关键词： 髓系抑制性细胞   调节性B细胞   调控作用   免疫应答  

摘要： 髓系抑制性细胞(MDSC)是一群具有很强免疫抑制功能的细胞，在肿瘤和炎症等疾病的进展和转归过程中起着重要调节作用。但以往的研究主要集中于它们对T细胞和NK等细胞免疫应答的调控作用。它们对于B细胞的功能调控作用还不是十分清楚，尤其是对于调节性B细胞的分化调控作用目前尚未见报道。因此，本研究主要围绕MDSC对调节性B细胞的分化调控及相关的机制进行了探讨。<br>　　第一部分:MDSC诱导高分泌IL-10的B细胞产生<br>　　为了探讨MDSC能否诱导调节性B细胞的分化，我们将小鼠MDSC与不同刺激剂活化的B细胞（anti-IgM、可溶性CD40L、LPS）共培养，检测共培养后上清中IL-10的表达水平。结果发现，经LPS刺激后的B细胞与MDSC共培养后其上清中IL-10的分泌水平明显增高。接着我们通过胞内染色的方法分别检测了共培养前后B细胞及MDSC胞内IL-10表达水平的变化，结果发现共培养之后B细胞胞内IL-10的表达水平明显增高，而MDSC共培养前后IL-10的表达没有明显变化。随后我们将共培养体系中的MDSC与B细胞通过流式分选出来，分别提取其总RNA，利用qRT-PCR的方法检测其IL-10的表达，结果发现，共培养体系中的IL-10主要来源于B细胞。进一步的检测发现该群高分泌IL-10的B细胞表达独特表型即CD19hiFcγRⅡbhi。此外，我们通过流式分选出不同亚群的MDSC(粒系及单核系MDSC)，将其分别与LPS活化B细胞共培养，发现不论是粒系MDSC还是单核系MDSC均能诱导LPS活化B细胞高分泌IL-10。另外，我们分选出脾脏不同亚群的B细胞，经LPS活化后分别与MDSC共培养，结果发现，经MDSC诱导后，T1，T2，T3及MZB细胞均能够高分泌IL-10。在体内实验中，我们将CFSE标记的LPS活化B细胞，单独或与MDSC共同尾静脉注射小鼠，取小鼠脾脏，流式胞内染色法检测CFSE+B细胞分泌IL-10的情况，发现在与MDSC共注射的情况下，B细胞分泌IL-10的水平增强。以上结果说明:MDSC能够诱导高分泌IL-10的CD19hiFcγRⅡbhiB细胞产生。<br>　　第二部分:MDSC的CD19hiFcγRⅡbhi调节性B细胞的功能及其机制研究<br>　　为了研究MDSC诱导产生的高分泌IL-10的具有CD19hiFcγRⅡbhi表型的B细胞对T细胞是否具有调节功能，我们先通过流式将MDSC与B细胞共培养体系中CD19hiFcγRⅡbhi及CD19lowFcγRⅡblowB细胞分选出来，分别与带有CFSE标记且经抗CD3/CD28活化的CD4+T细胞共培养，3天以后检测T细胞增殖情况。结果发现CD19hiFcγRⅡbhiB细胞能够明显抑制活化的CD4+T细胞增殖，且在共培养体系中加入IL-10的中和性抗体后，CD4+T细胞可恢复增殖，这一结果提示CD19hiFcγRⅡbhiB细胞可以通过其分泌的IL-10抑制活化T细胞增殖。另外，我们检测了CD19hiFcγRⅡbhiB细胞和CD19lowFcγRⅡblowB细胞对活化CD4+T细胞表面CD69分子表达的影响，结果发现CD19hiFcγRⅡbhiB和CD19lowFcγRⅡblowB细胞对CD69的表达均没有明显影响，以上结果提示CD19hiFcγRⅡbhiB细胞并非通过抑制T细胞活化，而是通过抑制已活化T细胞的增殖发挥调节作用。此外，我们还检测了CD19hiFcγRⅡbhiB细胞和CD19lowFcγRⅡblowB细胞对活化CD4+T细胞分泌IL-4及IFN-γ的影响，结果发现（数据未显示），CD19hiFcγRⅡbhiB和CD19lowFCγRⅡblowB细胞不能影响CD4+T细胞向Th1及Th2方向的分化。<br>　　在对机制的研究上，首先我们利用transwell系统将MDSC与B细胞隔离，共培养48h后检测上清中IL-10的分泌情况，结果发现，MDSC诱导B细胞产生IL-10。此外，将MDSC培养上清与LPS活化B细胞共培养后，与单独的LPS活化B细胞相比，IL-10的水平也没有明显变化。我们探索了MDSC上哪些膜分子参与诱导了调节性B细胞高分泌IL-10。已有研究表明:CD40L-CD40通路在调节性B细胞的分化中起到着重要作用。通过流式检测我们发现， MDSC表面表达CD40L分子，B细胞表面表达CD40分子，且B细胞经LPS活化后其表面CD40的表达量增加，另外，在B细胞中加入可溶性CD40L可使其上清中IL-10的表达水平增高。下一步我们将用CD40-/-小鼠的B细胞与CD40L-/-小鼠的MDSC共培养，检测上清及胞内IL-10的分泌情况，从而明确CD40L-CD40通路在MDS

关键词： 肝移植   西罗莫司   调节性B细胞   调节性T细胞   免疫功能  

摘要： 目的:1.筛选影响肝移植受者术后外周血淋巴细胞亚群的临床因素，并探讨相应临床因素下免疫抑制剂的调整策略。2.通过体内及体外实验深入研究西罗莫司提高肝移植术后患者外周血中调节性B细胞(regulatory B cell，Breg)和调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)比值的作用。3.通过采用对人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）培养的方式深入研究Breg在西罗莫司扩增Treg中的协同作用。<br>　　方法:实验一:应用流式细胞技术调查临床肝移植术后患者外周血淋巴细胞亚群状态，通过回归分析筛查影响淋巴细胞亚群的相关临床因素，探讨根据相关临床因素制定个性化免疫抑制方案的可行性。实验二:通过流式细胞技术检测肝移植术后将他克莫司部分转换为西罗莫司抗排异的患者药物转换前后外周血Breg和Treg的变化，并与同时期未应用西罗莫司的患者进行对比，明确西罗莫司对患者外周血Breg和Treg的扩增作用。实验三:采用西罗莫司体外刺激人PBMCs的方法，进一步证实西罗莫司对Breg和Treg的扩增作用，同时通过西罗莫司对剔除B细胞的PBMCs刺激的结果，以及加入细胞因子TGF-β1和IL-10后西罗莫司对剔除B细胞的PBMCs刺激结果，试图证实Breg在西罗莫司刺激Treg增殖的过程中起协同作用。<br>　　结果:1.既往曾发生排斥反应、脾脏机能亢进和术后应用西罗莫司是导致肝移植术后受者外周血中部分淋巴细胞亚群存在差异的三个主要临床因素。既往曾出现排斥反应的患者外周血中CD8+T细胞百分比高于未曾发生排斥反应的患者(P＜0.01)，而Breg百分比低于未发生排斥反应患者(P＜0.05);脾脏机能亢进可以提高Breg和Treg的百分比（P＜0.01和P＜0.01），而减少CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞和NK细胞的绝对值（P＜0.01， P＜0.01， P＜0.01，和P＜0.01）;术后应用西罗莫司可以提高Breg和Treg的百分比（P＜0.01和P＜0.01），同时还可以提高Breg和Treg的绝对值（P＜0.05和P＜0.05）。2.肝移植患者术后将他克莫司部分转换为西罗莫司抗排异治疗后第7天，外周血Breg和Treg比值明显升高（P＜0.05和P＜0.05），转换后第30天升高更为明显（P＜0.01和P＜0.01）;与同时期未应用西罗莫司的患者比较，转换后第7天，Treg比值明显高于对照组(P＜0.05)，转换后第30天，Breg和Treg比值均高于对照组（P＜0.05和P＜0.01）。3.西罗莫司可以在体外PBMCs培养中使TGF-β1+ Breg和IL-10+ Breg占B细胞的比值以及Treg占T细胞的比值增高，同时可以刺激Breg相关的细胞因子TGF-β1和IL-10的分泌;在剔除B细胞后，西罗莫司对Treg的扩增作用和对细胞因子的刺激作用均减弱;而在剔除B细胞的PBMCs中加入适量TGF-β1和IL-10后，西罗莫司对Treg的扩增作用得以恢复。<br>　　结论:1.肝移植术后既往曾出现排斥反应、脾脏机能亢进和术后应用西罗莫司是引起部分淋巴细胞亚群差异的主要因素，脾机能亢进患者可以适当减低免疫抑制剂用量，既往曾经出现排斥反应患者需适当增加免疫抑制剂用量。2.肝移植术后将他克莫司部分转换为西罗莫司抗排异治疗可以明显增加患者外周血Breg和Treg的比值。3.西罗莫司与健康受试者外周血PBMCs体外共培养亦可以明显扩增Breg和Treg，Breg可能在西罗莫司扩增Treg过程中起协同作用。

关键词： 红斑狼疮,系统性   B淋巴细胞   T淋巴细胞   白细胞介素35  

摘要： 目的检测系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血白细胞介素35+调节性B细胞(IL-35+Bregs)的表达,并探讨其在SLE发病机制中的作用。方法以2015年1月至2016年1月就诊于本院风湿免疫科的SLE患者50例为研究对象,按SLE活动指数(SLEDAI)分为活动期SLE组(n=30)和稳定期SLE组(n=20)以同期健康志愿者20例作为正常对照组。分离外周血单个核细胞(PBMC)进行培养,流式细胞术检测各组外周血IL*35+CD19+Bregs和CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞(Tregs)表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清液IL*35水平。结果流式细胞术检测显示,活动期SLE组、稳定期SLE组和正常对照组外周血IL*35+CD19+Bregs表达分别为(1.43±0.67)%、(2.27±0.68)%、(4.24±1.1 1)%,组间两两比较差异均具有统计学意义(均P<0.01);活动期SLE组、稳定期SLE组和正常对照组外周血CD4+CD25+FOXP3+Tregs表达分别为(2.26±0.49)%、(3.82±0.94)%、(5.77±1.09)%,组间两两比较差异均具有统计学意义(均P<0.01)。活动期SLE组、稳定期SLE组外周血IL*35+CD19+Bregs和CD4+CD25+FOXP3+Tregs表达均低于正常对照组,且活动期SLE组均低于稳定期SLE组。活动期SLE组、稳定期SLE组和正常对照组细胞培养上清液IL-35水平分别为(5.48±1.68)pg/ml、(7.74±1.26)pg/ml、(11.96±1.67)pg/ml,组间两两比较差异均具有统计学意义(均P<0.01)活动期SLE组细胞培养上清液IL-35水平低于稳定期SLE组和正常对照组。SLE患者外周血IL*35+CD19+Bregs表达与CD4+CD25+FOXP3+Tregs表达呈正相关(r=0.813,P<0.01),SLE患者外周血IL*35+CD19+Bregs表达、CD4+CD25+FOXP3+Tregs表达与细胞培养上清液IL-35水平均呈正相关(r=0.862、0.811,均P<0.01)。结论 IL*35+Bregs可能通过分泌IL*35参与了SLE的发病。

关键词： 过敏性紫癜   调节性B细胞   免疫平衡   细胞病理学  

摘要： 本文对CD40/CD40L信号通路调控调节性B细胞在HSP和HSPN中的作用机制进行了研究。本研究分为两个部分：　　第一部分：调节性B细胞对HSP和HSPN患儿Th17/Treg免疫平衡的影响。过敏性紫癜（HSP）是儿童时期最常见的自身免疫性血管炎，并发肾脏损害时称为紫癜性肾炎（HSPN）。大量研究显示CD4+T细胞亚群（Th1，Th2，Th17和Treg）功能紊乱参与儿童HSP的发生发展，包括 Th1/Th2的免疫失衡和 Th17/Treg的免疫失衡。同时，有研究指出Th17/Treg的免疫失衡与HSPN肾脏损害的严重程度密切相关。而目前尚无研究中心就不同肾脏累及程度的 HSPN患儿进行分组详细讨论Th17、Treg细胞比例及 Th17/Treg比值在其中的具体变化。调节性 B细胞作为一群能通过分泌IL-10调控CD4+T细胞免疫反应的负向调节性免疫细胞，参与影响Th17/Treg的免疫平衡，在多种自身免疫性疾病中得到了普遍研究，如系统性红斑狼疮（SLE），风湿性关节炎（RA），炎症性肠病（IBD）等，但是其在儿童 HSP及 HSPN中是否能影响Th17/Treg的免疫平衡，进而在 HSP的发生和HSPN肾脏损害及预后中发挥作用，目前尚不清楚。因此本研究通过检测HSP及HSPN患儿外周血Th17、Treg细胞的比例和Th17/Treg比值的变化，调节性B细胞及其两个亚群(CD19+CD24hiCD38hiB细胞和CD19+CD24hiCD27+B细胞)在其中的比例变化及其与Th17、Treg和Th17/Treg的相关性分析，初步探索调节性B细胞对Th17/Treg免疫平衡的影响。　　目的：探讨调节性B细胞水平、功能异常可能通过影响Th17/Treg免疫平衡在HSP和HSPN的发生发展及转归中发挥作用。　　方法：选取确诊的HSP及HSPN患儿76例，根据肾脏累及情况分为以下几组：无肾脏累及组20例（Group A），单纯镜下血尿组12例（Group B），单纯少量蛋白尿组17例（Group C），血尿合并少量蛋白尿组15例（Group D），大量蛋白尿组12例（Group E）;HSP/HSPN缓解期患儿（皮疹、腹痛、关节痛、血尿、蛋白尿等症状消失）16例（Group F），健康对照者16例（Control）。采用流式细胞术检测外周血中CD19+CD24hiCD38hiB细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞，Th17细胞和Treg细胞的百分比，以及CD19+B细胞、CD19+CD24hiCD38hiB细胞和CD19+CD24hiCD27+B细胞IL-10的表达水平;同时对B10细胞及其两个亚群与Th17细胞、Treg细胞和Th17/Treg的比值进行相关性分析。　　结果：与Control组相比，Group A, B, C, D, E组中Th17细胞的比例明显升高（P<0.05）;Treg细胞的比例明显降低（P<0.05）;Th17/Treg的比值明显升高（P<0.05）;Group B, C, D, E中CD19+CD24hiCD38hiB细胞的比例和B10细胞、CD19+CD24hiCD38hiB、CD19+CD24hiCD27+B细胞分泌 IL-10的水平显著降低（ P<0.05）;Group D， E中CD19+CD24hiCD27+B细胞的比例显著降低（P<0.05）。与Group A相比， Group D, E中Th17细胞的比例、Th17/Treg的比值明显升高（P<0.05）;B10、CD19+CD24hiCD38hiB细胞的比例及分泌 IL-10的水平明显降低（P<0.05）;GroupE中Treg细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞及其IL-10的分泌水平显著降低（P<0.05）。Group F组中上述指标与 Control和Group A相比均无明显统计学差异（P>0.05）。B10、CD19+CD24hiCD38hiB和CD19+CD24hiCD27+B细胞与Th17细胞以及Th17/Treg的比值呈显著负相关（ P<0.05）， B10和 CD19+CD24hiCD38hiB细胞与CD4+CD25+Treg细胞呈显著正相关（P<0.05）。　　结论：B10细胞及其两个亚群水平及功能异常（分泌IL-10的能力降低）可能参与HSP/HSPN的Th17/Treg免疫失衡。　　第二部分：CD40/CD40L信号通路-调节性B细胞-Th17/Treg轴参与HSP和HSPN发生发展及转归。除了细胞免疫功能紊乱，大量研究表明HSP患儿体内也存在体液免疫功能紊乱，表现为血浆中IgA水平明显增高和血管壁IgA循环免疫复合物的沉积。而 CD40-CD40L，作为特异性免疫系统中重要的一对共刺激分子，其在诱导

关键词： 胶质瘤   外泌体   调节性B细胞   TGF-β   免疫逃避  

摘要： 侵袭和转移是恶性肿瘤的重要生物学标志,也是导致肿瘤治疗失败和复发的重要原因之一。高度侵袭性是恶性胶质瘤的重要病理学特征,瘤体边界不清致使手术完整切除难度增大,从而导致肿瘤很快复发,这是患者预后差,复发率、死亡率高的主要原因。脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,国内脑胶质瘤的发生率占颅内肿瘤的35%0%,5年生存率仅为20%0%,是神经外科临床工作中面临的最严重的肿瘤之一。对脑胶质瘤的治疗措施,传统上仍然以手术为最重要的手段,但由于胶质瘤多为浸润型生长,单纯的手术治疗后,很容易复发,疗效并不能使人满意。由于肿瘤细胞存在放疗抗拒,术后放疗尚不能杀灭残余的肿瘤细胞,因此研究肿瘤细胞是通过怎样的机制逃避放疗的杀伤和如何降低此种机制的作用,对提高放疗在胶质瘤治疗中的疗效有很大的必要性。肿瘤细胞的免疫逃避是指其通过多种方式逃避机体的免疫识别和攻击,例如:细胞表面标志物的改变,包括肿瘤细胞表面的MHCⅠ类分子表达下降或者缺失、肿瘤抗原的变异、FAS系统的作用、B7分子的表达异常等。肿瘤来源的免疫抑制因子:如IL-10、VEGF、TGF-β等,其可以影响DC细胞及T细胞的成熟活化。肿瘤微环境诱导T细胞功能障碍,其中主要是通过受体/配体结合的方式释放抑制性的信号,降低T细胞的功能。T细胞功能的障碍,会导致机体免疫减弱。PIGF在癌变的情况下会引起高表达,同时它的相关受体VEGFR1的表达也会提高。PIGF在多种肿瘤中明显上升,可以作为某些癌症的指标性物质。PIGF不仅可以刺激血管源细胞形成新血管,而且PIGF可以直接作用于肿瘤细胞,损伤DC细胞,从而促进肿瘤的生长,也可以刺激骨髓中血管生成祖细胞转移向肿瘤病灶。加入PIGF抗体在体内不仅可以阻止新血管的生成,还可以刺激已生成血管的退化。最近研究报道显示PlGF也参与了神经胶质瘤的病理和免疫调节过程。我们假设胶质瘤分泌的PlGF通过外泌体作用于胶质瘤病灶微环境中的B细胞,使B细胞能够表达TGF-β,转化为TGF-β(+)的Bregs细胞,Bregs细胞可以特异性的抑制胶质瘤患者CD8(+)T细胞的增殖和活性,从而胶质瘤细胞逃避免疫监视向正常组织侵袭扩散。通过本研究证明:1从胶质瘤组织中分离纯化的恶性胶质瘤细胞(whoⅢ级)在体外培养后,细胞内plgfmrna和蛋白有表达,当用不同浓度的pma刺激后plgf随其浓度增加而增加。表明恶性胶质瘤细胞中有plgf表达。2密度梯度离心分离胶质瘤细胞上清中的外泌体,lamp-1特异性验证外泌体后,裂解外泌体后可检测出plgf蛋白,表明胶质瘤细胞可以表达plgf,并且其外泌体中也含有plgf蛋白3正常人全血中分离获得na?veb细胞(cd19+il-7r+cd45+),将收集的胶质瘤外泌体用csfe标记后与na?veb细胞共培养,免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观察发现na?veb细胞可以捕获胶质瘤外泌体;进一步将捕获胶质瘤外泌体的na?veb细胞,用单价plgf和其抑制剂的na?veb细胞为对照,结果显示:不同浓度外泌体刺激的b细胞随外泌体浓度的升高tgf-βmrna和蛋白都增高,单加plgf也可使na?veb细胞表达tgf-β增加。表明携带plgf的胶质瘤外泌体可以被naiveb细胞捕获,捕获后的na?veb细胞可特异表达tgf-β,且与plgf调控有关;即携带plgf的外泌体可以将胶质瘤病灶微环境中na?veb细胞转化为tgf-β(+)bregs细胞。4将胶质瘤组织中分离的b细胞、胶质瘤患者外周血中的b细胞以及刺激转化的tgf-β(+)bregs细胞分别用csfe标记,提取胶质瘤组织内含物,10mg/ml的胶质瘤组织提取物分别刺激三种获得的b细胞,以10mg/mlbsa为阴性对照,5%co237℃孵箱培养3天后流式检测三种b细胞增殖程度,结果表明:91.2%的组织来源b细胞增殖和8.14%的外周血b细胞增殖,约有60.8%的bregs细胞得到增殖,结果显示增殖的b细胞具有胶质瘤特异性,胶质瘤特异性bregs细胞可能存在胶质瘤组织和胶质瘤患者的外周循环系统中5从胶质瘤患者全血中密度梯度离心分离pbmc后,接种75cm细胞培养瓶中培养2h后,将贴壁细胞与非贴壁细胞分开培养,加入不同细胞刺激因子培养7天获得dc细胞和t细胞,再采用磁珠法分离纯化cd8(+)cd25(-)t细胞。将获得的cd8(+)cd25(-)t细胞用csfe标记后,按30万:20万比例与dc细胞混合接种于96孔细胞培养板中,10mg/ml胶质瘤组织提取物,阴性对照加入10mg/mlbsa,然后加入20万诱导bregs细胞、naiveb细胞以及诱导bregs细胞先与胶质瘤提取物培养后刺激3天,不加b细胞为对照。结果显示:,流式细胞结果以csfe标记细胞设门,bsa刺激的cd8+t细胞增殖2.18%,胶

关键词： 肺癌   调节性B细胞   表型分子   免疫抑制   肿瘤逃逸  

摘要： 目的:分析肺癌病人外周血中CD19CD20B细胞表型特点,为其免疫抑制功能提供理论依据。通过肺癌细胞上清诱导B细胞,检测对T细胞增殖的抑制效应,验证肺癌中抑制性B细胞的存在。内容和方法:收集26例肺癌初治患者及11例健康人外周血,所有患者均经术后病理证实为肺癌。用流式细胞术检测肺癌患者和健康人外周血中CD19B细胞及其亚群CD19CD20B细胞比例,并比较患者和健康人之间的差异。分析26例肺癌患者外周血B细胞中CD19CD20B细胞的比例,结合临床病理资料分析CD19CD20B细胞比例和淋巴结转移、远处转移及肺癌分期等临床指标的关系。通过多色流式分析的方法检测肺癌患者外周血CD19B细胞中CD19CD20及CD19CD20B细胞亚群的表型分子特点,分析抑制性分子PD-1、CTLA-4和Tim-1在两群细胞上的不同表达水平。分析两者之间CD62L、CCR6、CD27、C24以及CD38表达的差异;收集肺癌组织及癌旁组织标本,检测并比较癌和癌旁组织浸润淋巴细胞的密度。将分选的外周血B细胞分别在加入刺激因子TNF家族B细胞活化因子(B cell-activating factor belonging to the TNF family,BAFF)的培养液及加入肿瘤细胞系NCI-H1299、NCI-520培养上清的培养液中进行培养,比较三种方案培养后B细胞表型分子的变化,同时比较不同上清刺激后的B细胞对CD4及CD8T细胞增殖抑制程度的差异。结果:流式分析结果显示,与健康人相比,肺癌患者外周血中CD19B细胞比例显著下降(p=0.0013)。CD19CD20B细胞在肺癌患者比例高于健康人(p=0.0379)。进一步将肺癌患者分成转移组(包括淋巴结转移和远处转移)和非转移组,发现转移组CD19CD20B细胞显著高于非转移组(p=0.0341),但是未能发现CD19CD20B细胞比例与肺癌患者的其他临床病理特征(性别、年龄、肿瘤大小、临床分期等)有关。多色流式分析结果显示在人外周血CD19B细胞亚群中,与CD19CD20B细胞相比,CD19CD20B细胞中高表达抑制性分子PD-1(p<0.0001)、CTLA-4(p<0.0001)和Tim-1(p<0.0001),说明CD19D20B细胞代表一群具有免疫抑制作用的B细胞亚群;同时低表达CD62L,说明CD19CD20B细胞无法到达脾脏、淋巴结等次级淋巴器官,接受抗原刺激而发育成为成熟的浆细胞;而低表达CCR6则说明其不能有效地启动体液免疫应答。CD19CD20B细胞较CD19CD20B细胞高表达CD38(p<0.0001),高表达CD27(p<0.0001),低表达CD24(p<0.0001),说明肺癌中CD19CD20B细胞与免疫相关性疾病中调节性B细胞(regulatory B cell,Breg)有所差异。与癌旁组织相比,癌组织浸润较多的CD19B细胞(p=0.0070)和CD19CD20B细胞(p=0.0120)。功能实验显示,与BAFF刺激组相比,肺癌细胞系NCI-H1299上清刺激后的B细胞可以诱导产生一群表型为CD19CD20B细胞,而NCI-H520肺癌细胞上清刺激组则未诱导产生该群细胞。将三组B细胞分别与CD3T细胞进行共培养,检测CD3T细胞中CD4及CD8T细胞的增殖情况,体外实验结果显示,NCI-H1299上清培养后的B细胞对CD4及CD8T细胞增殖均具有明显的抑制效应。结论:肺癌病人外周血CD19CD20B在肺癌转移患者高于未转移患者;表型分子分析结果显示这群B细胞高表达抑制性分子;但是存在归巢障碍,可能不能到达刺激淋巴器官,有效启动体液免疫应答。体外实验显示肺癌细胞系NCI-H1299上清可以体外诱导产生抑制性B细胞;诱导产生的抑制性B细胞对T细胞增殖具有抑制作用。

关键词： 弥漫大B细胞淋巴瘤   调节性B细胞   白介素-10   利妥昔单抗  

摘要： 目的:本研究的目的是检测初治DLBCL患者接受利妥昔单抗联合化疗前后调节性B细胞比例及IL-10的分泌水平。研究DLBCL患者与健康对照组调节性B细胞比例、IL-10水平差异;DLBCL不同临床分期调节性B细胞比例、IL-10水平差异,利妥昔单抗联合化疗对Breg、IL-10的影响,探讨Breg在DLBCL发病机制中的作用和意义,及其作为判断疗效及预后指标的意义。方法:收集2013年12月-2016年1月在兰州大学第二医院血液科住院部确诊的初治DLBCL的患者20例,患者均应用利妥昔单抗(375mg/m2)联合化疗(经典R-CHOP方案)进行化疗。15例健康对照组。应用流式细胞术分别检测DLBCL患者化疗前、经1周期含利妥昔单抗联合化疗后和健康对照组Breg的比例(即CD19+CD24hiCD38hiB细胞占CD19+B淋巴细胞的比例);应用酶联免疫吸附法检测IL-10分泌水平变化。结果:***组化疗前Breg的比例明显高于正常健康对照组(2.88±0.58vs 0.98±0.42)%,差异有统计学意义(P<0.01);DLBCL组化疗后Breg的比例较化疗前(0.66±0.43 vs 2.88±0.58)%明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);DLBCL组化疗后与健康对照组(0.66±0.43 vs 0.98±0.42)%无统计学差异(P>0.05)。在不同分期阶段,DLBCL组临床晚期Breg的比例高于临床早期(3.38±0.45 vs 2.47±0.26)%,差异有统计学意义(P<0.01)。***组化疗前IL-10的分泌水平明显高于健康对照组(9.81±2.07 vs 4.99±1.36),差异有统计学意义(P<0.01);DLBCL组化疗后IL-10的分泌水平(3.94±0.87 vs9.81±2.07)较化疗前明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);DLBCL组化疗后与健康对照组(3.94±0.87 vs 4.99±1.36)无统计学差异(P>0.05)。在不同分期阶段,DLBCL组临床晚期IL-10的分泌水平明显高于临床早期(11.56±1.13 vs2.47±0.26),差异有统计学意义(P<0.01)。***组化疗前后,Breg比例和I L-10分泌水平均呈正相关,差异有统计学意义(P<0.01);DLBCL组临床早期,Breg比例和I L-10分泌水平差异无统计学意义(P>0.05),两者无相关性;DLBCL组临床晚期,Breg比例和I L-10分泌水平均呈正相关,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:***患者存在Breg比例和IL-10分泌水平的变化,与健康对照组相比,Breg比例升高,IL-10分泌水平增加,提示Breg、IL-10参与DLBCL发病、发展过程;2.利妥昔单抗治疗可下调DLBCL患者外周血Breg的表达,抑制IL-10产生,两者呈正相关;***患者经利妥昔单抗治疗后,外周血Breg细胞的比例较治疗前减低,IL-10水平较治疗前降低,两者呈正相关。

关键词： 调节性B细胞   视神经脊髓炎谱系疾病   体液免疫   流式细胞术  

摘要： 目的:本研究旨在分析比较NMOSDs患者与正常对照组外周血单个核细胞中不同Bregs表型的数量及临床意义,并探讨不同Bregs表型与NMOSDs疾病严重程度的相关性,进一步揭示Bregs在NMOSDs发病过程中起到的重要作用,为今后NMOSDs的治疗提供新的方法。对象与方法:选取2015年5月至2016年3月之间就诊于吉林大学第一医院神经内科住院部的NMOSDs患者22例,同期选取年龄性别匹配的健康志愿者20例。所有患者按2015年最新NMOSDs诊断标准经2位神经免疫专业医生诊断。本实验征得研究对象或家属的同意后签署知情同意书,并收集NMOSDs患者的临床资料,对NMOSDs组患者进行EDSS评分评估疾病的严重程度。1.流式细胞术检测NMOSDs组和对照组外周血单个核细胞中Bregs三种不同表型CD19+CD24hiCD27+、CD19+CD5+CD1dhi、CD19+CD24hiCD38hi的百分数,并分析其比例变化;2.分析Bregs不同表型与NMOSDs患者EDSS评分和年复发率(ARR)的相关性。结果:***组外周血CD19+CD24hiCD38hiBregs的数量(4.07±0.03)水平较对照组相比明显降低(5.65±0.02),两者差异有统计学意义(P<0.05);***组外周血CD19+CD24hiCD27+Bregs的数量(34.74±0.10)水平较对照组相比明显升高(26.23±0.11),两者差异有统计学意义(P<0.05);***组外周血CD19+CD5+CD1dhiBregs的数量(2.78±0.02)水平较对照组相比明显降低(5.73±0.03),两者差异有统计学意义(P<0.001);4.不同Bregs表型与NMOSDs患者EDSS和年复发率ARR无明显的相关性(P>0.05)。结论:***患者外周血CD19+CD5+CD1dhi、CD19+CD24hiCD38hiBregs表型占CD19+B细胞的比例较对照组明显降低;***患者外周血CD19+CD24hiCD27+Bregs表型占CD19+B细胞的比例较对照组明显增高;3.不同Bregs表型与NMOSDs患者EDSS和年复发率ARR均无明显的相关性。

关键词： B细胞   调节性B细胞   白细胞介素-10   Rbm47   转录后调节   AU富集序列   调节性T细胞   溃疡性结肠炎  

摘要： 研究背景B细胞是免疫系统的重要组成部分,其主要功能为产生抗体、介导体液免疫应答,同时还具备提呈抗原、分泌细胞因子的功能。长期以来,基于对B细胞经典作用的认识,人们一方面将其视为机体抵抗病原入侵并保持稳态的主要的免疫效应细胞,另一方面又将其异常活化视为多种免疫相关疾病（特别是自身免疫病）的关键致病因素。然而,在过去的二十多年中,人们逐渐发现一部分B细胞具有免疫负调控作用且对维持机体免疫平衡具有重要意义,根据其功能特征人们将这部分细胞称之为调节性B细胞（Breg, regulatory B cells）。虽然大量的工作都已经证实了Breg的存在,但人们对其表面标志物和表型的界定并未达成一致观点。在Breg具体的研究工作中,白细胞介素-10（IL-10,interleukin-10）的表达水平常被作为公认指标以对Breg进行分析甚至分离。而在目前已发现的Breg的几种功能相关分子中,IL-10是Breg发挥调节功能的关键分子,对其研究也最为广泛深入。一方面,体内外的实验均表明IL-10缺失的Breg无法正常行使调节功能;另一方面,多项研究表明B细胞特异性的IL-10缺失会引发多种免疫相关疾病并与多种病理损伤相关。由于IL-10的表达与Breg的调节功能的紧密相关,研究B细胞中IL-10产生机制的对于深入认识Breg具有重要的科学意义。IL-10是免疫系统中经典的抑炎因子,是调节机体免疫平衡的重要组分。IL-10可介导包括抑制天然免疫细胞的成熟与活化,抑制炎性细胞因子的分泌,诱导Treg分化等在内的多种免疫效应,同时IL-10信号的缺失会导致多种免疫相关疾病的发生。外源性输入的IL-10蛋白在体内的代谢周期很短,限制了其作为药物的临床应用,而利用内源性的IL-10则能较好地解决这一问题。内源性的IL-10可以来源于多种细胞,但近年来的多项研究表明B细胞是多种生理和病理状态下IL-10的主要来源,而通过过继回输IL-10分泌的Breg细胞可以缓解和治疗多种免疫相关疾病。因此对B细胞中IL-10产生机制的研究具有重要的应用价值。IL-10的表达调控主要发生在转录水平和转录后水平。长期以来,对Breg特异性转录因子的探索一直没有停止但始终没有结果,而已经报道的能够在B细胞中调控IL-10转录的几种转录因子,如NF-kB,Bc16和Blimp1等对B细胞多种其他生物学功能亦有影响,因此目前并没有在B细胞中找到特异性调节IL-10表达的转录因子。对IL-10转录后调控水平的研究表明,IL-10的mRNA的3’非翻译区（3’UTR,3’-untranslated region）具有多个腺嘌呤和尿嘧啶富集序列（ARE, AU-rich element）,当RNA结合蛋白或microRNA与之结合后会对IL-10 mRNA的稳定性产生显著影响。因此,IL-10的最终蛋白表达水平会显著地受到转录后调控的影响,但目前对B细胞中IL-10表达的转录后调控研究仍少有报道。我们应用IL-10抗体标记磁珠分选了IL-10表达阳性和IL-10表达阴性的B细胞并通过基因芯片分析寻找IL-10表达相关的转录后调控因子。RBM47是我们筛选到的差异基因之一,其表达产物为一个具有3个RNA识别基序（RNA recognition motif）结构的RNA结合蛋白。已有的研究表明Rbm47可通过转录后调控的方式影响mRNA分子的存在状态并最终影响多种生物学进程,但其对免疫系统的影响并未见报道。通过基因改造和免疫治疗相结合,T细胞、DC细胞、NK细胞及间充质干细胞都已在临床上用于疾病的治疗。Breg由于其独特的免疫抑制功能也引起了人们将其应用于临床治疗的关注,而一些研究也探索了通过基因改造提高Breg免疫抑制效果的可行性,并得到了肯定的结论。由于IL-10是B细胞行使调节功能的关键分子,而IL-10的蛋白和mRNA都具有不稳定性,因此我们假设通过找到并调控IL-10表达相关的转录后调控因子可以促进B细胞的调节性功能,并针对Rbm47这一分子进行了验证。研究目标检测IL-10+B细胞中Rbm47的表达情况;探讨Rbm47对B细胞IL-10产生及免疫抑制作用的影响及潜在机制;加深对Breg免疫调控作用形成机制的认识并为推进其临床应用转化提供理论依据。方法与结果1. 应用IL-10抗体标记的磁珠,我们分选了IL-10分泌阳性和IL-10分泌阴性的B细胞,并应用表达谱芯片技术分析差异表达的转录后调控相关蛋白,RBM47在IL-10分泌阳性的B细胞中表达显著升高。2. 通过应用LPS体外诱导IL-10和及应用IL-10-GFP报告基因小鼠分选IL-10分泌阳性和IL-10分泌阴性细胞,我们对基因芯片的结果进行了验证。结果表明,B细胞中的Rbm47在IL-10诱导过程中表达升高,且特异性

关键词： 原发性干燥综合征   调节性B细胞   滤泡辅助T细胞   ESSDAI评分   转录组测序   microRNA   差异基因表达   干扰素   B细胞受体库   B细胞克隆  

摘要： 第一部分 原发性干燥综合征B细胞亚群特点及其调节功能研究背景和目的原发性干燥综合征(primary Sjogren’s syndrome, pSS)是泪腺、唾液腺受累为主的慢性自身免疫性疾病,亦可出现多系统损害。pSS患者B细胞过度活化,导致高免疫球蛋白血症和多种自身抗体产生,唇腺组织大量B细胞及浆细胞浸润。调节性B细胞(regulatory B cells, Breg)是一类具有免疫抑制功能的B细胞亚群,主要通过分泌IL-10等发挥免疫调节功能。pSS患者Breg细胞在外周血和组织中表达异常或功能受损,可能导致了B细胞的异常活化。我们通过分析pSS患者B细胞亚群的主要变化及活化情况,Breg细胞对效应T细胞分化的调控影响,在唇腺组织中的表达情况,滤泡辅助T细胞(T follicular helper,Tfh)能否促进Breg细胞活化,以及Breg细胞与pSS患者临床特点的相关性,以期能够对Breg细胞在pSS发病机制中的作用做以初步阐释。方法共收集84例pSS患者和69例年龄性别匹配的健康对照者(healthy control, HC)外周血以及唇腺组织各8例,用于后续研究。分离pSS患者和HC外周血单个核细胞,流式细胞表面染色分析B细胞亚群比例变化,分析pSS患者B细胞亚群相关活化因子表达差异,利用流式细胞仪分选B细胞亚群进行形态学观察。观察pSS患者Breg细胞IL-10表达情况,流式细胞仪分选pSS患者和HC的Breg细胞,磁珠分选CD4+CD25-效应T细胞,体外进行混合淋巴细胞培养和交叉培养,收集培养上清,利用CBA技术检测培养上清中相关炎性细胞因子水平。利用免疫组化和免疫荧光方法,对pSS患者和HC中CD20、IL-10表达情况进行定性、半定量及共定位分析。流式细胞仪检测pSS患者和HC中Tfh、Tfh-IL-21和Breg-IL-21R表达情况,初步阐释IL-21对Breg细胞的调控作用。最后结合pSS患者临床资料,分析Breg细胞比例和临床特点之间的相关性。结果***患者外周血Breg细胞占CD19+B细胞比例(9.23±0.45%),较HC(2.55±0.16%)显著升高(p<0.001);成熟B细胞比例(63.72±1.08%),较HC(56.50±1.14%)显著升高(p<0.001);记忆性B细胞比例(6.34±0.46%),较HC(19.36±1.03%)显著降低(p<0.001);CD19+CD24hiCD27+细胞比例(6.05±0.53%),较HC(16.39±1.15%)显著降低(p<0.001)。B细胞三个主要亚群在形态学上无显著性差异。***患者Breg细胞表面分子CD50、CD44、CD95、TACI表达水平较记忆性B细胞显著下降(p<0.05);***患者CD19+B细胞表达IL-10水平为(8.23±1.91%),较HC(25.55±0.63%)显著降低(p<0.001);Breg细胞IL-10表达水平为(28.43±5.49%),较HC(53.13±7.93%)显著降低(p=0.030)。4.进行混合淋巴细胞培养和交叉培养,培养上清检测结果提示：相较与HC,pSS患者的Breg细胞不能有效抑制其本身或HC的效应T细胞分泌的炎性细胞因子,IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-17、IL-21以及IL-9(p<0.05)。5.在pSS患者的唇腺组织中可见大量CD20+B细胞浸润,而IL-10表达较少,且与HC的IL-10+细胞在唇腺组织中的分布部位存在差异,免疫荧光染色提示pSS患者唇腺组织中仅见少量散在CD20+IL-10+细胞表达。***患者外周血Tfh细胞比例(占CD4+T细胞)为(21.88±0.82%),较HC(17.91±0.88%)显著升高(p=0.002);且CD4+CXCR5+PD-1+细胞(占CD4+T细胞)(7.42±0.80%)及CD4+CXCR5+ICOS+细胞水平(19.41±0.91%)亦较HC(1.71±0.12%,16.29±0.84%)显著增多(p<0.001,p=0.016)。pSS患者Tfh细胞IL-21表达水平(27.43±2.94%),较HC(9.97±1.91%)显著升高(p=0.018)。pSS患者Breg细胞IL-21R的表达(62.27±2.43%),较HC(75.25±2.18%)显著降低(p<0.001)。7.分离pSS患者和HC的CD19+B细胞进行体外培养,在加入CD40L和CpG基础上,增加/不增加rh IL-21刺激,观察Breg细胞IL-10表达。体外培养过程中rh IL-21可以显著提高pSS患者和HC的Breg细胞IL-10表达(p<0.05),提示在体内可能有其他因素影响IL-21对Breg细胞