关键词： CD19+CD24highCD38high   CD19+CD24highCD27+   调节性B细胞   异基因造血干细胞移植   c GVHDCD19+CD24highCD38high   c GVHD   cGVHD   生物标记   B细胞  

摘要： 一、人CD19+CD24highCD38high及CD19+CD24highCD27+调节性B细胞特性的研究目的:探讨人外周血CD19+CD24highCD38high及CD19+CD24highCD27+调节性B细胞的特性。方法:流式细胞仪检测健康志愿者外周血单个核细胞中CD19CD24CD38及CD19+CD24highCD27+调节性B细胞(regulatory B cell,Breg)的比例及其凋亡、增殖、B细胞活化因子受体(B-cell activating factor receptor,BAFF-R)、跨膜蛋白活化因子钙离子信号调节亲环素配体(transmembrane activator calcium modulatorand cyclophilin ligand interactor,TACI)、B细胞成熟抗原(B cell maturation Ag,BCMA)、结合的B细胞活化因子(B-cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)及一种增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)水平、T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域相关分子-3(T cell Ig domain and mucin domain 3,Tim-3)表达、CD20表达、CD80表达及CD86表达。分别经CD40L及Cp G ODN2006刺激后检测CD19+CD24highCD38high、CD19+CD24highCD27+Breg细胞分泌的IL-10、TGF-β水平。将CD19+CD24highCD38high与CD19+CD24highCD27+Breg细胞、CD19+CD24highCD38high与非Breg、CD19+CD24highCD27+与非Breg之间进行上述指标的比较。结果:在正常人外周血单个核细胞中CD19+CD24highCD38high Breg比例为5.88%3.18%,CD19+CD24highCD27+Breg的比例为14.10%±9.47%,CD19+CD24highCD27Breg的比例高于CD19+CD24highCD38high Breg(P=0.000)。CD19+CD24highCD38high Bre与CD19+CD24highCD27+Breg相比凋亡水平无差异(28.87%±14.82%vs.28.84%18.33%,P=0.994),CD19+CD24highCD38high Breg与非CD19+CD24highCD38high细胞相凋亡水平亦无差异(28.87%±14.82%vs.23.86%±11.17%,P=0.994),而CD19+CD24highCD27+Breg凋亡水平高于非CD19+CD24highCD27+细胞(28.84%±18.33%vs.14.93%±7.83%,P=0.002)。CD19+CD24highCD38high Breg与CD19+CD24highCD27+Breg相比增殖水平差异无统计学意义(21.46%±11.88%vs.17.28%±13.18%,P=0.442),CD19+CD24highCD38high Breg增殖水平高于非CD19+CD24highCD38high细胞(21.46%±11.88%vs.6.22%±10.07%,P=0.009),CD19+CD24highCD27+Breg增殖水平与非CD19+CD24highCD27+细胞相比差异无统计学意义(17.28%±13.18%vs.12.96%±11.93%,P=0.570)。CD19+CD24highCD38high Breg细胞与CD19+CD24highCD27+Breg细胞均表达BAFF-R、TACI、BCMA,并且两群细胞间BAFF-R、TACI、BCMA的表达差异无统计学意义(BAFF-R:97.17%±6.17%vs.96.46%±8.64%,P=0.743;TACI:65.84%±28.60%vs.71.43%±36.51%,P=0.558;BCMA:91.15%±9.62%vs.90.28%±13.61%,P=0.799)。CD19+CD24highCD38high Breg细胞BAFF-R、TACI的表达高于非CD19+CD24highCD38high细胞(97.17%±6.17%vs.89.56%±7.43%、65.84%±28.60%vs.39.07%±23.92%,P=0.000、0.002),而BCMA的表达(94.13%±3.15%)无差异(P=0.495)。CD19+CD24highCD27+Breg细胞BAFF-R、TACI、BCMA的表

关键词： 脂氧素A4   调节性B细胞   白介素10   调节性T细胞  

摘要： 目的：脂氧素(LXA4)在炎症的调控中发挥着重要作用。LXA4同样具有抗肿瘤作用。我们实验室先前的研究发现,LXA4能通过重塑肿瘤微环境和抗肿瘤血管生成来抑制肝癌肿瘤细胞的生长,但是其免疫学机制仍不是十分清楚。调节性B细胞,是一种能分泌IL-10的B细胞,已被证明在炎症、自身免疫性疾病和肿瘤的调控中发挥重要作用。最新的研究表明人和小鼠的B细胞上都有LXA4受体的表达。本研究旨在通过研究LXA4对调节性B细胞的作用来阐明其抑制肿瘤生长的免疫学机制。 方法：(1)将不同的肿瘤细胞系通过皮下接种至小鼠,随机分为两组,其中一组腹腔注射LXA4类似物BML-111(1mg/kg)进行治疗,观察并记录肿瘤生长情况。此外,用CFSE标记小鼠肝癌H22细胞,培养24h后,检测LXA4对细胞生长的影响。(2)为寻找LXA4抑制肿瘤的机制,将肝癌H22细胞接种至SCID小鼠,并分为四组：对照组、LXA4治疗组、CD3+T细胞过继转移组、CD3+T细胞过继转移+LXA4治疗组,观察并记录肿瘤生长的情况。(3)为探讨LXA4对调节性B细胞的作用,体外条件下,分离小鼠脾脏B细胞,培养液中加入或不加LXA4,并在PMA、离子霉素、LPS和莫能菌素四种因子的刺激下,5h后通过流式细胞术检测LXA4对调节性B细胞生成的影响。体内条件下,将LXA4治疗的肿瘤小鼠的脾脏取出,比较治疗组和对照组调节性B细胞的数量。为探讨LXA4对B细胞其他功能的作用,通过CFSE标记、流式细胞术和HE染色的方法检测LXA4对B细胞增殖、浆细胞分化以及生发中心结构的影响。(4)将裸鼠皮下接种H22细胞,分为两组,其中一组每两天用LXA4治疗一次,观察并绘制肿瘤生长曲线,并通过流式细胞术和ELISA法检测小鼠脾脏调节性B细胞的数量及外周血、脾脏组织内炎症因子***-α和IL-1β的蛋白表达情况。(5)将纯化的CD4+T细胞标记CFSE,检测LXA4对其增殖的影响;将纯化的CD8+T细胞用PMA和离子霉素刺激,检测LXA4对其分泌IFN-γ能力的影响。(6)将H22细胞皮下接种至Balb/c小鼠,分为两组,其中一组每两天用LXA4治疗一次,第15天取脾脏、接种肿瘤侧引流淋巴结并分离肿瘤组织内浸润的淋巴细胞,通过流式细胞术检测调节性T细胞的数量和CD8+T细胞的杀伤能力。并通过免疫组织化学的方法检测肿瘤组织内浸润的T细胞的数量。(7)通过磁珠分选的方法将CD4+CD25-T细胞纯化出来后,在刺激性抗体CD3和CD28以及细胞因子TGF-β和IL-2的作用下,72h后检测LXA4对诱导生成的调节性T细胞数量的影响。另外,将纯化出来的CD4+T细胞与B细胞按照1：1的比例在CD3和LPS的作用下共培养,72h后检测LXA4能否通过B细胞影响诱导的调节性T细胞的生成。(8)为寻找LXA4影响调节性B细胞的分子机制,将LXA4治疗小鼠的脾脏细胞或纯化的B细胞提取蛋白质,并通过Western Blot的方法检测转录因子ERK和STAT3的磷酸化水平。此外,体外诱导调节性B细胞并加入ERK或STAT3的磷酸化抑制剂,5h后检测调节性B细胞生成的情况。 结果：(1)LXA4类似物BML-111对多种不同的肿瘤细胞系都有抑制其在体内生长的作用。此外,LXA4对肿瘤的生长没有直接的影响。(2)与对照组相比,LXA4能够促进SCID小鼠的肿瘤生长;将CD3+T细胞过继回输至SCID小鼠体内后,增强了抗肿瘤的效应,但是LXA4同样也不影响肿瘤的生长。(3)LXA4在体外和体内都能明显抑制调节性B细胞的生成,但是LXA4不影响B细胞的增殖、生发中心的结构以及浆细胞的分化。(4)在裸鼠中,LXA4能明显抑制调节性B细胞的生成,同时降低了炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表达,但是肿瘤在裸鼠中的生长并没有受到影响。(5)LXA4不影响CD4+T细胞的增殖以及CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力。(6)LXA4抑制了引流淋巴结和肿瘤组织内的调节性T细胞的数量,并增强了CD8+T细胞的杀伤能力,但是对脾脏中的这两种细胞没有影响;免疫组化的结果显示LXA4增强了CD3+T细胞浸润肿瘤的能力。(7)LXA4不能通过直接作用影响调节性T细胞的生成,但是可以通过B细胞来抑制这种细胞的数量。(8)LXA4能有效地抑制B细胞而不是脾脏细胞中转录因子ERK和STAT3的磷酸化水平。加入ERK或STAT3的磷酸化抑制剂后能有效地抑制调节性B细胞的生成,说明这两种转录因子的磷酸化与调节性B细胞的生成密切相关。 结论：LXA4能有效地抑制多种肿瘤细胞的生长;LXA4对肿瘤细胞没有直接作用,而是通过对调节性B细胞的抑制从而增强了抗肿瘤效应;LXA4通过抑制调节性B细胞的生成从而减少了引流淋巴结和肿瘤组织内调节性T细胞的数

关键词： 免疫性血小板减少症   调节性B细胞   Th17细胞   糖皮质激素  

摘要： 目的：原发免疫性血小板减少症(Primary immune thrombocytopenia, ITP)是一类获得性、免疫性血小板生成障碍以及破坏增加的出血性疾病。近年来细胞免疫异常在其发病中的作用愈来愈受到重视。本实验通过流式细胞术检测ITP患者应用糖皮质激素治疗前后及正常对照组外周血调节性B细胞(regulatory B cells, Bregs)、Th17细胞的比例,探讨Bregs、Th17细胞在ITP发病中的作用、糖皮质激素对其表达的影响,以及ITP患者治疗前后血小板计数与Bregs、Th17细胞表达的相关性。方法：收集2014年6月-2015年1月在兰州大学第二医院血液科门诊或住院部确诊的初治ITP患者27例,患者均应用常规剂量的泼尼松Img/(kg · d)治疗,血小板恢复正常后2周逐渐减量。对照组为17例同期来我院体检的健康者。应用流式细胞术分别检测ITP患者治疗前、治疗4周后及对照组外周Bregs (CD19+CD24hiCD38hi)/CD19+和Th17 (CD3+CD8-IL-17+)/CD4+细胞的比例。结果：ITP组治疗前Bregs/CD19+细胞比例明显低于正常对照组(1.19±0.77vs 2.54±0.83)%,差异有统计学意义(P<0.001);治疗后Bregs/CD19+细胞的比例较治疗前明显增高(2.33±0.75 vs 1.19±0.77)%,差异有统计学意义(P=0.002),但与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。ITP组治疗前Th17/CD4+细胞的比例明显高于正常对照组(2.60±0.95 vs 1.16±0.60)%,差异有统计学意义(P<0.001);治疗后Th17/CD4+细胞的比例较治疗前降低(1.51±0.77 vs 2.60±0.95)%,差异有统计学意义(P=0.003),但与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);ITP治疗前后Bregs/CD19+(%)与Th17/CD4+(%)比例均呈负相关,差异有统计学意义(P<0.01);ITP组治疗前后Breg/CD19+(%)差值与血小板计数(×109/L)的差值呈正相关性,差异有统计学意义(P<0.01), Th17/CD4+(%)差值与血小板计数(×109/L)的差值无相关关系。结论：ITP患者存在Bregs细胞比例降低,Th17细胞比例增加,提示Bregs/Th17失衡参与ITP发病。糖皮质激素治疗可上调Bregs细胞表达,下调Th17细胞表达,且Bregs变化与血小板变化具有相关性。Bregs口Th17细胞比例在治疗前后均呈负相关性,提示Bregs可通过抑制Th17细胞发挥其负向调节作用。

关键词： 类风湿关节炎   调节性T细胞   调节性B细胞   临床观察  

摘要： 本文主要从以下几个部分进行论述：　　第一部分 类风湿关节炎患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Tregs的变化　　目的：　　调节性T细胞（RegulatoryT cell，Tregs）参与免疫性疾病的发病机制目前尚不十分清楚，但其在自身免疫耐受和维持内环境稳态中起着重要作用，当失去平衡时会影响疾病的发生、活动性。Tregs在类风湿关节炎(RheumatoidArthritis，RA)发病、病情进展方面作用如何，临床研究报告不多。本研究通过应用流式细胞仪技术检测RA患者外周血CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占CD4+T淋巴细胞百分比变化，并与正常对照组、患者病情活动情况进行比较分析，探讨Tregs与RA发生、发展的关系。　　方法：　　选择RA患者69例，健康对照者(Health control，HC)26例。患者排除其他自身免疫性疾病、肿瘤、感染及相关药物应用史。采集并提取外周血单个核细胞，应用流式细胞仪技术进行相关检测。分析CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占外周血CD4+T淋巴细胞比例和CD4+CD25+FoxP3+ Tregs与疾病活动度（依据DAS28评分）及临床疾病活动相关指标的关系;同时，将RA患者根据病程分为3组，即病程不超过1年组，病程1-5年组，病程超过5年组，结合DAS28评分，将其分为DAS28＞3.2、DAS28＞5.1组进行分析。　　结果：　　1、RA患者组CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占外周血CD4+T淋巴细胞比例总体分析较HC组明显增多;但在病程不超过1年，DAS28＞3.2组，其CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例呈现减少改变，但与正常对照组无统计学差异;2、CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例变化与RA患者红细胞沉降率(Erythrocytesedimentation rate，ESR)和C反应蛋白(C reactive protein，CRP)呈正相关，但与类风湿因子(Rheumatoid factor，RF)和抗CCP抗体间无明显相关性;3、CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例变化与RA患者疾病活动度呈正相关;4、在病程不超过1年组和病程1-5年组，CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例变化在DAS28＞5.1组和DAS28＞3.2组间具有显著差异，且病程越短差异性越显著;但在病程超过5年组无明显差异。　　结论：　　CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占外周血CD4+T淋巴细胞比例在RA组总体表现增多，并且与ESR、CRP、DAS28呈正相关性，说明CD4+CD25+FoxP3+ Tregs的变化与RA疾病活动相关。通过对不同病程、疾病活动程度不同（即通过DAS28进行判断）的患者进行该项分析研究表明，病程越短，CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占外周血CD4+T淋巴细胞比例变化越大，对疾病的影响越大。而CD4+CD25+FoxP3+ Tregs比例的增加除了有机体反应性增高因素外，其可能通过多种途径参与RA发生、发展、加重过程。因此，在临床诊治过程中，早期选择能够有效调节或影响CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占CD4+T淋巴细胞比例及功能的药物，对控制RA病情变化及进展具有重要意义。　　第二部分 三种临床常用治疗药物在体外培养中对CD4+CD25+FoxP3+Tregs变化的影响　　目的：　　Tregs通过抑制多种免疫细胞的增殖和功能参与维持免疫稳态。近年，也有文献报告其参与机体炎症反应过程。调整Tregs在外周血中占CD4+T淋巴细胞比例可能成为临床上免疫相关疾病治疗的一种新策略。在RA相关研究中，关于临床药物在RA患者中针对CD4+CD25+FoxP3+ Tregs调控作用的比较分析报告尚少。本研究选取甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)、糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)、抗TNF-α靶向药等目前RA治疗中常用药物，利用细胞培养技术，通过流式细胞仪分析给药前及细胞培养结束时CD4+CD25+FoxP3+ Tregs占CD4+T淋巴细胞百分变化，探讨其在RA临床治疗中对CD4+CD25+FoxP3+ Tregs的作用及影响。　　方法：　　选择RA患者90例，随机分为5组，分别设为无药组、MTX组、GC组、抗TNF-α靶向药组、联合应用3种药物组，选择健康对照者10例，同时选择临床应用MTX患者10例。患者排除其他自身免疫性疾病、肿瘤、感染及相关药物应用史。无菌条件下采集并提取外周血单个核细胞，利用细胞培养技术，通过流式细胞仪在给药前及细胞培养结束时进行相关检测。分析不同治疗药物和方法对CD4+CD25+FoxP3+ Tregs变化的作用及影响，探讨在临床治疗中可能的意

关键词： 湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征   自身免疫   调节性B细胞   重症联合免疫缺陷病   不典型   临床特点   免疫表型  

摘要： 第一部分WAS蛋白缺陷对调节性B细胞的影响目的：探究WAS蛋白(Wiskott-Aldrich syndrome protein, WASp)缺陷对调节性B细胞(B10)的影响,以及调节性B细胞在Wiskott-Aldrich综合征并发自身免疫中的潜在作用。方法：利用流式细胞术,检测WASp KO小鼠外周不同组织B10细胞的比例变化,同时检测WAS患儿外周血中B10细胞及B10+B10pro细胞的比例变化。利用年老WASp KO小鼠发生自身免疫性结肠炎这一宝贵的非诱导性自身免疫模型,检测B10细胞和调节性T细胞及Thl细胞比例变化,探讨B10细胞与Treg/Th1平衡的关系。结果：WAS患儿外周血B10细胞比例为0.75±0.29(n=9),显著低于对照组2.01±0.60 (n=14) (P=0.0002);B10+B10pro细胞比例为1.09±0.58(n=6),显著低于对照组2.65±0.58(n=9)(P=0.0004)。WASp KO小鼠的外周血、腹腔、脾脏、淋巴结中B10细胞比例分别为1.20±0.65(n=7)、10.72±5.05(n=6)、0.71±0.17(n=7)、0.74±0.16(n=6),对比WT小鼠相应比例2.06±0.43(n=7)、22.51±6.69(n=7)、1.52±0.80(n=7)、1.89±0.47(n=5),均显著下降(P<0.05)。年老WASp KO小鼠的外周血、腹腔、脾脏、淋巴结中B10细胞比例分别为1.35±0.64(n=6)、8.30±3.90(n=6)、0.90±0.16(n=6)、0.57±0.25(n=3),对比年老WT小鼠相应比例1.82±0.69(n=8)、15.81±6.87(n=9)、1.49±0.35(n=7)、1.41±0.40(n=7),除外周血无差别外(P=-0.2284),均有显著下降(P<0.05)。年老WASp KO小鼠腹腔和肠系膜淋巴结中Treg细胞比例分别为1.07±0.65(n=9)、3.17±0.62(n=6),Thl细胞比例分别为33.17±14.35(n=6)、9.57±1.54(n=6),对比年老WT小鼠相应比例1.83±0.51(n=7)、5.42±0.85(n=7)、14.38±6.42(n=7)、8.47±1.00(n=6),除肠系膜淋巴结中Thl细胞比例无差别外(P=0.2403),均有显著上升(P<0.05)。结论：WASp缺陷可能导致B10细胞稳态失衡和(或)功能障碍,缺陷的B10细胞可能是WAS自身免疫性并发症发生的主要参与者。第二部分不典型重症联合免疫缺陷病临床研究目的：向临床医师,尤其是儿童免疫专科医师引入不典型重症联合免疫缺陷病的概念;汇集目前报道过的所有不典型重症联合免疫缺陷病的临床病例报道文献,总结其临床特点,尤其是免疫学检查特点,为临床不典型重症联合免疫缺陷病的早期诊断提供辅助。方法：从中英文数据库中检索截止到2013年6月12日的相关病例报道,并对目标病例的临床特点、免疫表型、分子特征等进行归纳总结。结果：该组不典型SCID患者的发病年龄从3月到17岁不等,中值约为9月,诊断年龄从10月到41岁不等,中值约为5岁。其感染的间隔和趋势主要表现出以下特点：感染较轻的(无并发症及严重后遗症),感染间隔相对较短(1个月左右),感染较重的(有并发症或严重后遗症),其感染间隔会相对较长(数月至数年不等),更有少数病例几乎没有反复感染的病史。不典型SCID患者的T、B细胞功能受损程度都较典型患者小,如不典型SCID的T细胞对PHA的增殖反应多数得到了保留,ADA组(7/19)、JAK3组(6/8)、Artemis组(3/3)、RAG1/2组(11/11);免疫球蛋白的水平也较典型患者高,ADA组(19/20)、Artemis组(3/3)、RAG1/2组(11/11);特异抗体反应也有相当程度的保留。结论：不典型重症联合免疫缺陷病在感染特征、淋巴细胞计数、抗体产生及淋巴细胞增殖等方面较典型重症联合免疫缺陷病有诸多不同。目前国内临床医师对不典型重症联合免疫缺陷病的认识不足,提高诊断意识,结合不典型重症联合免疫缺陷病的临床特征,免疫学检测及基因分析将极大帮助该病的诊断。

关键词： 白芍总苷   肝细胞肝癌   二乙基亚硝胺   调节性B细胞   B细胞激活因子  

摘要： 肝细胞肝癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,在全世界癌症死亡中排第三位。大约占所有原发性肝癌病例的70%-80%。肝癌的放射治疗、外科手术治疗、化学治疗和肝脏移植等方法是目前治疗HCC常用的,但大多数患者确诊时已发展至癌症晚期,且患者体质较差,故大部分患者只适合保守疗法,治疗肝癌仍具有很大的挑战性。现在的一些研究开始关注HCC的免疫治疗。在大多数情况下,自身免疫调节有助于肿瘤的缓解,这说明免疫系统在控制肝癌的发生发展中占有重要作用。调节性B细胞(Bregs)主要是通过生成抑制性细胞因子来协调免疫系统和维持B细胞的抑制作用。Bregs已被证明可通过对自身反应性T细胞抑制自身免疫,也可以直接抑制细胞毒性T淋巴细胞活性减弱抗肿瘤免疫。越来越多的证据表明Bregs在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用。虽然Bregs已被证明在肿瘤的发生发展中具有至关重要的作用,但在肿瘤发生发展过程中诱导Bregs生成的肿瘤微环境因素或细胞因子仍然不明了。B淋巴细胞刺激因子(BAFF)是TNF家族细胞因子的一员,对调节B淋巴细胞的成熟和功能至关重要。早期文献表明,BAFF被普遍认为是炎症促进因子,BAFF可诱导边缘带B细胞(MZ B细胞)分化成可分泌IL-10的调节性B细胞。文献表明BAFF在调节B淋巴细胞的成熟和功能中扮演着双重角色。在本课题中我们将探讨Bregs及其分化增殖密切相关的细胞因子在HCC发生发展中重要作用。白芍总苷(TGP)是从传统中药芍药根部提取出的有效部位,没有明显的毒性或副作用。TGP中包含芍药苷、芍药花苷、苯甲酰芍药苷和芍药内酯苷,芍药苷是其主要活性物质。TGP具有抗炎镇痛免疫调节等作用,治疗肝脏疾病和类风湿关节炎效果明显。其对SMMC-7721和HepG2细胞增殖的抑制作用早已被我们实验室证实。这些发现为TGP能否抑制肝癌的免疫逃逸从理论上提供了有价值的线索。在本课题中我们将研究Bregs及其相关细胞因子在肝癌的发生发展中的动态变化,TGP能否通过影响Bregs及其相关细胞因子治疗DEN诱导的实验性肝癌。目的：1.部分阐明HCC发生发展中Bregs及其相关细胞因子的动态变化;2.明确TGP对大鼠HCC的治疗作用及部分机制。方法：1建立DEN诱导大鼠HCC模型,SD大鼠随机分为正常组、模型组和TGP组(30、60、120 mg·kg-1),共5组。模型组、TGP组大鼠灌胃给予DEN造模,于每天上午灌胃(0.1% DEN 8 mg/kg/次,每周6天,每天1次),同时给予正常组相同量的生理盐水,共16周。在第12周开始,分别灌胃TGP(30、60、120mg·kg-1),每天1次,连续4周,正常组和模型组给予等量的5%CMC-Na。分别于造模的第4周,第12周和第16周称重后采用股动脉取血的方法处死大鼠。无菌操作取出各组大鼠脾脏和肝脏,分别称重,并记录大鼠肝脏和脾脏的重量计算肝脾指数。量取并记录肝脏表面的肿瘤体积以及结节的数量;采用检测试剂盒检测各实验组大鼠血清中ALT、AST、ALP、AFP、BAFF、IL-4、IL-7和IL-10的水平变化;各组大鼠肝脏的组织病理学检查使用HE染色法进行观察;流式细胞术检测大鼠外周血中Bregs表达比例。Western-blot法检测大鼠脾脏中B细胞成熟抗原(BCMA)、穿膜蛋白活化物(TACI)和B细胞活化因子受体(BAFF-R)表达水平的变化。2体外培养正常大鼠脾脏淋巴细胞,加入不同浓度的BAFF刺激,并观察Pae作用。采用流式细胞术法检测Bregs的比例,使用ELISA检测上清中IL-10的水平。结果：***对DEN诱导大鼠HCC的治疗作用1.1 TGP对HCC大鼠肝脾指数、肿瘤体积、肿瘤结节数以及死亡率的作用与正常组对比,模型组大鼠死亡率明显升高,肝脏和脾脏指数也有显著上升、肝脏肿瘤结节体积明显变大结节数明显上升。与模型组比较,iTGP(60、120 mg·kg-1)能显著降低HCC大鼠升高的肝脾指数,减少肝表面结节数和减小肿瘤结节体积。且大鼠死亡率也明显降低。1.2 TGP对DEN诱导HCC大鼠的肝脏组织病理学影响正常组大鼠有着完整清晰的肝小叶构造肝且表面光滑有光泽,肝索排列很整齐,细胞核清晰。经过DEN诱导16周后,肝脏表面粗糙不平,出现大小不等的结节,癌肿形成,出现结构紊乱的肝小叶,发生炎性细胞浸润,同时大量假小叶出现,HCC细胞呈现低分化,癌细胞浸润,细胞排列紊乱,异型性明显,细胞核增大,胞质减少。TGP(60、120 mg·kg-1)剂量组明显减轻炎性细胞发生浸润,减少肝脏上假小叶形成和出现,同时癌细胞的异型性明显降低。1.3 TGP对DEN诱导HCC大鼠血清ALT、AST和ALP活性的作用与正常组对比,模型组大鼠血清中ALT、AST和ALP的活性明显上升。与模型组比较,T

关键词： 免疫性血小板减少症   生血灵   调节性B细胞   自身反应性B细胞   临床疗效  

摘要： 目的:<br>　　1.观察生血灵治疗免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）脾肾亏虚、火热伤络型患者的临床疗效。<br>　　2.研究ITP患者外周血中CD19+CD24hiCD38hiB细胞(调节性B细胞，Breg)的表达水平、功能特点及临床意义。<br>　　3.探讨生血灵对ITP患者Breg表达水平、功能影响及其免疫学作用机制。<br>　　方法:<br>　　1.采用随机对照研究方法，选取脾肾亏虚、火热伤络型ITP患者60例，随机分为2组，分别以生血灵和强的松治疗，观察比较两组治疗前后血小板计数、西医临床疗效、中医证候疗效、止血疗效及毒副反应。<br>　　2.以CD19+CD24hiCD38hi作为Breg标记，流式细胞仪检测30例ITP患者（生血灵治疗前后）及10例健康人外周血中Breg占CD19+B细胞的比例。<br>　　***分选30例ITP患者（治疗前后）和10例健康人外周血Breg，Q-PCR法检测Breg分泌的细胞因子白细胞介素-10(IL-10) mRNA和转化生长因子-β(TGF-β)mRNA的表达水平。<br>　　***分选含有Breg及除外Breg的PBMC分别置于预先包被抗CD3/CD28抗体的24孔板培养72h，ELISA法检测IFN-γ和TNF-α，通过Breg抑制IFN-γ和TNF-α等的表达来反映Breg在ITP中的功能及生血灵对其功能的影响。<br>　　5.流式微球术检测治疗前后ITP患者及健康人血小板特异性抗体水平，以反映自身反应性B细胞功能变化、Breg对自身反应性B细胞的调节与抑制作用及中药干预后的变化。<br>　　结果:<br>　　1.治疗组和对照组ITP患者治疗后血小板计数(BPC)均较治疗前有明显提高，有统计学意义（均P＜0.01），两组间比较，生血灵治疗组治疗后的BPC明显高于强的松对照组(P＜0.01);生血灵治疗3个月后，治疗组总有效率90％明显高于强的松组56.7％（P＜0.01）;生血灵治疗组治疗后中医证候多有明显改善，总痊愈显效有效率86.67％明显高于强的松对照组50％（P＜0.01）;两组经治疗后出血评分均较治疗前明显降低，两组比较差异无统计学意义(P＞0.05);中药治疗组仅5例出现胃脘部不适等轻微不良反应，而强的松组有18例出现明显水肿、失眠、面色潮红、心悸等不良反应，有统计学差异(P＜0.01)。<br>　　2.治疗前ITP患者Breg的表达率明显低于健康组（P＜0.01）;经过生血灵治疗后ITP患者Breg表达率明显高于治疗前(P＜0.01)，但仍低于健康组(P＜0.01)，经分层分析，治疗后取得完全反应的ITP患者外周血调节性B细胞的表达率与健康组相当，无统计学差异（P＞0.05）。<br>　　3.治疗前ITP患者Breg分泌的IL-10mRNA、TGF-βmRNA表达水平均明显低于健康组(P＜0.01);经生血灵治疗后ITP患者IL-10mRNA表达比治疗前明显提高(P＜0.01)，且与健康对照组比较无统计学差异（P＞0.05）;治疗后ITP患者TGF-βmRNA表达率较治疗前明显提高（P＜0.01），但仍低于健康对照组(P＜0.01)。<br>　　4.生血灵治疗前ITP患者含Breg组IFN-γ表达与不含Breg组接近，无统计学差异(P＞0.05)，健康对照含Breg组IFN-γ表达则明显低于不含Breg组(P＜0.01)，而ITP患者含Breg组IFN-γ表达也明显高于健康组(P＜0.01);经生血灵治疗后，ITP患者含Breg组的IFN-γ表达较治疗前明显下降(P＜0.01)，其表达也比不含Breg组明显降低，有统计学差异(P＜0.01)，但仍高于健康对照组(P＜0.05);生血灵治疗前ITP患者含Breg组TNF-α表达比不含Breg组明显降低(P＜0.01)，但比健康对照含Breg组表达明显增高(P＜0.01)，经治疗后ITP患者含Breg组TNF-α表达较治疗前明显降低（P＜0.01），并接近健康对照组(P＞0.05)。<br>　　5.将各组流式微球术检测后的平均荧光强度值与阴性对照进行比较，计算比率，在ITP组该比率均值为3.34±0.7，明显高于健康对照组(0.99±0.06)，两组荧光强度比率存在显著差异(P＜0.01)，经生血灵治疗后比率均值为1.87±0.25，与治疗前比较有明显差异(P＜0.01)，但仍明显高于健康组(P＜0.01）。<br>　　结论:<br&g

关键词： B细胞淋巴瘤   调节性T细胞   免疫调节   预后  

摘要： 研究背景:非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)是发生在淋巴结或者结外淋巴组织的恶性肿瘤,由于其发生于免疫组织、细胞,其与自身免疫调节的关系就成为研究恶性淋巴瘤发病机制及疾病进展的重点。调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)参与机体的免疫耐受过程,其数量的增减或者功能的缺陷可能会引起T细胞及B细胞的异常活化,从而在肿瘤细胞的免疫耐受中发挥着关键作用,在非霍奇金淋巴瘤的发生、发展及恶化过程中起重要的作用。调节性T细胞结构和功能的维持依赖多种细胞表面或内部分子,如CD4,CD25,CD103,Fox P3以及GITR和CTLA-4等。使用CD4+CD25+Fox P3+为标志物标记调节性T细胞具有特异性和准确性的优势。但是目前有关调节性T细胞的细胞表型与非霍奇金淋巴瘤相关性的多项研究结果并不一致,而我们初期的研究表明CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞在B细胞淋巴瘤患者外周血中的数量明显高于对照组患者。因此,探讨CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在B细胞淋巴瘤患者中外周血中的数量变化对于该疾病的临床诊断、治疗及预后判断具有十分重要的意义。目的:采用流式细胞技术检测正常对照组及B细胞淋巴瘤患者外周血中CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞的水平,分析CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞在初诊及治疗后B细胞淋巴瘤患者外周血中的水平变化情况;探讨B细胞淋巴瘤患者外周血中CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞与B细胞淋巴瘤患者临床特点的关系,初步探讨调节性T细胞与B细胞淋巴瘤的发生、发展及预后的相关性,为临床B细胞淋巴瘤的诊断、治疗及预后判断提供借鉴和参考。方法:选取我院2013年4月至2013年12月期间就诊的B细胞淋巴瘤患者38例为观察研究组,20例健康体检志愿者设为对照组,利用流式细胞技术对研究组化疗前后及对照组外周血中CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞比例进行检测和对比,判断CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞在不同患者及患者的不同状态中的水平变化;同时分析B细胞淋巴瘤患者外周血中CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞比例与血清LDH、β2微球蛋白的相关性。结果:初次就诊的B细胞淋巴瘤患者外周血CD4CD25FoxP3调节性T细胞比例显著高于健康对照组,且两组之间有显著的统计学差异性(P≤0.05)。本研究发现B细胞淋巴瘤患者化疗后达到完全缓解及部分缓解的患者外周血CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞比例较化疗前组均显著减低,且化疗前后调节性T细胞水平也有显著的统计学差异性(P≤0.05),完全缓解组与部分缓解组患者外周血中CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞有一定的差异性,但无显著的统计学差异性(P>0.05)。同时,CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞比例与B细胞淋巴瘤的病理类型、IPI指数、Ann Arbor分期之间存在的差异无显著的统计学差异性(P>0.05)。CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞比例与B细胞淋巴瘤患者血清LDH、β2微球蛋白呈正相关。结论:研究结果证实初诊的B细胞淋巴瘤患者外周血中CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞水平明显增高,而与B细胞淋巴瘤患者的临床分期及肿瘤的病理类型、IPI指数、Ann Arbor分期无关,经有效化疗后其调节性T细胞水平显著降低,CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞比例与患者血清LDH、β2微球蛋白呈正相关。即患者外周血中CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞水平是判断B细胞淋巴瘤疗效的重要参考指标,监测外周血CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞水平对于判断B细胞淋巴瘤的预后具有临床应用价值。

关键词： IL-28B   腺病毒   宫颈癌   U14细胞   Tregs  

摘要： 目的：构建小鼠(Babl/C和c57bl/6j )U14宫颈癌皮下移植瘤模型,研究腺病毒介导的IL-28B (Ad-mIL-28B)对U14宫颈癌皮下移植瘤小鼠脾脏中调节性T细胞(Tregs)的影响及其抗肿瘤的作用。方法：体外培养人胚肾293(HEK293)细胞;使用HEK293细胞扩增腺病毒(Ad-mIL-28B和Ad-EGFP);采用微量全细胞病变法(CPE)进行病毒(Ad-mIL-28B 和 Ad-EGFP)滴度的测定;体外培养小鼠U14宫颈癌细胞,建立Babl/C 和 c57bl/6j小鼠U14宫颈癌腹水模型和皮下移植瘤模型;观察并测定Ad-mIL-28B处理后小鼠(Babl/C口c57bl/6j) U14宫颈癌皮下移植瘤瘤体的生长、瘤重,并计算抑瘤率、脾脏、肺脏和肝脏指数;流式细胞术检测Ad-mIL-28B处理后,U14宫颈癌皮下移植瘤小鼠(Babl/C口c57b1/6j)脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Tregs的变化;HE染色法检测小鼠(Babl/C 和 c57bl/6j) U14宫颈癌皮下移植瘤瘤体、肺脏及肝脏组织的病理变化。结果：1.采用CPE法测定病毒滴度后,病毒(Ad-mIL-28B 和 Ad-EGFP)滴度均为：108PFU/100μL。2成功建立了小鼠(Babl/C 和 c57b1/6j) U14宫颈癌腹水模型和皮下移植瘤模型。***-mIL-28B组、Ad-EGFP组及PBS组小鼠脾脏中的CD4+CD25+Foxp3+Tregs在淋巴细胞中所占的比例分别为4.76%±0.97%、5.38%±1.55%和6.92%±1.18%,与PBS组相比,Ad-mIL-28B组脾脏中的CD4+CD25+Foxp3+Tregs在淋巴细胞中所占的比例减少(p=0.034).4. Ad-mIL-28B组、Ad-EGFP组和PBS组Babl/C小鼠移植瘤的体积分别为107.6mm3±30.8mm3、 181.8mm3±14.2mm3 和 240.2mm3±21.3mm3,与PBS组相比,Ad-mIL-28B组能够明显的减小移植瘤的体积(p=0.008)。***-mIL-28B组、Ad-EGFP组和PBS组c57bl/6j小鼠移植瘤的体积分别为9.9mm3±2.7mm3、44.4mm3±7.6mm3和48.2mm3±8.1mm3,与 PBS组相比,Ad-mIL-28B组能够明显的减小移植瘤的体积(p=0.001)。***-mIL-28B组、Ad-EGFP组及PBS组小鼠移植瘤瘤重分别为78.4g±23.3g、200.1g±90.3g口303.2g±123.2g,与PBS组相比,Ad-mIL-28B组小鼠移植瘤瘤重明显减轻(p=0.049)。***-mIL-28B组、Ad-EGFP组和PBS组Babl/C小鼠的抑瘤率分别为：66.45%±8.88%、24.76%±6.68%和0%,与PBS组相比,Ad-mIL-28B能明显的抑制移植瘤的生长(p=0.000)。***-mIL-28B组脾脏和肺脏指数的变化与对照组相比,有统计学意义(p<0.05),而肝脏指数的变化无明显的统计学意义。***染色结果表明,Ad-mIL-28B组肿瘤组织中的异型性的肿瘤细胞的数量与对照组相比明显减少,肺脏和肝脏组织未见明显的瘤细胞转移。结论： Ad-mIL-28B能够降低U14宫颈癌皮下移植瘤小鼠(Babl/C和c57b1/6j)脾脏中的CD4+CD25+Foxp3+Tregs,并且能抑制小鼠(Babl/C和c57bl/6j)U14宫颈癌皮下移植瘤的生长,Ad-mIL-28B可能是通过降低CD4+CD25+Foxp3+Tregs的表达从而抑制小鼠(Babl/C和c57bl/6j)U14宫颈癌皮下移植瘤的生长。