关键词： 胃癌(gastric cancer,GC)   Breg细胞   白介素10(IL-10)   Treg细胞   Th细胞   Tc细胞   叉头状转录因子(Foxp3)   转化生长因子(TGF-β)   免疫逃逸  

摘要： 目的免疫调节在胃癌发生发展及转移中发挥重要作用。近来,研究发现一群具有调节作用的B淋巴亚群——称为调节性B淋巴细胞(regulatory B cells,Breg)。Breg在自身免疫性疾病中的研究已经取得了初步研究结果,但是Breg在胃癌中的作用并不清楚。本研究以原发性胃癌(gastric cancer,GC)为研究对象,检测调节性B淋巴细胞(Breg)在胃癌中的百分比变化,探讨其在胃癌中的表面标志特性,研究Breg细胞在胃癌中可能的作用及相关机制,为调节性B淋巴细胞在胃癌及人类肿瘤甚至其在其他疾病中的研究提供研究基础。方法(1)用流式细胞仪分析的方法测定40例健康对照组(Healthy control,HC)和107例原发性胃癌患者(gastric cancer,GC)外周血中CD19B淋巴的百分比的状况,研究胃癌患者外周血B淋巴百分比与其肿瘤TNM分期的关系。免疫组织化学染色的方法检测不同TNM分期胃癌患者肿瘤组织局部CD19B淋巴细胞的分布情况。通过流式细胞术的方法检测和分析胃癌患者正常组织、癌旁组织及肿瘤组织中CD19B淋巴细胞(CD45CD19)在淋巴细胞中的百分比。(2)ELISA方法检测胃癌患者血清中分泌的细胞因子IL-10的水平。流式细胞术分析胃癌患者外周血PBMC及癌旁组织及肿瘤组织B淋巴细胞中CD19IL-10B淋巴细胞的百分比。(3)采用多色流式细胞术检测表面标志CD5、CD1d、CD24、CD38、Ig M、CD25、CD10、CD21、CD20各指标在IL-10B淋巴细胞和IL-10-B淋巴细胞表面平均荧光强度(MFI)表达的不同,确定Breg细胞合适的表面标志为CD19CD24 CD38。(4)流式细胞术分析胃癌患者外周血PBMC及肿瘤组织淋巴细胞中CD19CD24 CD38在CD19B淋巴细胞的百分比变化,分析Breg细胞百分比与肿瘤TNM分期的可能关系。(5)通过流式细胞术分析胃癌患者体内中CD3T淋巴细胞、CD3CD4Th淋巴细胞、CD3CD8Tc淋巴细胞、CD3-CD19B淋巴细胞、CD3-(CD1656)NK淋巴细胞、CD3(CD1656)NKT淋巴细胞的百分比,详细分析胃癌患者中各功能细胞亚群如CD4IFN-γTh1细胞、CD4IL-4Th2细胞和CD4Fox P3Treg细胞的百分比变化。(6)进一步分析胃癌患者中CD19CD24 CD38 Breg细胞与各细胞亚群的相关关系。(7)采用流式细胞分选技术、CFSE染色、细胞共培养、流式细胞检测等方法研究CD19CD24 CD38 Breg细胞对CD3T淋巴细胞、CD3CD4Th淋巴细胞、CD3CD8Tc淋巴细胞亚群增殖的影响,检测Breg细胞对Th淋巴细胞、Tc淋巴细胞分泌细胞因子的影响,检测Breg细胞对Treg细胞转化生成的影响。(8)通过功能抗体中和阻断实验评估IL-10及TGF-β在Treg细胞转化过程中是否起到作用。研究中统计分析采用Graph Pad Prism 5.0软件分析。结果(1)40例健康对照和107例胃癌患者外周血标本中B淋巴细胞的百分比无明显差异(14.03%±4.39%vs 15.06%±7.47%,P>0.05)。(2)胃癌患者不同TNM分期(Ⅰ期18例、Ⅱ期40例、Ⅲ期46例和Ⅳ期3例),分析其外周血中B淋巴细胞百分比与TNM分期的关系,发现不同TNM分期其外周血中B淋巴细胞百分比不同,Ⅰ期>Ⅱ期>Ⅲ期,但Ⅳ期例外:TNM III期胃癌患者外周血CD19B淋巴细胞的百分比显著低于TNM I期患者(P<0.001),而且低于TNM II期患者(P<0.05),而TNM IV患者外周血B淋巴细胞百分比增高,高于TNM III期患者,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)流式细胞术及免疫组织化学染色都检测到大量B淋巴细胞在肿瘤组织局部的聚集。(4)ELISA检测发现胃癌患者外周血中细胞因子IL-10明显高于健康对照组(P<0.001)。流式细胞术的检测发现胃癌患者外周血中CD19IL-10B细胞百分比显著高于健康对照组(P<0.001)。采用流式细胞术的检测方法,检测胃癌患者外周血PBMC及癌旁组织、肿瘤组织B淋巴细胞中CD19IL-10B淋巴细胞的百分比,发现胃癌患者肿瘤组织中CD19IL-10B细胞百分比高于癌旁组织(P<0.05),显著高于外周血PBMC(P<0.01)。(5)多色流式细胞术分析IL-10B淋巴细胞表面的特征发现,IL-10B淋巴细胞上CD5、CD38、CD24和CD25的荧光强度明显高于IL-10-B淋巴细胞(P<0.001),IL-10B淋巴细胞上CD1d、Ig M和CD10的荧光强度高于IL-10-B淋巴细胞(P<0.01),IL-10B淋巴细胞上CD21的荧光强度高于I

关键词： 非节段型进展期白癜风   单个核细胞   B细胞   调节性B细胞  

摘要： 目的:检测非节段型进展期白癜风患者外周血及PBMC培养刺激后B细胞、调节性B细胞的数量,及其表面特异分子表型的表达,探讨调节性B细胞是否参与白癜风的发病机制。方法:非节段型进展期白癜风患者10例,正常人10例,采用流式细胞术,检测外周血CD19+B细胞、CD19+IL-10+B细胞、CD19+CD5highCD1dhighB细胞、CD19+CD24highCD38highB细胞的表达;提取外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)培养刺激后,检测CD19+B细胞、CD19+IL-10+B细胞、CD19+CD5highCD1dhighB细胞、CD19+CD24highCD38highB细胞的表达。结果:1.B细胞及调节性B细胞数量检测1.1外周血B细胞数量检测应用流式细胞术检测非节段型进展期白癜风患者外周血CD19+B细胞百分比为(3.68±2.85)%,正常对照组CD19+B细胞百分比为(4.46±3.95)%,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。1.2外周血调节性B细胞数量检测应用流式细胞术检测白癜风患者外周血CD19+IL-10+B细胞百分比为(0.30±0.16)%,正常对照组CD19+IL-10+B细胞百分比为(0.40±0.35)%,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。1.3 PBMC培养刺激后B细胞数量检测提取PBMC,经过培养刺激后,白癜风患者CD19+B细胞百分比为(4.00±0.96)%,正常对照组CD19+B细胞百分比为(4.48±3.09)%,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。1.4 PBMC培养刺激后调节性B细胞数量检测提取PBMC,经过培养刺激后,白癜风患者CD19+IL-10+B细胞百分比为(3.23±0.79)%,正常对照组CD19+IL-10+B细胞百分比为(1.16±0.88)%,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。2.B细胞表面特征性分子的检测2.1外周血CD19+CD5highCD1dhighB细胞的检测应用流式细胞术检测白癜风患者外周血CD19+CD5highCD1dhighB细胞百分比为(0.48±0.52)%,正常对照组CD19+CD5highCD1dhighB细胞百分比为(0.66±0.30)%,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.2外周血CD19+CD24highCD38highB细胞的检测流式细胞术检测白癜风患者外周血CD19+CD24highCD38highB细胞百分比为(1.02±0.44)%,正常对照组CD19+CD24highCD38highB细胞百分比(1.60±1.54)%,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.3 PBMC培养刺激后CD19+CD5highCD1dhighB细胞的检测提取PBMC,经过培养刺激后,结果显示白癜风患者CD19+CD5highCD1dhighB细胞百分比为(0.56±0.22)%,正常对照组CD19+CD5highCD1dhighB细胞百分比为(0.70±0.79)%,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.4 PBMC培养刺激后CD19+CD24highCD38highB细胞的检测提取PBMC,经过培养刺激后,白癜风患者CD19+CD24highCD38highB细胞百分比为(3.88±1.16)%,正常对照组CD19+CD24highCD38highB细胞百分比为(1.15±0.64)%,两组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。3.外周血B细胞数量与疾病严重程度的相关性为了进一步研究CD19+B细胞及CD19+IL-10+B细胞的数量与白癜风皮损面积是否相关,本研究检测了CD19+B细胞、CD19+IL-10+B细胞的数量与VASI评分的相关性。CD19+B细胞与白癜风患者VASI评分无相关性,r=-0.42,p=0.23。CD19+IL-10+B细胞与白癜风患者VASI评分无相关性,r=0.25,p=0.50。结论:1、非节段型进展期白癜风患者外周血中B细胞及调节性B细胞数量与对照1.3 PBMC培养刺激后B细胞数量检测组相比无明显差异,PBMC经体外培养刺激后,白癜风患者CD19+B细胞表达与对照组比较无明显差异,但CD19+IL-10+B细胞的表达明显升高,提示白癜风患者外周血中可能存在调节性B细胞的前体细胞增多。2、PBMC经体外培养刺激后,白癜风调节性B细胞主要表型为CD19+CD24highCD38high。

关键词： 系统性红斑狼疮   调节性B细胞   白细胞介素   巨噬细胞  

摘要： 研究背景：系统性红斑狼疮（SLE）是一种多发于生育年龄女性、累及多脏器的自身免疫性炎症性疾病，其特征为 B细胞异常活化，产生大量的自身抗体，形成免疫复合物在组织沉积，或抗体直接与组织细胞抗原作用，引起细胞破坏，造成广泛组织损伤及机体多系统损害。SLE的病因及发病机制至今仍未完全阐明，B细胞异常被认为是 SLE发病的中心环节之一。一般认为B细胞主要通过产生特异性抗体或多种细胞因子等发挥上调免疫反应的作用，也可作为专职抗原呈递细胞参与免疫应答。但近年的研究发现，缺乏 B细胞和CDl9-/-的小鼠在实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)小鼠模型中疾病更加严重，并且在T细胞介导的炎症反应实验中，CDl9-/-小鼠表现了更为严重的接触性超敏反应(CHS)。由此推断，B细胞在负性调节中亦起到了很大作用，与T细胞一样，B细胞中也存在调节性的细胞亚群。2002年Mizoguchi等在慢性炎症性肠病鼠模型中发现CD1d+的B细胞亚群可分泌IL-10,并抑制疾病进展，并首次开始使用调节性B细胞(Bregs)这个术语。Bregs通过分泌IL-10和TGF-β1发挥负性调节作用。其中产生IL-10的Breg细胞被称为B10细胞。其调节自身免疫性疾病的作用可概括为：自身抗原刺激B10前体细胞，在LPS等条件下发育为成熟B10细胞，后者主要通过分泌IL-10等细胞因子抑制巨噬细胞、APC及Th细胞活化，减少TNF-α、IL-1及IL-6等炎症性细胞因子分泌，下调巨噬细胞吞噬作用，降低APC共刺激分子合成释放，同时抑制Th1细胞活化，从而发挥在自身免疫性疾病中的负向调节作用。IL-10一方面抑制单核巨噬细胞炎症介质的释放及抑制单核巨噬细胞的抗原递呈作用、增强抗炎性因子释放，同时IL-10并抑制IL-12合成的作用，以此阻碍Th1免疫反应。另一方面IL-10可诱导初始T细胞向Tregs转化，其诱导产生的Tregs也可以作用于APCs和DC细胞等发挥免疫抑制功能。　　近年来多个SLE动物模型提示均有Bregs细胞数量减少或功能缺陷导致IL-10和TGF-β1分泌的减少，移植具有分泌IL-10功能的Breg细胞可使病情缓解。因此，分泌IL-10的调节性B细胞（B10细胞）的作用尤为重要，细胞内IL-10染色是B10细胞鉴定方式之一，同时有研究发现CD19+CD24hiCD38hi是分泌IL-10的调节性 B细胞的主要细胞表型。研究 Bregs细胞及其效应的细胞因子在 SLE患者中的表达情况，对了解其在 SLE发病过程中参与的角色及发挥的作用有重要意义。本研究采用流式细胞术检测 SLE患者和健康对照者外周血中CD19+IL-10+细胞及CD19+CD24hiCD38hi细胞的比例，同时应用ELISA技术检测细胞培养上清中IL-10水平，分析其与疾病活动的关系，探讨Bregs细胞及其效应细胞因子在SLE发病机制中的作用。　　研究目的：检测系统性红斑狼疮患者外周血中调节性Bregs的表达，探讨Bregs细胞在SLE发病机制的作用。　　研究方法：选择60例SLE患者（其中活动期38例，稳定期22例）和20例健康对照者为研究对象，分离外周血单个核细胞(PBMC)，以CD40L及 CPG寡核苷酸刺激 PBMC并进行培养，用流式细胞术分析外周血CD19+IL-10+Breg细胞和CD19+CD24hiCD38hi Breg细胞的表达;ELISA方法检测培养上清中白细胞介素（IL）-10的水平。　　研究结果：　　一、CD19+IL-10+细胞检测结果　　1、外周血CD19+IL-10+细胞的表达：SLE患者外周血CD19+IL-10+细胞的表达（1.86±0.80）％较正常对照组（4.36±1.00）%减少，其中活动期SLE患者外周血中CD19+IL-10+细胞的表达率为（1.54±0.64）%，均低于稳定期SLE患者（2.42±0.75）%和正常对照组（4.36±1.00）%;而稳定期SLE患者组外周血中CD19+IL-10+细胞的表达率亦低于正常对照组。　　2、外周血CD19+IL-10+细胞的表达与疾病活动程度的相关性：SLE患者外周血CD19+IL-10+细胞的表达与SLEDAI评分呈负相关。同时，外周血CD19+IL-10+细胞的表达与补体C3及C4呈正相关。　　二、CD19+CD24hiCD38hi细胞检测结果　　1、外周血CD19+CD24hiCD38hi细胞的表达：SLE患者外周血CD19+CD24hiCD38hi细胞的表达（1.53±0.63）%较正常对照组（3.14±0.87）%减少，其中活动期SLE患者外周血中CD19+CD24hiCD38hi细胞的表达率为（1.26±0.45）%，均低于稳定期SLE患者（2.01±0.61）%和正常对照组（3.14±0.8

关键词： 胸腺B细胞   调节性B细胞   调节性T细胞   T细胞分化   免疫稳态  

摘要： 背景:胸腺是机体重要的中枢免疫器官,是T细胞分化、发育、成熟的场所。胸腺细胞经过阳性选择、阴性选择逐渐分化为成熟的T细胞,并迁移到外周免疫器官发挥功能。胸腺为T细胞发育提供了一个复杂的微环境,该微环境由胸腺基质细胞、可溶性分子以及细胞外基质共同构成,有序调控T细胞的发育、成熟和迁移等。近年来有少数研究工作证明,人和鼠的胸腺中均存在着少量的B细胞,其比例占到整个胸腺中所有细胞的0.1-0.5%。正常胸腺中存在着不同发育阶段的B细胞,初步资料显示,胸腺中B细胞具有一定的生理功能,例如参与胸腺内T细胞的分化发育过程。胸腺B细胞可定位于胸腺皮质和髓质的连接处,该区域被认为是胸腺T细胞分化发育过程中阴性选择的发生场所,由此研究人员认为胸腺B细胞在T细胞的阴性选择过程中发挥关键作用,然而胸腺B细胞如何参与T细胞的阴性选择过程及影响T细胞分化、发育机制等仍不清楚。在病理状态下,在胸腺内可发生B细胞的浸润和淋巴滤泡的形成等异常表现,少量研究表明,胸腺B细胞的异常可能与自身免疫病的发生发展相关联,但是胸腺B细胞在自身免疫病中的功能和作用机制等仍不清楚。要解答这些问题都有待于进一步阐明胸腺中B细胞的表型、功能和起源等。因此,我们围绕胸腺B细胞的亚群鉴定及胸腺B细胞亚群在免疫调节和应答中的作用及机制进行了初步探讨。目的:探究生理及自身免疫病中胸腺B细胞亚群变化及其在机体免疫调节和应答中的作用及机制。方法:1.首先,为了验证胸腺中是否存在B细胞,应用流式细胞术对小鼠胸腺淋巴细胞进行胞膜染色,对B细胞所占比例和表型进行分析、鉴定;2.为了鉴定胸腺中调节性B细胞及效应性B细胞,我们分析了正常小鼠和自身免疫病系统性红斑狼疮模型小鼠胸腺中B细胞;为了分析胸腺中是否存在调节性B细胞,分离胸腺淋巴细胞,用LPS(10mg/ml)体外刺激后,收集细胞,通过流式细胞术进行胞内染色,分析IL-10的表达水平。在此基础上,通过胞膜染色对胸腺调节性B细胞表型作进一步分析;为了分析自身免疫病中胸腺效应B细胞,分离胸腺淋巴细胞,通过流式细胞术分析了分泌抗体的浆细胞。3.为了进一步检测胸腺调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)内IL-10表达水平,应用流式细胞仪分选调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)和非调节性B细胞(表型为CD19+CD5-CD1dlo)后,通过实时荧光定量PCR检测IL-10 m RNA相对表达量;4.为了研究胸腺调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)体外功能,首先经胞膜染色标记后,应用流式细胞仪分选调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)和非调节性B细胞(表型为CD19+CD5-CD1dlo),并通过磁珠分选CD4+T细胞;一方面用CFSE标记CD4+T细胞后分别与调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)和非调节性B细胞(表型为CD19+CD5-CD1dlo)体外共培养72h,流式检测CD4+T细胞增殖抑制情况;另一方面,直接将CD4+T细胞与调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)和非调节性B细胞(表型为CD19+CD5-CD1dlo)体外共培养72h,收集细胞,经流式胞内染色检测调节性T细胞水平;5.为了研究胸腺调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)体内生理功能,应用流式细胞仪分选调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi)和非调节性B细胞(表型为CD19+CD5-CD1dlo)后,经尾静脉回输给CD19cre小鼠和狼疮小鼠,取脾、淋巴结、胸腺等免疫器官和组织,应用流式细胞术检测调节性T细胞,调节性B细胞,CD4-CD8+T细胞和CD8-CD4+T细胞等水平变化;经眼球取血,ELISA分析外周血清中自身抗体滴度;取肾脏,4%甲醛固定后苏木精-伊红染色分析肾脏病理改善状况。6.为了探讨狼疮小鼠胸腺B细胞对T细胞分化的影响,胞膜染色标记后流式分选胸腺B细胞,经尾静脉回输给野生型小鼠,一周后处死小鼠,流式检测ISP细胞,CD4-CD8+和CD8-CD4+T细胞等变化情况。7.为了研究m TOR缺失对胸腺B细胞和ISP细胞的影响,应用流式细胞术检测m TOR+/-小鼠胸腺B细胞、不成熟CD8+T细胞(ISP,表型为CD3lo/-CD4-CD8+)比例和数目的变化。结果:1.在小鼠胸腺中检测到一定比例的B细胞,B细胞占胸腺细胞0.1%;经Ficoll分离胸腺淋巴细胞后,B220+细胞比例提高到13.35%,CD19+细胞比例提高到4.7%,并对B细胞表型做了进一步分析。在胸腺细胞中存在IL-10+B细胞和Ig G+B细胞。2.在正常小鼠胸腺中存在一群表达IL-10的调节性B细胞(表型为CD19+CD5+CD1dhi);在IL-10-GFP报告基因小鼠中也发现存在

关键词： 细粒棘球蚴感染   Breg   IL-10   TGF-β1  

摘要： 目的:研究调节性B细胞及相关分子表达水平在细粒棘球蚴持续性感染小鼠过程中的表型改变、变化特点的相关性,探讨其在细粒棘球蚴感染中的免疫作用及与细粒棘球蚴感染发生发展的关系。方法:将96只雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,实验组通过腹腔门静脉接种原头蚴悬液制备细粒棘球蚴感染小鼠模型,对照组腹腔注射等量生理盐水。分别在接种2天、8天、30天、90天、180天和270天收集标本。通过流式细胞术检测小鼠脾脏中调节性B细胞CD1dCD5CD19细胞和CD1dCD5CD19IL-10细胞比例;通过ELISA法检测小鼠血清IL-10和TGF-β1的水平;HE染色观察小鼠肝脏的病理学改变;用免疫组织化学法检测IL-10和TGF-β1在肝脏的表达及分布;通过实时荧光定量RT-PCR检测小鼠脾脏淋巴细胞IL-10和TGF-β1 mRNA的表达水平。结果:1)流式细胞术检测结果显示与对照组相比,小鼠脾脏CD1dCD5CD19细胞和CD1dCD5CD19IL-10细胞比例在感染后90天、180天和270天显著性升高(P<0.05)。2)实时荧光定量RT-PCR结果显示与对照组相比,在感染早期IL-10和TGF-β1 mRNA均低水平表达,感染后90天IL-10 mRNA的表达显著增加(P<0.05),TGF-β1 mRNA在感染后30天表达显著升高(P<0.05),随后均保持较高的水平(P<0.05)。3)HE染色观察结果显示,肝细胞中出现水肿,出现胆管增生,肝脏结构破坏,分不清小叶结构,肝细胞空泡样变性,感染晚期可见淋巴细胞浸润。4)免疫组织化学法结果显示肝脏在细粒棘球蚴感染过程中,IL-10和TGF-β1在肝脏的主要表达部位由早期的肝窦区少量肝细胞胞浆转移至纤维囊壁和病灶处的生发层周围。感染早期,IL-10和TGF-β1均不表达或低水平表达;感染中晚期,随着小鼠体内及肝脏细粒棘球蚴的不断增大增多,IL-10和TGF-β1的表达均显著升高(P<0.05)。5)ELISA检测结果显示与对照组相比,感染早期小鼠血清IL-10和TGF-β1水平显无明显改变;感染中、晚期小鼠血清IL-10和TGF-β1水平均显著升高(P<0.05)。结论:CD1dCD5CD19调节性B细胞可能是导致细粒棘球蚴感染免疫抑制的原因之一。在细粒棘球蚴感染的早期,小鼠脾脏CD1dCD5CD19调节性B细胞和CD1dCD5CD19IL-10调节性B细胞增加不明显,感染晚期,两种细胞均显著增高,提示调节性B细胞参与了细粒棘球蚴感染的发生发展。细粒棘球蚴感染中,IL-10和TGF-β1表达随体内细粒棘球蚴组织的不断增多增大持续升高,推测Breg发挥抑制作用可能通过调节细胞因子的表达并诱导分泌抑制性细胞因子IL-10和TGF-β1发挥抑制作用。

关键词： 动脉粥样硬化   调节性T细胞   Th17细胞   HMGB-1蛋白   炎症反应   致病机理  

摘要： 目的：将动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)患者和健康人作为研究对象，检测两种健康状况的外周血中促炎性细胞因子和抑炎性细胞因子含量的变化，以及研究对象中调节性T细胞和Th17细胞含量的变化，研究在动脉粥样硬化发生发展过程中高迁移率族蛋白-1（high mobility group box1 protein,HMGB-1）和Th17/Treg的平衡与AS形成的相互关系，探讨AS的致病因素，寻找可能存在的治疗靶点，并为防治动脉粥样硬化以及动脉粥样硬化所致的并发症提供实验基础和理论依据。　　方法：实验设立对照组和AS组，检测健康人和动脉粥样硬化患者外周血中高迁移率族蛋白-1(HMGB-1)和调节性T细胞（T regulatory cell,Treg）以及Th17细胞之间的含量变化，(1)采用 Ficoll密度梯度离心法分别将动脉粥样硬化患者和健康人外周血分离得到人外周血单个核细胞（PBMCs）。(2)将分离出的单个核细胞采用磁珠分选法分选出调节性T细胞（Tregs）。(3)用流式细胞术检测磁珠分选所得CD4+T细胞和调节性 T细胞的纯度。(4)将不同浓度的 HMGB-1和 Treg细胞共培养，研究HMGB-1对Treg细胞的体外诱导分化，检测封闭TLR4受体和不封闭TLR4受体时培养上清液中细胞因子TGF-β1、IL-10含量的变化。(5)用酶联免疫吸附试验法分别检测动脉粥样硬化患者和健康人血清中的细胞因子TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-23和HMGB-1的含量。（6）用SPSS18.0软件进行统计学分析。所得数据以x±s表示，两组之间的均数比较用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。　　结果：　　(1)AS患者外周血中的HMGB-1的含量比健康人外周血中的含量明显增高。　　(2)AS组外周血中的TGF-β1和IL-10含量比对照组明显降低。　　(3)AS组外周血中IL-6、IL-17A、IL-23的含量较对照组明显增高。　　(4)随着HMGB-1的浓度逐渐增加，封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌IL-10的功能增强，随着HMGB-1刺激的浓度逐渐增加，未封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌IL-10的功能反而减弱。　　(5)随着HMGB-1的浓度逐渐增加，封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌抑炎性细胞因子TGF-β1的功能增强，而未封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌TGF-β1的功能减弱。　　结论：动脉粥样硬化患者外周血中促炎性细胞因子和抑炎性细胞因子与健康人的水平存在较大的差异，本研究通过体外不同浓度的HMGB-1与CD4+T细胞共培养时，未封闭和封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌TGF-β1、IL-10的功能是不同的，随着的HMGB1刺激浓度增加，未封闭TLR4受体的CD4+T细胞的分泌功能减弱，而封闭TLR4受体的CD4+T细胞分泌功能增强。AS患者外周血中HMGB-1、TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-23的含量与健康人之间差异较大，促炎性细胞因子水平明显升高，抑炎性细胞因子 IL-10、TGF-β1水平降低，使炎症反应增强，促进了动脉粥样硬化的发展。

关键词： 关节炎   类风湿   调节性B细胞   CD19+CD24hiCD38hi   CD19+CD24hiCD27+  

摘要： 目的:检测类风湿关节炎（RA）患者外周血CD19+CD24hiCD38hi、CD19+CD24hiCD27+调节性B细胞（Bregs）占CD19+B细胞的百分率,探讨外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs频率与RA临床指标的相关性,明确治疗前后CD19+CD24hiCD38hiBregs的变化情况。方法:以CD19+CD24hiCD38hi作为Bregs标记,流式细胞仪三色荧光抗体标记法检测95例RA患者和40例健康对照者（HC）外周血CD24hiCD38hi细胞占CD19+B淋巴细胞的百分率,观察不同严重程度患者的CD19+CD24hiCD38hiBregs比例变化趋势,并研究其与RA患者疾病活动度指标（DAS28评分）、血沉（ESR）、超敏C反应蛋白（hc CRP）、类风湿因子（RF）、晨僵时间、视觉模拟评分（VAS评分）、关节肿胀数、关节压痛数以及其他相关性指标如年龄、病程、关节功能分级、日常生活能力（HAQ）评分等之间的相关性。随访其中25例RA患者,对比治疗6个月后较基线时外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs的变化情况。另选57例RA患者和21例健康对照者,以CD19+CD24hiCD27+作为Bregs标记,通过流式细胞仪三色荧光抗体标记法检测外周血CD24hiCD27+细胞占CD19+B淋巴细胞的比例,结合临床资料进行相关性分析。结果:RA组CD24hiCD38hi细胞占CD19+B淋巴细胞的比例（6.48±4.98）%低于HC组（7.23±3.40）%,但两组间差异未达到统计学意义（p＞0.05）。其中DAS28＜3.2组（n=19）、3.2≤DAS28≤5.1组（n=45）、DAS28＞5.1组（n=31）CD24hiCD38hi细胞占CD19+B细胞的比例分别为（6.09±4.35）%、（6.15±5.28）%、（7.16±4.94）%,CD19+CD24hiCD38hiBregs的平均数量随疾病活动度的增高而增加。相关性分析发现RA患者CD19+CD24hiCD38hiBregs比例与晨僵时间呈正相关（r=0.227,p=0.027）,与年龄、抗CCP抗体滴度水平均呈负相关（r=-0.234,p=0.022;r=-0.218,p=0.036）。外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs的变化与治疗情况明显相关。病情无改善者（持续中重度活动,n=12）Bregs细胞数量增加,病情缓解者（由中重度活动到轻度活动或完全临床缓解,n=8）Bregs细胞数量下降,病情稳定者（持续处于轻度活动或病情完全缓解,n=5）Bregs细胞数量下降。RA组CD24hiCD27+细胞占CD19+B淋巴细胞的比例（12.36±7.08）%高于HC组（7.67±3.54）%,两组差异无统计学意义（p＞0.05）。RA组中DAS28＜3.2组（n=25）和DAS28≥3.2组（n=32）间外周血CD24hiCD27+B细胞占CD19+B淋巴细胞的百分比分别为（9.07±6.27）%和（7.67±3.54）%,两组间差异无统计学意义（p＞0.05）。相关性分析发现RA患者CD19+CD24hiCD27+Bregs比例与年龄、病程、ESR、hs CRP、RF、抗CCP抗体、DAS28评分等均无相关性。结论:RA组外周血CD24hiCD38hiB细胞、CD24hiCD27+B细胞占CD19+B淋巴细胞的百分率与对照组间比例的差异情况未达到统计学差异,在RA患者中CD19+CD24hiCD38hiBregs随着病情活动性升高其数量反应性增加,随着治疗好转其数量随之降低,提示CD19+CD24hiCD38hiBregs在RA的发病及炎症活动中可能起一定作用。

关键词： 类风湿性关节炎   调节性B细胞   免疫反应   生物学功能  

摘要： 目的:<br>　　调节性B细胞(regulatory B cells，Bregs)是近年来发现的一类B细胞亚群，能分泌各种细胞因子，它们有利于自身免疫疾病中免疫耐受的维护，并且能抑制过量的炎症反应。本研究主要测定不同疾病活动度类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)病人外周血循环的两种调节性B细胞亚型，以及血清中相关细胞因子水平，通过分析它们与RA疾病活动度的相关性，来探索调节性B细胞在RA疾病中发挥的作用，进一步理解它们的生物学功能，也为RA疾病寻找可行的药物治疗靶点。<br>　　方法:<br>　　1.浙江省台州医院伦理委员会支持该项研究，所有病人均签知情同意书。根据1987年美国风湿病学院标准收集到59例不同疾病活动度的RA患者，同时收集到25例健康个体参与该研究。每个RA患者疾病活动度均根据28个关节疾病活动度得分来评价。并且，记录每个病人的临床实验室标志物，包括血沉(ESR)，类风湿因子(RF)，所有病人均排除肝，肾疾病和其它炎症或者自身免疫疾病。同时记录健康个体有关实验室指标。根据疾病活动度将病人分为三组，低活动度组(low activity，LA)，(DAS＜3.2)，中活动组(moderateactivity，MA)(3.2＜DAS＜5.1)，高活动度组(high activity，HA)(DAS＞5.1)。<br>　　2.所有参与者均采集5ml肝素抗凝静脉血。分离血清-80℃保存。全血细胞分类计数和ESR通过血常规分析仪(Alifax TEST I)检测，超敏C反应蛋白(hs-CRP)和RF用生化分析仪(IMMAGE800)测定。<br>　　3.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测所有参与者血清白介素10(IL-10)，白介素21(IL-21)，颗粒酶B(Granzyme B，GzmB)浓度。比较RA患者与正常对照之间的差异，并分析与RA患者Bregs细胞，及疾病活动度DAS28之间的关系。<br>　　4.利用流式细胞术检测所有参与者外周血中调节性B细胞CD19+CD5+CD1dhi和CD19+CD5+GzmB+细胞的比例，探讨分析二者与RA疾病活动度的关系。分析与分泌的相关细胞因子之间的关系。<br>　　5.实验数据采用SPSS统计软件进行分析（17.0版），数据用均值(mean)与标准误(standard error，SE)来描述，统计比较采用Mann-Whitney U-tests，两组之间相关性分析利用Spearman相关法，P＜0.05为差异具有统计学意义。<br>　　结果:<br>　　1.为了评价RA患者外周血细胞因子微环境，我们测定了RA患者和正常对照组血清IL-10，IL-21，GzmB水平。与正常对照相比较，RA患者血清中IL-10和IL-21的浓度是降低的，（IL-10:4.632±0.380 pg/mL vs.3.563±0.205pg/mL, P=0.0094; IL-21:398.5±25.28 pg/mL vs.320.9±14.61 pg/mL,P=0.0076)，然而GzmB水平与对照组相比没有不同（P=0.4772）。<br>　　***患者细胞数量降低并且与RA疾病活动度负相关。我们观察到与健康对照组(healthy control，HC)(4.208±0.468％)相比，CD19+CD5+CD1dhi细胞的百分比在HA组(2.742±0.432％)和MA组(3.306±0.418％)是升高的，<br>　　(PHA=0.0038，PHA=0.0409)。然而，三组RA没有差异（P＞0.05）。我们分析了CD19+CD5+CD1dhi细胞数量和RA患者临床特征指标间的相关性，CD19+CD5+CD1dhi细胞数量与DAS28显著负相关（r=-0.396，P=0.005），另外，CD19+CD5+CD1dhi细胞与血清IL-10，ESR，CRP，RF水平无统计学相关性（P＞0.05）<br>　　***患者外周血中CD19+CD5+GzmB+细胞数量升高。我们检测了RA患者组和对照组CD19+CD5+B细胞亚群GzmB的表达，与CD19+CD5+CD1dhi细胞相反，我们观察到CD19+CD5+GzmB+细胞百分比升高，（LA:2.467±0.418％，P=0.0328;MA:2.200±0.232％,P=0.0352; HA:2.114±0.212％,P=0.0446; HC:1.632±0.191％)。

关键词： 溃疡性结肠炎   流式细胞术   B10细胞   ICOS阳性调节性T细胞  

摘要： 目的 观察溃疡性结肠炎(UC)患者外周血中B10细胞与ICOS阳性调节性T细胞(ICOS+ Treg)比例及相关细胞因子的变化,探讨其在UC发病机制中的作用.方法 选择30例UC患者和30例健康体检者(对照组),收集外周静脉血,采用流式细胞术(FCM)检测B10(CD5+CD19+CD1d)细胞、Treg(Foxp3+ CD4+ CD25+ T)、ICOS+ Treg、ICOS-Treg细胞的数量及ICOS+ Treg/ICOS-Treg比值,用FCM测定外周血单核细胞(PBMC)培养后分泌的内因子IL-10、TGF-β、IL-17水平.结果 UC活动期患者PBMC中B10细胞、ICOS+ Treg细胞与ICOS+ Treg/ICOS-Treg比值均低于对照组[(0.74±0.29)％与(1.64±0.57)％,P ＜0.05;(1.44 ±0.49)％与(3.62±1.7)％,P＜0.05;(0.14±0.06)％与(0.58±0.15)％,P＜0.01];ICOS-Treg与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),B10细胞的数量和ICOS+ Treg/ICOS-Treg比值与疾病程度呈负相关;活动期患者PBMC分泌因子IL-10、TGF-β下降,而IL-17水平升高.结论 B10细胞与ICOS+ Treg/ICOSTreg比值及相关细胞因子的变化可能参与UC患者的免疫学发病机制.

关键词： 妊娠   调节性B细胞   白介素10   免疫调控  

摘要： 背景调节性B细胞是近年来发现的一种新的B细胞亚群,主要通过产生白介素(interleukin,IL)-10和转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)负性调控炎症免疫相关疾病的病理过程。妊娠免疫耐受的建立是一个极其复杂而又协调的过程。国内外学者对妊娠免疫耐受的机理做了深入的探索,绝大多数认为机体主要通过调节着床局部免疫功能,诱导产生免疫耐受,接受胎儿的植人并维持妊娠。本实验在前期发现妊娠期外周血血浆IL-10增高的基础上,进一步通过采用酶联免疫法(ELISA)、实时荧光定量PCR和流式细胞术等技术检测产生IL-10的调节性B细胞在不同妊娠周期的变化。探索妊娠耐受建立的分子机制,为流产、胎儿宫内发育迟缓、妊娠高血压综合症等诸多妊娠疾病发病机理的研究和筛选有效的治疗药物提供理论依据。同时也可为减轻同种异体器官的移植排斥反应并诱导免疫耐受开辟一条新路。目的检测产生IL-10的调节性B细胞在不同妊娠周期和健康未孕者体内的变化,探讨该B细胞亚群可能在妊娠免疫耐受的调控作用。方法1.研究对象：按照全国统编人卫版教材《妇产科学》第8版标准,选择驻马店市中心医院妇产科不同妊娠期妇女作为研究对象,根据妊娠周期不同分为妊娠早、中、晚三组。采用同时期体检科健康未孕妇女作为对照。2.样本收集和处理：收集不同妊娠期妇女和健康未孕妇女空腹血样10ml,以肝素锂抗凝,分离血浆冻存,并采用Ficol分离法分离外周血单个核细胞,备用。3.血浆IL-10水平的检测：采用人IL-10 ELISA检测试剂盒,检测血浆IL-10含量。4. IL-10 mRNA的检测：提取不同妊娠期妇女和健康未孕妇女外周血单个核细胞总RNA,经逆转录后,采用实时荧光定量PCR检测IL-10mRNA的表达情况。5.调节性B细胞及其亚群检测：分离同妊娠期妇女和健康未孕妇女外周血单个核细胞,采用多色荧光抗体结合流式细胞术检测并分析样本中产生IL-10的调节性B细胞及其亚群的分布情况,并结合其他检测指标分析其意义。6.统计学方法：计量数据以均数加减标准差(x±s)表示,两组间差异比较采用t检验,各组数据阳性率比较采用卡方检验。检验水准a=0.05,P<0.05为差异有统计学意。结果1.标本分组情况：妊娠早期妇女(<13周)20例,妊娠中期妇女(14周-27周末)20例,妊娠晚期妇女(>28周)20例,健康未孕妇女20例,共计80例样本。2.酶联免疫法ELISA检测结果：妊娠期妇女血浆IL-10含量明显高于未受孕女,妊娠早、中期IL-10含量分别为(326.85±33.91) pg/ml和(213.76±66.10) pg/ml,明显高于未受孕妇女(99.10±23.22) pg/ml,经t检验显示有显著统计学差异。3.荧光定量PCR检测结果：妊娠早期IL-10相对表达最高达(3712.00±123.00)倍数,随着妊娠周期的延长,IL-10mRNA的表达下降。4.流式细胞术结果：妊娠早、中期CD19+IL-10+B细胞百分比分别为(14.30±2.12)%和(7.53±1.11)%,明显高于非妊娠妇女百分比,经过卡方检验结果有统计学差异,且发现该群细胞高表达CD24和CD38,而非CDld和CD5。结论***-10mRNA及其蛋白在妊娠期均高表达,特别是在妊娠早、中期,说明妊娠期机体高表达IL-10从而负性调节妊娠期免疫、参与妊娠免疫耐受的建立。2. CD19+CD24+CD38+IL-10+B细胞可能参与妊娠期免疫耐受的调控。