关键词： 桥本甲状腺炎   调节性B细胞   抑制性T细胞   胰岛功能   胰岛素敏感性  

摘要： 目的：桥本甲状腺炎(HT)是最常见的器官特异性自身免疫性疾病之一,是亚临床甲减和临床甲减的最普遍原因,且伴随多种相关疾病,如胰岛素抵抗、代谢综合征等。目前关于HT胰岛功能及胰岛素敏感性的相关研究较少,且结果不一致。国内关于桥本甲状腺炎患者的胰岛功能及胰岛素敏感性研究鲜见文献报道。HT是一类自身免疫性疾病,免疫机制在其发病中有重要作用。我们研究HT患者外周血调节性B淋巴细胞(regulatory B cell, Bregs)、抑制性T细胞(suppressor T cell, Ts cell)的比例变化,及免疫亚群变化与胰岛功能及胰岛素敏感性的相关性。方法：入组18-60岁间桥本甲状腺炎Ⅰ型患者61例,性别年龄相匹配的健康组38例。收集研究对象一般资料、身高、体重、腰围、臀围、血压,所有研究对象行口服糖耐量试验(Oral Glucose Tolerance Test, OGTT)检测空腹、负荷30mim 120min的血糖、C肽、胰岛素。所有研究对象检测外周血CD19+CD24+CD27+B细胞、CD19+CD24hiCD38 hiB细胞CD19+IL-10+ B细胞及CD8+CD28T细胞比例变化。结果：HT组外周血CD8+T淋巴细胞在总淋巴细胞中比例显著降低,CD19+CD24+CD27+B细胞亚群显著升高。随着TPOE Ab的升高,CD19+CD24hiCD38hiB细胞显著降低;随着TGAb的升高CD8+CD28" T细胞显著降低。TT3和CD4+T细胞呈显著负相关,与CD19+CD24hiCD38hiB细胞则呈显著正相关,r值分别为-0.227和0.287;TT4与CD8+CD28"T细胞呈显著负相关,与CD19+CD24+CD27+B细胞则呈显著正相关,r值分别为-0.267和0.298。获取健康组淋巴细胞亚群的25%-75%的参考区间,并以此作为外周血淋巴细胞亚群的参考范围,根据该参考范围,将所有研究对象按淋巴细胞亚群是否降低或升高分组,将年龄、性别、TT3、TT4、FT3、FT4、TGAb和TPOAb纳入Logistic回归方程中发现,TGAb和FT4是CD8+CD28T细胞在淋巴细胞中比例降低的独立危险因素;TSH是CD19+CD24hiCD38hiB细胞比例降低的独立危险因素,FT4是CD19+CD24+CD27+B细胞比例升高的独立危险因素,说明甲状腺功能对免疫改变关系密切。与正常组相比,HT组研究对象腰围、2小时胰岛素分泌显著增加。早时相及总胰岛素分泌指标(InsAUC30/GluAUC30、InsAUC120/GluAUC120)显著升高,空腹胰岛分泌功能(HOMA-0)未见增加,处置指数(DI)显著降低(P=0.002)。根据TPOAb四分位组,2小时胰岛素分泌(2hINS)Q3组显著高于Q2和Q4组;空腹胰岛分泌功能(HOMA-β) Q4组显著低于Q1和Q3组,随着TPOAb的升高,HOAM-β显著降低,呈线性关系,r=-0.313;处置指数(DI)也随着TPOAb的升高而显著降低,说明随着TPOAb滴度逐渐升高,胰岛β细胞功能逐渐降低;根据TGAb的四分位组,2小时胰岛素分泌(2MNS)、总胰岛素分泌指数(DI120)和处置指数(DI)趋势值有显著意义,P值分别为0.03,0.048.<0.001。Q3组2hINS、DI120显著高于Q1和Q2组,Pearson相关分析提示TGAb与2hINS并非线性相关;而随着TGAb升高,处置指数(DI)显著降低,呈线性负相关(r=-0.321,P=0.013)说明随着TGAb滴度升高,胰岛β细胞功能逐渐降低。CD8+CD28T淋巴细胞降低组与对照组相比,空腹、早时相及总胰岛素分泌指标HOMA-β、 InsAUC3O/GluAUC3O、InsAUC120/GluAUC120显著升高,处置指数(DI)指标显著增加,而胰岛素敏感指数组间无差异,说明CD8+CD28" T细胞降低与胰岛素分泌关系密切。C D19+CD24hiCD38hiB淋巴细胞降低组与对照组相比,全身敏感指数Matsuda显著升高,CD19+CD24hiCD38hiB细胞与Matsuda指数呈显著负相关(r=-0.398,P=0.010),处置指数(DI), DI30. DI120则组间无显著差异,说明CD19+CD24hiCD38hiB淋巴细胞降低主要与胰岛素敏感性密切相关。CD19+CD24+CD27+B淋巴细胞升高组与对照组相比,H OMA-IR显著升高,空腹胰岛分泌功能(HOMA-p)显著升高,CD19+CD24+CD27+B细胞与HOMA-IR呈显著正相关(r=0.338, P=0.029), OGTT负荷后胰岛素分泌、胰岛功能及胰岛素敏感性指数组间无差异,说明CD19+CD24+CD2

关键词： 肝炎   调节性B淋巴细胞   转基因   免疫作用  

摘要： 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的慢性感染已成为我国公共医疗卫生中的一个重要问题。慢性乙型肝炎的形成主要是HBV复制与宿主免疫应答反应相互作用的结果，目前研究认为，HBV感染慢性化的主要原因是机体对HBV的免疫耐受。其中，机体病毒特异性CD8+T细胞的应答不良是发生HBV感染免疫耐受的关键。对比慢性、免疫耐受的乙型肝炎或HBV携带者和急性乙肝患者的免疫功能可发现，急性乙肝患者的体内可检测到强力、多克隆的特异性CD8+T细胞反应，但在慢性乙型肝炎患者中，CD8+T细胞数量少，且反应低下，表现出单克隆性和寡特异性，无法有效清除病毒。现已有许多学说用于解释慢性乙型肝炎患者体内病毒特异性CD8+T细胞的“失能”机制，调节性免疫细胞对于机体免疫应答的抑制作用是其中一个研究热点。CD1d+CD5+调节性B淋巴细胞(regulatory B cells，Breg)是一类具有负向免疫调节功能的B细胞亚群，现已被证实能够在感染性、自身免疫性等多种疾病中抑制T细胞、单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞等多种免疫细胞及细胞因子的功能。然而，有关该细胞在HBV慢性感染及肝炎免疫的中的作用目前仍少有报道。因此，本研究拟研究CD1d+CD5+调节性B细胞在HBV转基因小鼠（HBV transgenic mice，HBV-Tg）肝炎免疫中的作用。<br>　　本文主要从以下几方面进行了论述:<br>　　第一部分 HBV转基因小鼠的生物学特性分析以及体内CD1d+CD5+调节性B细胞的作用的初步研究<br>　　目的：鉴定HBV-Tg小鼠的生物学特性，与野生型Balb/c小鼠对比研究其免疫特性；研究HBV-Tg小鼠CD1d+CD5+调节性B细胞对其CD8+T细胞的抑制作用。<br>　　方法：（1）采用ELISA、实时荧光定量PCR、肝组织HE染色及免疫组化等方法鉴定HBV-Tg小鼠的生物学特性；（2）采用流式细胞分析法、ELISA等方法检测HBV-Tg小鼠血清细胞因子水平及肝脾CD8+T细胞、CD1d+CD5+B细胞比例，并与野生型Balb/c小鼠比较；（3）运用淋巴细胞分离、体外培养及细胞内因子检测技术，研究HBV-Tg小鼠CD8+T细胞及B细胞的功能；（4）采用细胞筛选及混合淋巴细胞培养技术研究CD1d+CD5+B细胞对于CD8+T细胞的抑制作用。<br>　　结果：（1）转基因小鼠血清中HBV-DNA复制水平大于104IU/ml，血清HBsAg表达稳定，大于200IU/ml，HBsAg及HBcAg在肝细胞均有表达，小鼠血清 ALT未见明显升高，部分小鼠肝组织病理检查可见轻度炎性改变；（2）HBV-Tg小鼠肝脾CD8+T细胞、肝脾CD1d+CD5+B细胞比例、血清IFN-γ与对照组相比均无显著差异，但血清IL-10水平较其对照小鼠明显升高；（3）小鼠淋巴细胞体外培养显示，HBV-Tg小鼠CD8+T细胞在HBsAg诱导下活化比例较对照小鼠减低，IL-10+B细胞比例较对照小鼠增高；（4）体外混合细胞培养中发现CD1d+CD5+B细胞加入后能减少IFN-γ+CD8+T细胞数量，去除CD1d+CD5+B细胞或加入IL-10/IL-10R抗体，IFN-γ+CD8+T细胞数量增加。<br>　　结论：（1）HBV-Tg小鼠存在对HBV的免疫耐受，其CD8+T细胞对HBsAg应答低下；（2）HBV-Tg小鼠脾CD1d+CD5+B细胞可通过分泌IL-10因子抑制病毒特异性CD8+T细胞的活化。<br>　　第二部分 HBV转基因小鼠肝炎模型的构建及检测<br>　　目的：构建HBV-Tg小鼠肝炎模型并检测其病理学及免疫学改变。<br>　　方法：（1）小鼠尾静脉注射不同剂量的刀豆蛋白A（ConA），与野生型Balb/c小鼠对比，构建HBV-Tg小鼠肝炎模型；（2）采用肝组织病理及免疫组化等方法检测ConA诱导形成的小鼠肝脏炎症，并采用流式细胞分析技术、ELISA、RT-PCR等检测HBV-Tg小鼠炎症性细胞因子及免疫细胞的变化。<br>　　结果：（1）HBV-Tg小鼠在低剂量（2μg/g）ConA诱导下即可出现血清转氨酶升高，在4μg/g及12μg/g ConA可见血清转氨酶10～30倍升高，对照Balb/c小鼠在2μg/g及4μg/g ConA刺激下未见ALT/AST明显升高，在12μg/g ConA刺激下见ALT、AST轻度升高。（2）HBV-Tg小鼠在2μg/g ConA刺激24小时后，可见肝组织肝窦轻度充血，汇管区炎症细胞增殖，肝细胞胞浆疏松淡染，空泡样变性；经4μg/g ConA刺激后，可见多处小群肝细胞嗜酸性变性和凝固性坏死，肝内和

关键词： REGULATORY T-CELLS   DEPLETING THERAPY   B10 CELLS   PURPURA   DISEASE   TYPE-1   AUTOIMMUNITY   PATHOGENESIS   INDUCTION   RESPONSES  

摘要： Background. Regulatory B cells (Breg) are a distinct B cell subset with immunoregulatory properties. Pivotal to Breg function is interleukin-10. This study was to investigate the role of IL-10 producing B cell (B10) and its association with Treg and Th17 subsets in immune thrombocytopenia (ITP) patients. Methods. Peripheral blood mononuclear cells from ITP patients and controls were stimulated with PMA, ionomycin, and Brefeldin A. The frequencies of CD19(+)IL-10(+) B cells, CD3(+) CD4(+)IL-17(+) Th17 cells, and CD4(+) CD25(hi)Foxp3(+) Treg cells were analyzed by flow cytometry. The mRNA expression of Foxp3 and ROR gamma t was detected by real-time quantitative PCR. Results. The number of B10 cells was elevated in ITP patients. After first-line therapies, it remained at high level in patients who achieved complete or partial response but decreased in those who acquired no response. There was a positive correlation between B10 cells and Tregs in ITP both before and after therapies. The ratio of Treg/Th17 decreased in ITP, and it strongly correlated with B10 cells. Conclusions. The frequency of B10 cells is elevated in ITP and it correlates with both the Tregs counts and the Treg/Th17 ratio. B10 cells to regulate functional T cell subsets might be impaired in patients with ITP.

关键词： 调节性T淋巴细胞   调节性B淋巴细胞   非小细胞肺癌   肿瘤微环境   炎症   趋化因子   核转录因子-κB  

摘要： 第一部分 晚期非小细胞肺癌患者外周血调节性T/B淋巴细胞相关表型表达的临床研究目的：探讨调节性T淋巴细胞(regulatory T cell,Treg)和调节性B淋巴细胞(regulatory B cell,Breg)相关表型在晚期非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)患者外周血中的表达水平。方法：采集32例晚期非小细胞肺癌患者和20例健康人的外周血样,通过流式细胞仪分析其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中Treg和Breg的比例,分别以CD4+CD25+ CD127-定义Treg、以CD45RA+CD4+CD25+CD127定义幼稚型Treg、以CD 19+CD24iCD27+和CD19+IL-1 0+定义Breg。结果：肺癌患者外周血CD4+T淋巴细胞占PBMC的比例较正常对照组明显下降(P<0.001),肺癌患者外周血Treg(CD4+CD25+CD127-)占CD4+T淋巴细胞的比例较正常对照组无明显差别,肺癌患者外周血幼稚型Treg(CD45RA+CD4+CD25+CD127-)占CD4+T淋巴细胞的比例较正常对照组明显下降(P<0.05)。肺癌患者外周血CD19+B淋巴细胞占PBMC的比例较正常对照组明显下降(P<0.001),肺癌患者外周血Breg(CD19+CD24hiCD27+)占CD19+B淋巴细胞的比例较正常对照组明显升高(P<0.001),肺癌患者外周血Breg(CD19+IL-10+)占CD19+B淋巴细胞的比例较正常对照组明显升高(P<0.05)。结论：晚期NSCLC患者外周血中幼稚型Treg的比例下降,Breg的比例显著上升,两者所参与的负性免疫调控可能协调促进肿瘤的发生、发展。第二部分 肿瘤微环境对调节性T/B淋巴细胞相关表型调控的体外研究目的：探讨肿瘤微环境对调节性T淋巴细胞(regulatory T cell, Treg)和调节性B淋巴细胞(regulatory B cell, Breg)相关表型表达水平的影响,以期明确肿瘤微环境在肿瘤免疫调控中的作用。方法：(1)肺癌细胞株A549以合适密度接种于24孔细胞培养板,24h后将健康人的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)与A549共培养,共培养48h后通过流式细胞仪分析PBMC中Treg和Breg的比例,分别以CD4+CD25+CD127定义Treg、以CD45RA+CD4+CD25+CD127定义幼稚型Treg、以CD19+CD24hiCD27+和CD19+IL-10+定义Breg。(2)A549以合适密度接种于24孔细胞培养板,以不同浓度内毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) (10,100,10000ng/ml)或PBS刺激,在刺激24h后分别收集A549细胞和培养液上清,将健康人的PBMC分别与刺激后的A549细胞或培养液上清共培养,共培养48h后通过流式细胞仪分析PBMC中Treg和Breg的比例。(3)A549以合适密度接种于24孔细胞培养板,以不同浓度LPS (100,500ng/ml) 或 PBS刺激,刺激24h后利用Transwell系统将健康人的PBMC与A549共培养,共培养48h后通过流式细胞仪分析PBMC中Treg和Breg的比例。(4)A549以合适密度接种于24孔细胞培养板,以不同浓度LPS (100,500ng/ml)或PBS刺激,刺激24h后分别收集A549细胞和培养液上清,将晚期肺癌患者的PBMC分别与刺激后的A549细胞或培养液上清共培养,共培养48h后通过流式细胞仪分析PBMC中Treg和Breg的比例。结果：(1)健康人的PBMC与A549共培养后,CD4+ T淋巴细胞的比例上升,Treg占CD4+ T淋巴细胞的比例下降(P<0.01),幼稚型Treg占CD4+ T淋巴细胞的比例下降,CD19+ B淋巴细胞的比例下降(P<0.001), CD19+CD24hiCD27+和CD19+IL-10+ Breg占CD19+ B淋巴细胞的比例上升。(2)健康人的PBMC与LPS刺激A549后所得的培养液上清共培养后,CD4+ T淋巴细胞的比例上升,LPS 100ng/ml时明显上调Treg及幼稚型Treg的比例,CD19+ B淋巴细胞的比例上升,且呈浓度依赖性,而CD19+CD24hiCD27+和CD19+IL-10+ Breg的比例较对照组明显下降。健康人的PBMC与LPS刺激后的A549细胞共培养,CD4+ T淋巴细胞、CD19+ B淋巴细胞、Treg、幼稚型Treg及Breg的比例皆较PBS刺激的对照组上升。LPS

关键词： 淋巴瘤,非霍奇金   CD4+CD25highCD127low调节性T细胞  

摘要： 目的探讨外周血CD4+CD25highCD127low调节性T细胞（Treg细胞）在B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）患者外周血中表达水平及其临床意义。方法采用流式细胞术检测100例初诊B-NHL患者及50名健康对照者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg细胞表达水平,进行统计学分析。结果健康对照者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg细胞中位表达水平为5.00%,初诊B-NHL患者为7.20%,两者之间差异具有统计学意义（P<0.001）。男性患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平高于女性患者（P<0.01）,乳酸脱氢酶（LDH）增高患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平高于LDH正常患者（P<0.01）,ⅢⅣ期患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平较ⅠⅡ期患者增高（P<0.01）,有B症状患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平高于无B症状患者（P<0.01）。而不同年龄、国际预后指数评分、有无大包块患者之间外周血CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平差异均无统计学意义（均P>0.05）。结论B-NHL患者体内存在免疫抑制,在男性、LDH增高、有B症状及晚期患者中CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平明显增高。检测其水平对于判断B-NHL的预后有一定价值。

关键词： 调节性B细胞   CD19+CD5+CD1d+B淋巴细胞   溃疡性结肠炎   炎症性肠病   黄芩苷  

摘要： 背景 溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)是炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease, IBD)的一种。该病病程长、易复发,与直结肠癌的发生密切相关。近年来,因本病就诊人数呈现逐步增加的趋势。尽管UC的发病机制尚没有明确,但其针对自身抗原的免疫反应在疾病的发展过程中起到重要作用。有越来越多的证据从不同侧面支持了本病自身免疫损伤学说。大量研究表明,Thl7/Treg、Thl/Th2转化失衡可能是IBD发病的重要因素之一。 作为机体重要的免疫细胞,B细胞不仅可以介导体液免疫和细胞免疫发挥正性免疫调节作用,近年来的研究显示B细胞中存在具有负性调节作用的细胞亚群——调节性B淋巴细胞(Regulatory B Cell, Breg)。其主要功能是调节炎症过程,抑制过度炎症反应,是移植排斥、自身免疫病以及免疫功能紊乱等状态下的一种重要的保护性细胞,其作为一种新的炎症调节细胞有着广阔的应用前景。目前Breg的研究多集中在动物模型中,关于人类和非人灵长类动物体内Breg的研究仍较少见。而UC发病过程中是否存在效应性B细胞与调节性B细胞的转化失衡因素仍未知。有学者初步研究了小鼠体内的IL-10+Breg细胞对多种原因诱发的肠道炎症有良好的缓解作用。也有学者研究发现自身免疫病患者(如系统性红斑狼疮等)体内Breg调节功能的缺失。综合目前对Breg的研究可以发现,Breg具有多种表型。可谓是,疾病不同,表型不同;同一表型,不同疾病中的作用不同;刺激不同,Breg作用对象不同。其中与肠道及其炎症相关的是CD19+CD5+CD1d+B细胞群,本研究针对CD19+CD5+CD1d+B细胞,探讨其与UC发病的关系。 Breg主要通过分泌IL-10发挥调节作用,而IL-10的分泌依赖TLRs/MyD88信号通路的作用。动物研究表明,LPS刺激小鼠脾细胞,能有效促进IL-10的分泌。作为LPS的配体,TLR4及其下游的MyD88信号与IL-10的表达有着密切关系。而LRs/MyD88介导的信号具有细胞特异性,如树突状细胞能通过该路径促进T细胞活化,而B细胞则通过提供一个富含IL-10的周围环境而抑制T细胞增殖和分化。同时,TLRs/MyD88/NF-KB信号通路是出发炎性反应的途径之一,黄芩苷能否特异性活化Breg的TLRs/MyD88通路,进而促进IL-10的表达有待探讨。 目前,临床上治疗UC患者的一线药物不良反应明显,而顽固性、重症患者则要依赖毒副作用更严重的药物。因此,耐受性好的新的治疗途径亟待开发。UC属中医“痢疾”“肠癖”“肠风”“泄泻”“脏毒”等范畴。中药复方黄芩汤是传统医学治疗“泄泻”等病证的经典名方,中药黄芩的有效成分黄芩苷具有抗炎、镇痛、抗感染、抗过敏、抗氧化、肝纤维化、抗高血糖、抗肿瘤、抗细胞损伤、抗焦虑样效应等多重功效,临床应用广泛。现代药理学方法研究表明,黄芩苷的抗炎作用在于有效降低促炎因子IL-1β和TNF-α,并降低LPS活化的巨噬细胞内NF-κB的活性等。同时能抑制白细胞内白三烯B4、白三烯C4的生物合成,抑制fMLP激发的白细胞内Ca2+升高,并促进细胞内cAMP水平提高,从而影响白细胞的多种功能。黄芩苷会否通过对Breg的调节发挥抗炎作用的问题有待探讨。 本研究以UC患者和肠炎小鼠模型为研究对象,以健康人为对照,以肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome, IBS)患者为疾病对照,探讨CD19+CD5+CD1d+B细胞的表达与UC的关系,探讨黄芩苷对CD19+CD5+CDld+B细胞以及TLR/MyD88信号通路的调控作用。 目的 1.探讨CD19+CD5+CDld+B细胞在UC患者外周血及结肠组织中的表达情况,以及血清相关细胞因子的表达水平;2.通过体外培养实验,探讨黄芩苷对UC患者外周血CD19+CD5+CDld+B细胞及其胞内IL-10的调控作用,探讨黄芩苷对CD19+CD5+CDld+B细胞内TLR4/MyD88信号通路的影响;3.借助UC动物模型,探讨黄芩苷体内给药对UC模型动物CD19+CD5+CDld+B细胞比例以及IL-10表达相关信号通路蛋白TLR4/MyD88的调控作用,同时探讨黄芩苷对小鼠DSS肠炎的治疗效果以及TLR4-MyD88-NFκB信号通路的调控。 方法 一、CD19+CD5+CDld+B淋巴细胞与UC的相关性研究 1.临床患者入选及分组： 入选标准：UC患者入选标准参考《中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》;IBS患者入选标准参考《肠易激综合征中西医结合诊疗共识意见(2011年)》。 患者分组：结合入选标准,将患者分为3组：健康对照组(Control组,n=36);溃疡性结肠炎组(UC组,n=36);肠易激综合征组(IB

关键词： 慢性乙肝   调节性B细胞   调节性T细胞   免疫应答  

摘要： 目的：分析慢性乙肝患者外周血IL-10+CD19+调节性B细胞与CD4+CD25high调节性T细胞的表达及二者在乙肝免疫应答过程中的相互作用。方法：收集急性乙肝患者28例，慢性乙肝患者31例和正常对照25例。分离外周血单个核细胞，经CpG ODN2006和PMA体外作用后，流式细胞术分析Bregs、Tregs的表达及其相关性，ELISA分析培养上清IL-10水平。通过免疫磁珠剔除CD4+CD25highT细胞分析Bregs与Tregs之间的相互作用。结果：CpG ODN2006和PMA作用后CHB组Bregs和Tregs较AHB和HCs组均显著升高（Bregs:P值分别为0.003和0.001;Tregs:P值分别为＜0.001，0.005），AHB和HCs组间无显著变化（Bregs:P=0.796;Tregs.P=0.227）;Spearman相关性分析发现CHB组Bregs与Tregs存在正相关关系(r=0.50，P=0.004)，而AHB和HCs组无此相关性(r=-0.15，P=0.462;r=0.09，P=0.669)。CHB组IL-10表达高于AHB和HCs组(Z值分别为-6.596、-6.373，P＜0.001)。AHB和HCs组间差异无统计学意义（Z=-0.952，P=0.341）。Spearman相关性分析表明CHB组IL-10与Bregs存在正相关关系(R=3.303，P=0.005)。剔除CD4+CD25+T细胞前后CHB组患者Bregs和IL-10表达无显著差异。结论:调节性B细胞和调节性T细胞在慢性乙肝患者中表达升高，Bregs可能通过IL-10的分泌参与慢性乙肝的免疫调节，且该作用不依赖于Tregs。

关键词： 新型SPR蛋白芯片   慢性特发性血小板减少性紫癜   调节性B细胞   血小板抗体   细胞因子紊乱   临床诊断  

摘要： 研究背景 表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)是当今应用最普遍的非标记光学生物传感器(Label-Free Optical Biosensor)技术,正在被越来越普遍地用于生命科学等多个领域。SPR技术不需要对被测物进行标记的优点使其可以测量生物活性分子在无修饰条件下的反应动力学,适用于高通量生物活性分子特别是小分子的筛选,微量未知物的分析,以及在线样品检测。但其核心技术为光路检测系统、微流控进样系统和SPR芯片。目前改进基质材料的表面处理技术,建立高效和快速的芯片活化方法,并能保持芯片表面物质的稳定性和生物活性是该领域研究的热点,同时与微流控技术相结合可降低样品消耗量,提高检测通量。因此,优化SPR芯片表面的功能,探索建立高通量、简便快速、灵敏度高、特异性强的SPR技术应用于临床检验诊断具有重要的意义。 慢性特发性血小板减少性紫癜(Chronic idiopathic thrombocytopenic purpura, CITP)是一种常见的出血性自身免疫病,在我国的发病率呈上升趋势,严重影响患者的生活质量,但因发病机制不明,还难以找到真正特异且有效的治疗方法。近年免疫调节治疗方式引起了人们的兴趣,可能从源头上改变相关的治疗效果。最近研究表明新型调节性B细胞(Breg)具有负性调节作用,在免疫学领域越来越受重视并被积极研究,我们前期预实验发现Breg细胞可能在CITP患者免疫紊乱中发挥重要作用,CITP患者体内Breg的变化可能与CD4+Th细胞亚群和血小板抗体之间有重要关系,因此需要对该问题进行深入研究,并探索一种简便、快速的检测方法,为CITP的临床诊断与治疗寻找新的靶点与思路。血小板抗体的检测是国内外研究的热点,虽然方法有多种,但因价格太高,或操作复杂,或易至假阳性或假阴性等问题,临床应用较少;CD4+T等相关细胞因子紊乱的检测方法主要为ELISA、流式细胞术和PCR等,都难以高通量快速检测多种因子,限制了它们的临床应用。因此,利用SPR技术优势,探索SPR芯片技术应用于CITP患者的免疫紊乱的动态联合检测,对临床诊断、治疗策略选择、临床效果评价和预后分析以及血小板相容性输注治疗等方面具有非常重要的意义。 研究目的 构建与优化新型表面化学SPR蛋白芯片,建立基于SPR技术高通量、简便快速、灵敏度高、特异性好的新型免疫学检测方法：针对CITP治疗效果差,发病机制复杂以及新型调节性B细胞在自身免疫性疾病中的作用特点,本研究拟分析CITP患者外周血新型调节性B细胞的变化特征、及其对患者血小板抗体与CD4+Th细胞紊乱的调节作用;探索新型SPR芯片技术在CITP免疫紊乱诊断与疗效评价中的应用价值,为CITP免疫紊乱的检测寻找新靶点与新方法,同时也为新型SPR芯片技术应用于其它相关免疫病的临床检验诊断提供参考。 研究内容 1、构建灵敏度高、特异性好的新型表面化学SPR蛋白芯片,进行相关性能的综合评价,并对两种SPR芯片比较分析。 2、研究CITP患者外周血新型调节性B细胞的变化及其与血小板抗体的相关性,并分析它们在CITP患者免疫紊乱中的作用。 3、运用新型表面化学蛋白芯片,建立高通量、非标记的SPR技术筛检CITP患者血小板抗体的新方法,并与固相凝集法和MAIPA法对比分析。 4、研究CITP患者外周血新型调节性B细胞的变化与CD4+T细胞的相关性,分析相关的细胞因子在CITP免疫紊乱中的作用。 5、运用新型表面化学蛋白芯片,探索建立高通量、非标记的SPR技术动态、特异性联合检测CITP患者Breg与CD4+T细胞相关因子紊乱的新方法。 研究方法 1、SPR芯片Poly(OEGMA-co-HEMA)表面的制备 利用二元自组装体系对引发剂表面浓度进行控制,以乙醇为溶剂,配制硫醇引发剂和PEG硫醇混合溶液。将经过UV-ZONE处理的芯片浸泡在上述混合溶液中,放置15小时。取出芯片,用乙醇充分淋洗,氮气吹干。称取2,2’吡啶12.5mg、OEGMA5262.62g和HEMA0.65g,加入溶剂超纯水5ml和甲醇5m1搅拌溶解。加入1mLCuCl2的溶液(0.04mM),通入氮气,排除氧气15min。随后利用注射器缓慢注入1mL抗坏血酸溶液(0.04mM), Cu(II)配合物逐渐被还原为Cu(I)的配合物,反应溶液由通常的淡蓝色变为淡红色。继续无氧处理15min。表面引发聚合反应在氮气环境的手套箱中进行。将有引发剂的芯片,浸泡在反应溶液中。芯片表面将引发单体在聚合于芯片表面,在室温下反应8小时后,将芯片取出,终止反应,并用甲醇和超纯水清洗干净,氮气吹干。基质Poly(OEGMA-co-HEMA)侧链末端羟基活性较差,很难在温和条件中与蛋白质进行偶联反应,所以必须对羟基进行功能化：将表面修饰

关键词： 日本血吸虫   可溶性虫卵抗原   可溶性成虫抗原   调节性B细胞   T细胞   IL-10  

摘要： 在我国,日本血吸虫的感染和流行仍然是当今主要的公共卫生问题之一。血吸虫病是一种典型的慢性感染性疾病,在血吸虫感染过程的不同时期机体免疫系统针对血吸虫各发育阶段的不同抗原产生不同的优势免疫应答。日本血吸虫成虫抗原(SWAP)和虫卵抗原(SEA)是血吸虫感染过程中最主要的两种抗原成分。调节性B细胞(Bregs)是一类具有负性调节作用的B细胞亚群,可以分泌IL-10和/或TGF-p等细胞因子,在自身免疫病、慢性炎症、肿瘤及寄生虫感染等疾病中发挥着重要的作用。但SEA和SWAP是否能够诱导Bregs产生,及诱导产生的Bregs的特性仍不十分清楚。本研究目的是：(1)通过体内、体外动物实验研究日本血吸虫SEA和SWAP是否可以诱导Bregs的产生及其机制;(2)进一步研究日本血吸虫SEA诱导产生的Bregs的特性。本研究用SEA、SWAP和LPS分别体外刺激小鼠脾脏单个核细胞和磁珠分选后的脾脏CD19+B细胞,72h后用ELISA法检测培养上清中IL-10、IL-4、IFN-γ、TGF-β的水平,用流式细胞术分别检测细胞表面***86及CD40的表达和CD19+IL-10+B细胞比例。体内实验用SEA、SWAP、PBS分别和不完全弗氏佐剂以1：1比例混合免疫小鼠,1次/周,共3次,末次免疫后7天取小鼠脾脏,用ELISA法检测培养上清中IL-10、IL-4、IFN-γ、TGF-β的水平,同时用流式细胞术检测CD19+IL-10+B细胞比例。之后用***.p38MAPK和NF-κB信号转导抑制剂检测Bregs细胞分泌细胞因子IL-10水平的变化。结果发现SEA在体内、外均能刺激小鼠脾脏CDl9+B细胞分泌IL-10,而且可诱导脾脏CD19+B细胞分化为CD19+IL-10+B细胞,而SWAP在体内、外均不能刺激脾脏CD19+B细胞分泌IL-10,但是SWAP在体内可刺激小鼠脾脏CD19+B细胞分泌IFN-γ。此外,SWAP体内外条件均不能诱导脾脏细胞分化为CD19+IL-10+B细胞。SEA可以通过NF-κ***和p38MAPK信号转导通路刺激小鼠B细胞分泌细胞因子IL-10。 同时,本研究用SEA、LPS刺激小鼠脾脏CD19+B细胞,72h后,磁珠分选出分泌IL-10的B细胞,将此细胞和磁珠分选出的CD4+T细胞共孵育,同时加入Anti-CD3、Anti-CD28,72h后,用ELISA法检测细胞上清中活化的CD4+T分泌的IL-4和IFN-γ细胞因子的变化,流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+T、CD4+IL-4+T、CD4+IFN-γ+T细胞的比例。结果表明分泌IL-10的B细胞可诱导活化的CD4+T细胞分泌IL-4,且能够增加CD4+CD25+Foxp3+T细胞、CD4+IL-4+T细胞的数量。我们认为,通过小鼠体内、外试验,可以实现对日本血吸虫SEA可诱导Bregs产生及其特性的研究,研究结果将有助于我们深入了解日本血吸虫感染过程中Bregs所发挥的负向免疫调节作用,从而为血吸虫感染免疫调控机制的深入研究提供新的免疫学依据。

关键词： 系统性红斑狼疮   调节性B细胞   Foxp3表达   TGF-β   免疫耐受   免疫调节功能   免疫抑制剂  

摘要： 目的：调节性B细胞在风湿性疾病中的免疫调节功能受到广泛关注。研究发现除B10以外还有两种调节性B细胞亚群-表达Foxp3及TGF-β的Breg，这两种B细胞与风湿性疾病是否有关至今尚未见研究报道。本研究拟通过检测系统性红斑狼疮患者CD19+Foxp3+及CD19+TGF-β+ Breg占外周血CD19+B细胞比例，探讨其与SLE发生及疾病活动度的关系。\n 方法：系统性红斑狼疮患者30例，均满足2009年ACR提出的系统性红斑狼疮诊断标准;健康对照者26例，排除自身免疫性疾病、肿瘤、现症感染及免疫抑制剂应用史。采集并提取入组患者及健康对照者外周血单个核细胞，用流式细胞仪检测系统性红斑狼疮患者及健康对照者外周血CD19+Foxp3+及CD19+TGF-β+两种调节性B细胞比例，分析其与疾病活动度及临床相关指标的关系。\n 结果：\n 1、CD19+Foxp3+及CD19+TGF-β+两种Breg在SLE患者组较健康对照组比例减少。\n 2、CD19+Foxp3+ Breg和CD19+TGF-β+ Breg比例在病情活动组较病情稳定组比例减少，且与SLEDAI疾病活动度评分呈负相关。\n 3、CD19十Foxp3+Breg调节性B细胞与SLE患者24h尿蛋白定量有关，与ds-DNA，ANA滴度，ESR，CRP及免疫球蛋白定量等指标无明显相关性。\n 结论：CD19+Foxp3+ Breg和CD19+TGF-β+ Breg比例在SLE患者组明显减少，表明两种调节性B细胞可能以某种机制参与了SLE的发病，并与疾病活动度密切相关。