲜有报道。骨髓作为B细胞发育的场所,探究其微环境有助于揭示B细胞分化、趋化以及免疫耐受情况,从而进一步完善ITP的发病机制。研究目的:(1)探究ITP患者骨髓和外周血中总B细胞、各分化阶段B细胞亚群以及浆细胞与健康供者的差异,明确ITP患者存在的B细胞分化发育异常。(2)探究ITP患者骨髓B细胞免疫耐受状态,并利用动物模型验证Breg输注治疗ITP的可行性。(3)探究ITP患者B细胞成熟和趋化相关细胞因子及其受体的表达,分析与B亚群数量和分布的相关性,进一步完善ITP的发病机制。研究方法:(1)标本收集:收集初诊初治的ITP患者以及健康干细胞供者的骨髓和外周血;分离血浆,利用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMCs)和外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。(2)酶联免疫吸附试验:检测血浆趋化因子CXCL13、B细胞活化因子(B cell activating factor,BAFF)、增殖诱导配体(a proliferating inducing ligand,APRIL)和抗血小板膜糖蛋白(CD41a和CD42b)抗体。(3)流式细胞术:检测未成熟B细胞、初始B细胞,记忆B细胞,Breg,浆母细胞,短寿命/长寿命浆细胞,趋化因子受体CXCR5、细胞因子受体BAFF-R、BCMA和TACI的表达。(4)实时荧光定量聚合酶链式反应:留取PBMCs和BMMCs的mRNA,检测B细胞分化相关转录因子的表达;留取免疫磁珠分选后B细胞的mRNA,检测趋化因子受体/细胞因子受体在B细胞中的表达水平。(5)Breg体外功能试验:对B细胞体外加以CD40配体和Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)刺激因子CPG-ODN诱导活化,并分别与同源单核细胞和CD4+T细胞共培养,检测共培养前后单核细胞分泌TNF-α的水平、CD4+T细胞分泌IFN-y的水平以及调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的分化程度。(6)ITP主动模型构建:利用C57BL/6背景的野生鼠血小板免疫同源CD61基因敲除(CD61 knockout,CD61-KO)鼠,取免疫好的后者脾细胞腹腔输注给200cGy 辐照过的严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠。(7)Breg体内功能试验:对照组为不加干预的ITP主动模型小鼠;实验组分别为输注野生鼠骨髓Breg的主动模型鼠、输注免疫过的CD61-KO鼠骨髓Breg的主动模型鼠。每周股静脉取血检测血常规,探究Breg对ITP动物模型的影响。研究结果:(1)ITP患者B细胞早期发育异常:与健康供者相比,ITP患者骨髓总B细胞减少,CD127+未成熟B细胞群体占淋巴细胞比例减低;决定B细胞系谱特异性的转录因子Pax5在ITP患者的PBMCs和BMMCs中表达较供者大幅降低。(2)ITP骨髓B细胞亚群分化失衡:ITP患者骨髓中初始B细胞比例较供者降低,记忆B细胞比例增高;二者的浆母细胞和短寿命浆细胞虽无显著差异,但抗血小板自身抗体阳性患者的骨髓长寿命浆细胞较正常人和抗体阴性患者均显著增多。(3)ITP骨髓Breg数量和质量双重缺陷:ITP患者骨髓和外周血CD19+CD24highCD38high Breg数量较健康对照显著减少,其骨髓B细胞分泌免疫抑制性

关键词： B10细胞   哮喘   细胞靶向治疗   叉头盒蛋白O1  

摘要： 哮喘是一种全球年发病人数超3亿的呼吸系统变态反应疾病。在免疫学发病机制方面,哮喘主要由Th2反应介导,现有的临床免疫治疗手段也由此衍生。B细胞是适应性免疫系统的重要细胞亚群之一,可通过产生致病性免疫球蛋白IgE来介导哮喘疾病进展。然而,B细胞中的一个新亚群:分泌IL-10的调节性B细胞(B10细胞)可在多种免疫相关疾病中发挥抑制炎症的作用。有报道指出,PI3K-Akt信号通路对B10细胞的分化有调控作用,而FoxO1作为该通路下游的关键因子在其中的作用尚未有报道。基于以上背景,本研究重点关注了FoxO1对于B10细胞分化发育的影响,进一步将B细胞中的FoxO1作为哮喘疾病免疫抑制治疗中的潜在靶点的可能性进行阐述。本研究取得的主要结果如下:1.哮喘疾病中B细胞上调FoxO1表达在哮喘发作期患者外周血中,我们发现B细胞FoxO1活性上调,B10细胞比例降低。同时,我们在哮喘小鼠模型的肺脏组织中也发现了类似的现象。***1可以抑制B10细胞分化体外实验中,我们发现FoxO1缺失的B细胞在体外有更强的IL-10合成、分泌能力。体内实验中,我们发现野生型小鼠B10细胞FoxO1活性降低,B细胞FoxO1特异性缺失小鼠的B10细胞比例增加。***1是FoxO1调控B10分化过程中的关键转录因子单细胞RNA测序数据提示FoxO1在小鼠脾脏、肺脏和人肺脏B细胞中通过调节prdm1来抑制IL-10的表达。进一步,我们通过体外实验证实了FoxO1通过抑制prdm1的表达来抑制B10细胞的分化。***1通过IL-10依赖或非依赖的方式影响IgE的分泌IgE是哮喘疾病中关键的致病性免疫球蛋白。在体外实验中,我们发现B细胞缺失FoxO1可直接抑制IgE的分泌。同时,IL-10在体外也可以直接抑制B细胞IgE的分泌。5.B细胞特异性敲除FoxO1的小鼠哮喘模型疾病缓解在治疗实验中,我们发现B细胞特异性FoxO1缺失可以缓解小鼠哮喘模型症状。B细胞特异性FoxO1缺失小鼠肺脏中的嗜酸性粒细胞、肺泡巨噬细胞明显下降,B细胞比例明显上升,同时伴随B10细胞比例的上升及Th2反应减弱。这一系列结果提示B10细胞抑制了哮喘Th2炎性反应。6.野生型小鼠可通过转输特异性敲除FoxO1的B细胞缓解哮喘在转输实验中,我们发现FoxO1敲除的B细胞可以在激发阶段直接抑制哮喘疾病,进一步证明了通过靶向FoxO1从而促进B细胞向B10分化,可以不依赖于IgE独立的缓解哮喘疾病,为临床的细胞靶向治疗提供了新的思路。

关键词： 系统性红斑狼疮   Toll样受体9   调节性B细胞  

摘要： 背景:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是以自身反应性B细胞异常激活,产生自身抗体和免疫复合物,最终导致器官系统损伤为特点的自身免疫性疾病。近年来,Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)在自身免疫性疾病发病机制中的作用成为研究热点,其家族成员TLR9能特异性识别内源或外源CpG-DNA基序,激活MyD88信号途径,活化包括B细胞在内多种免疫细胞,进而产生大量细胞因子、粘附分子及自身抗体等,导致异常免疫反应,在SLE的发病机制中发挥了一定作用。调节性B细胞(regulatory B cell,Breg)作为一类具有负性调节作用的B细胞亚群,在抑制免疫活化方面扮演重要角色,其通过分泌IL-10、TGF-β、IL-35等抑制性炎症细胞因子而发挥免疫调节作用。而在既往对人Breg细胞的研究中,CD19CD24CD27Breg细胞亚群及CD19CD24CD38Breg细胞亚群是Breg细胞的主要组成部分。因此,我们推测TLR9也可能通过调控Breg细胞的活化参与SLE的发生和发展。本项目通过研究TLR9与Breg细胞不同亚群的潜在相关性,以期为SLE的发病机制等研究提供新的思路和理论依据。目的:探讨SLE患者不同Breg细胞亚群的占比及其中TLR9表达与临床指标的相关性。方法:选取2021年1月至2021年10月就诊于河南科技大学第一附属医院风湿免疫科的52例SLE患者,根据患者SLE疾病活动指数(SLEDAI)进行分组,包括SLE非活动期组(SLEDAI≤4,n=19),SLE轻度活动期组(40.05);CD19CD24CD27Breg细胞中TLR9表达强度在SLE中重度活动期组较健康对照组显著升高(P=0.016),并与SLEDAI评分呈正相关(P=0.048),且与抗ds-DNA抗体滴度呈显著正相关(P=0.005),但与SLEDAI、C3、C4、24小时尿蛋白定量无明显相关性(P>0.05),与CD19CD24CD27Breg细胞占淋巴细胞百分比无明显相关性(P>0.05);***患者外周血中CD19CD24CD38Breg细胞占淋巴细胞百分比在SLE非活动期组、轻度活动期组、中重度活动期组及健康对照组间均无统计学差异(P>0.05),且与SLEDAI评分、C3、C4、抗ds-DNA抗体滴度、24小时尿蛋白定量无明显相关性(P>0.05);CD19CD24CD38Breg细胞中TLR9表达强度在非活动期组、轻度活动期组、中重度活动期组均较健康对照组增加(P=0.023、P=0.034、P=0.009),并与24小时尿蛋白定量呈正相关(P=0.025),与SLEDAI评分、C3、C4、抗ds-DNA抗体滴度无明显相关性(P>0.05),但与CD19CD24CD38Breg细胞占淋巴细胞百分比呈负相关(P=0.029)。结论:TLR9在SLE患者外周血CD19CD24CD27Breg细胞、CD19CD24CD38Breg细胞亚群中表达均增强,提示其可能通过调控Breg细胞参与了SLE的发病;而不同Breg细胞亚群及其TLR9表达强度与SLE疾病活动指标及脏器损伤存在一定关系,但不同亚群在SLE发病中的作用存在差异,未来可能作为评估SLE患者病情和预后的指标。

关键词： 姜黄素   溃疡性结肠炎   调节性B细胞   Bcl-6  

摘要： 目的:本研究中,我们复制了用葡聚糖硫酸钠盐法(Dextran Sulfate Sodium,DSS)在实验室条件下诱导小鼠而建立的溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型,探求姜黄素在溃疡性结肠炎治疗中发挥的作用及其作用机制,通过测定小鼠结肠组织中信号通路相关蛋白的表达和调节性B细胞(Regulatory B cells,Bregs)亚型与亚群的比率以及对调节性B细胞相关的细胞因子表达水平的影响,进一步探究姜黄素通过Bcl-6信号通路相关蛋白的表达调控调节性B细胞和细胞因子来缓解小鼠溃疡性结肠炎的可能机制。方法:(1)实验动物分组、复制DSS溃疡性结肠炎小鼠模型和给药方法:随机选用40只健康SPF级Ba Lb/c雄性小鼠,按规定的条件适应性喂养5日后进行本实验。小鼠随机被均分为四组(每组10只):空白对照组,空白+姜黄素组,溃疡性结肠炎模型+姜黄素组,溃疡性结肠炎模型组。空白对照组与空白+姜黄素组小鼠每日自由饮用正常饮用水,溃疡性结肠炎模型组与溃疡性结肠炎模型+姜黄素组小鼠均给予3%(w/v)DSS(35000-50000 Da)溶液自由饮用,连续十天。此后对空白+姜黄素组与溃疡性结肠炎模型+姜黄素组灌胃200 mg/kg姜黄素混悬液;溃疡性结肠炎模型组和空白对照组以灌胃方式给予等量的生理盐水,连续十二天。(2)姜黄素治疗由DSS诱导的溃疡性结肠炎疗效评价:实验期间每天观察每组小鼠毛发光亮润泽度、活动情况、食量大小情况、是否有腹泻及粪便潜血等体质和习性变化。每天记录实验期间每组小鼠体重变化、粪便粘稠度、粪便潜血变化情况。第二十三天,小鼠禁食不禁水维持12小时,称量小鼠体重后,腹腔注射3%戊巴比妥钠(0.14 m L/kg)麻醉小鼠,经由眼球取血后,颈椎脱臼处死小鼠并迅速打开小鼠腹腔,解剖分离小鼠脾脏,并取出小鼠肛门以上一厘米至回盲部上端处,即小鼠结肠,在冰上放松平铺结肠并测量结肠段长度,测量结肠长度并拍照存档。记录并计算结肠质量和长度、体质量指数、脾脏质量和单位长度结肠质量。后用小鼠0.4-0.6厘米结肠组织处理后做成结肠组织病理切片后进行H&E染色,观察并进行疾病活跃指数评分(Disease Activity Index,DAI score)和病理损伤评分(Pathological damage score)。(3)姜黄素对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中细胞因子表达的影响:用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)测定实验小鼠结肠组织中相关细胞因子IL-1β,IL-6,IL-10,IL-17A,IL-35和肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factorα,TNF-α)的含量,探索姜黄素调控细胞因子的分泌及其缓解溃疡性结肠炎炎症的机制。(4)调节性B细胞亚型亚群的比例分析:用流式细胞仪对调节性B细胞亚型FCRL5Breg,Ig GBreg,Ig MBreg,CD103Breg,Ig ABreg,IL-10Breg,CD103Breg,Fas LBreg,PD-1Breg细胞比例进行测定,进一步推测姜黄素是否通过调控调节性B细胞亚型的分化从而对溃疡性结肠炎产生治疗功能作用。(5)姜黄素对溃疡性结肠炎小鼠Bcl-6信号通路相关蛋白表达的影响:用蛋白质免疫印迹法(Western Blot Assy)对Bcl-6、CIN85、Syk、P-Syk、BLNK、P-BLNK含量进行检测,探究姜黄素对于溃疡性结肠炎小鼠Bcl-6信号通路的影响。(6)运用软件SPSS 25.0和Graph Pad Prism 9.0进行统计学检验与分析:每组小鼠的数据均检验是否符合正态分布和独立样本t检验,分析方差是否齐性,用直线回归表达相关关系。计量资料均以均数±标准差((?)±s)表示。组间对比采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用LSD检验,P<0.05时表明差异有显著性,P<0.01时表明差异极具有显著性。结果:一、姜黄素对溃疡性结肠炎小鼠疗效评价:与空白对照组相比,DSS组小鼠在给药第八天开始体重出现下降,体质量增长率开始降低,同时观察到该组小鼠与其他组相比的出现行动缓慢、进食量减少及活跃度差的体征。到第十天,小鼠体质量和体重增长率均达到最低点,到第十天该组小鼠大部分出现不成形稀便和血便,毛发暗淡,弓背、神情呆滞等体征。经姜黄素给药干预组的体重相比DSS组明显恢复,体质量增长率出现下降趋势后立即恢复,小鼠的进食量增加,行动恢复迅速,便血和稀便情况好转,活跃度增加。说明姜黄素能有效减轻DSS诱导的结肠炎。空白+姜黄素组与空白对照组各项指标趋势几乎一致。处死当天与DSS组相比较,空白对照组、空白+姜黄素组和DSS+姜黄素组体质量和体重增长率均高于DSS组,说明姜黄素有预防溃疡性结肠炎的作用。根据实验后各组

关键词： 链格孢霉   过敏性哮喘   过敏原特异性免疫治疗   重组蛋白Alt a 1   滤泡辅助性T细胞   调节性B细胞   T2型哮喘  

摘要： [研究背景]链格孢霉引起的过敏性哮喘患病率逐年增加。利用链格孢霉粗提物行皮下特异性免疫治疗(subcutaneous allergen-specific immunotherapy,SCIT)是现阶段唯一能改变该疾病自然进程并取得长期疗效的治疗手段,但迄今为止,国际上对链格孢霉免疫治疗的疗效研究相对少见,且粗提物存在未标准化和安全性欠佳等缺点。在寻求新型免疫治疗制剂过程中,Alta1作为链格孢霉的主要致敏组分,其重组蛋白因易获得和质量稳定等特点,已在临床上被广泛应用于链格孢霉引起的过敏性疾病的分子诊断,而关于重组Alta 1(recombinant Alta 1,rAlta 1)在免疫治疗中的应用和疗效,至今未见报道。当前,免疫治疗的调控机制仍不明确。滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cells,Tfh)是近些年被认为调控过敏性疾病中免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)的生成和参与免疫治疗应答过程的新型T细胞亚群。调节性B细胞(regulatory B cells,Breg)和其产生的白细胞介素-10(interleukin 10,IL-10)作为负性调控介质,介导接受免疫治疗的机体产生免疫耐受。Tfh与Breg细胞是否参与链格孢霉和rAlt a 1的免疫治疗过程并受到影响,值得探索。T2型炎症是新近提出的一种哮喘内型,可分为T2-high和T2-low。已有研究证实真菌微生物群在T2型哮喘中表达的多样性,至于链格孢霉哮喘患者T2型炎症的临床特征如何,目前也无相关研究。因此,本研究拟着重评估链格孢霉和rAlt a 1的免疫治疗效果,探索Tfh与Breg细胞在免疫治疗中表达量的变化,同时分析链格孢霉哮喘患者内型的临床特征,旨在为此类患者的精准治疗提供依据。[研究目的]1.分析并评价链格孢霉过敏性哮喘患者接受SCIT的治疗效果。2.记录Tfh细胞和其亚型、Breg细胞在链格孢霉粗提物SCIT后的变化。3.明确粗提物SCIT后Tfh细胞和其亚型、Breg细胞与临床相关指标的相关性。4.探索纯化的rAlt a 1在哮喘小鼠模型中的有效治疗浓度,全面评估免疫治疗效果。5.明晰rAlt a 1免疫治疗后小鼠体内Tfh和Breg细胞表达量变化的情况。6.阐明有效浓度的rAlt a 1进行免疫治疗后,细胞因子相关的Tfh细胞和IL-10+Breg细胞的变化。7.分析链格孢霉哮喘患者T2-high和T2-low两种内型的临床特征。[研究方法]1.问卷、免疫学指标和肺功能评估接受链格孢霉SCIT患者的治疗效果。2.多因子检测技术分析血清中多种细胞因子的表达水平。3.流式细胞术检测外周血中循环Tfh细胞(circulating Tfh,cTfh)及其亚型、Breg细胞比例的变化。4.相关性分析明确粗提物SCIT后cTfh细胞和其亚型、Breg细胞与临床相关指标的相关性。5.合成并纯化rAlt a 1,验证纯度和免疫原性。6.构建皮下注射免疫治疗小鼠模型,设立rAlt a 1治疗浓度梯度:5μg、50μg、100 μg和 150 μg。7.通过评估肺组织炎症和气道阻力、检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)上清中细胞因子浓度、血清中免疫球蛋白和肥大细胞蛋白酶水平(mast cell protein-1,MCP-1)进行rAlt a 1治疗效果探索。8.流式细胞术检测不同浓度rAlt a 1治疗后小鼠脾脏中Tfh和Breg细胞的变化。9.纯化天然的Alt a 1(nature Alt a 1,nAlt a 1),构建以nAlt a 1和链格孢霉粗提物为对照组,有效治疗浓度rAlt a 1为实验组的免疫治疗小鼠模型,对比治疗效果。10.免疫组化二步法检测小鼠脾脏中B细胞淋巴瘤转录因子(transcriptionfactor B cell lymphoma 6,Bcl-6)的表达定位和强度。11.流式细胞术再次全面分析小鼠脾脏和淋巴结中IL-4+Tfh、IL-5+Tfh、IL-13+Tfh和IL-17A+Tfh细胞以及脾脏中IL-10+Breg细胞的表达情况。12.回顾性分析582例链格孢霉患者在T2-high和T2-low两种内型中年龄、性别、家族史、吸入激素情况、接受免疫治疗情况、宠物暴露史和T-IgE的差异。[研究结果]1.接受链格孢霉SCIT的患者症状和用药评分改善,肺功能第一秒用力呼气容积预计值(forced expiratory volume in the first second,FEV1%)提升。2.链格孢霉SCIT患者的血清中IgE和嗜酸性粒细胞表达水平可降低,但无统计学差异。3.血清中IL-4、IL-21、IL-5、IL-13和IL-17A的