关键词： Foxd3   白细胞介素-10   调节性B细胞   红斑狼疮小鼠  

摘要： IL-10调节性B细胞(Breg)通过分泌白介素-10(IL-10)在抑制过度炎性反应方面起到重要作用。然而调节性B细胞因在体内含量少,没有特异性表面标记,没有特异性转录因子,和分化发育机制不清楚等限制其将来临床应用。为了进一步深入研究调节性B细胞的分化发育机制,本研究首先关注了一个关键的科学问题:哪些转录因子能有效地调控调节性B细胞关键的标志性分子—IL-10的表达?目的:分析IL-10启动子上转录因子结合位点,检测Foxd3(经预测是结合在IL-10启动子上得分最高和结合位点最多的一个转录因子)在调节性B细胞中与IL-10分泌的相关性,阐明“Foxd3在调节性B细胞分化、发育、扩增及功能中的作用及机制”,并为靶向Foxd3信号通路促使调节性B细胞扩增及其对自身免疫病治疗提供理论及实验依据。方法:(1)通过两个网站为基础的预测软件,对IL-10启动子上转录因子结合位点进行分析;(2)应用染色质免疫共沉淀-PCR技术验证Foxd3是否能够直接结合在IL-10启动子上;(3)应用基因突变技术进一步证实Foxd3与IL-10启动子结合的具体相互作用位点;(4)通过双荧光素酶报告系统分析Foxd3是否调节IL-10启动子的活性;(5)应用实时定量PCR和免疫印迹技术检测LPS活化的B细胞中Foxd3的mRNA水平和蛋白水平表达;(6)应用Foxd3特异性shRNA敲低B细胞中Foxd3的表达,检测Foxd3表达降低是否影响IL-10的表达;(7)通过流式细胞术、酶联免疫吸附实验和免疫印迹技术,检测系统性红斑狼疮小鼠B细胞中Foxd3和IL-10表达的相关性。结果:(1)对小鼠IL-10启动子上转录因子结合位点进行分析,发现Foxd3是与IL-10启动子结合最强(得分最高)和最多(结合位点最多)的转录因子;(2)染色质免疫共沉淀-PCR技术鉴定出Foxd3能结合在IL-10启动子上游-1400bp位置;(3)通过构建截短型IL-10启动子,证明Foxd3通过与IL-10启动子结合位点p4(-1413)结合;通过构建截短型Foxd3蛋白,证实Foxd3通过一个N末端结构域结合在IL-10启动子上;(4)双荧光素酶报告系统分析显示,Foxd3能有效地抑制IL-10启动子的功能;(5)实时定量PCR和免疫印迹技术证实LPS活化的B细胞高表达Foxd3 mRNA和蛋白,并且Foxd3的表达随着LPS的刺激呈时间依赖性增加;(6)实时定量PCR、免疫印迹技术、流式细胞术和酶联免疫吸附实验检测结果显示Foxd3低表达的IL-10调节性B细胞中IL-10的表达升高;(7)流式细胞术、酶联免疫吸附实验和免疫印迹技术结果表明,系统性红斑狼疮小鼠B细胞中Foxd3表达量升高而IL-10调节性B细胞降低。结论:本研究表明无论是在体内还是体外,活化的B细胞上调Foxd3的表达。Foxd3通过直接结合IL-10的启动子,限制IL-10启动子的激活,进而抑制IL-10调节性B细胞的产生。自身免疫病小鼠B细胞高表达Foxd3进而降低调节性B细胞的产生。这样,转录因子Foxd3通过抑制B细胞中白介素-10的表达抑制调节性B细胞的产生。这项研究不仅阐明了Foxd3抑制调节性B细胞产生的机制,而且为以Foxd3为潜在靶点诱导调节性B细胞产生来治疗自身免疫病的新方法奠定前期基础。因此,这项研究既丰富了调节性B细胞分化发育的基本理论又为调节性B细胞的可能应用奠定了坚实基础。

关键词： 芒果甙   调节性B细胞   白细胞介素-10   炎症因子   抗氧化通路   动物模型   移植物抗宿主病  

摘要： 目的：在体外实验中研究芒果甙（MA）对小鼠脾脏单个核细胞（MNCs）中的调节性B细胞(Bregs)、调节性T细胞(Tregs)、炎症因子、Nrf2抗氧化通路水平的影响，以及MA对小鼠脾MNCs的细胞毒性作用，初步探讨芒果甙抗慢性移植物抗宿主病（cGVHD）的作用机制。　　方法：用Ficoll密度梯度离心法分离小鼠脾脏的MNCs，用MA进行干预，分组如下：（1）对照组：用等浓度溶剂DMSO培养基培养;（2）实验组：不同浓度MA处理MNCs（50uM、100uM、150uM、200uM）。用流式细胞学检测MA干预后的细胞中Bregs、Tregs的水平及CD4+/CD8+T细胞比例。用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞培养上清中因子IL-10、TGF-β以及炎症因子IL-2、IFN-γ水平。利用实时定量逆转录PCR技术检测细胞内Nrf2通路相关分子以及炎症因子IL-2、IFN-γ的mRNA水平改变。以Western blot检测MA干预后细胞内Nrf2通路相关分子的蛋白水平变化。用MTT比色法检测MA干预后细胞的增殖活性。利用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测MA干预后细胞的凋亡情况。　　结果：　　（1）MA呈剂量依赖性和时间依赖性促进Bregs水平增高，以72h为例，与对照组统计值1.02±0.25%相比，各实验组组Bregs水平统计数值依次为50μM MA组1.83±0.22%（P=0.0406），100μM MA组1.87±0.23%（P=0.0457），150μM MA组2.20±0.13%（P=0.0017），200μM MA组2.53±0.19%（P=0.0012），然而两组间Tregs水平无显著性差异（P=0.8900）;（2）MA提高CD4+/CD8+比例，在50uM MA及200uM MA组均较对照组增高（P=0.0182，P=0.0321）;（3）Elisa结果显示，MA促进细胞因子IL-10的分泌，以50uM、100uM、150uM MA组最为显著，其数值依次是444.2±60.64pg/ml、494.3±71.41pg/ml、501.3±64.75pg/ml，与对照组382.4±40.71pg/ml相比均有所增高。(P50=0.0103、P100=0.0209、P150=0.0086）。但两组细胞中 TGF-β的分泌水平无统计学差异（P=0.4787）;（4）MA减低炎症因子IL-2、IFN-γ分泌及转录水平。与对照组相比，以200uM MA组最为明显，降低IL-2及IFN-γ分泌水平（P<0.001，P=0.0221）和转录水平（P=0.0422，P=0.0178）;（5）MA激活Nrf2抗氧化应激通路。MA实验组明显提高此通路下游因子Nrf2、NQO1的转录水平以及蛋白水平，而降低其下游负调控因子Keap1转录和蛋白表达水平。与对照组相比，以200uM MA实验组最明显，Nrf2和NQO1的mRNA水平分别增高了2.81倍（P<0.001）及2.44倍（P=0.0360），蛋白水平分别增高了3.39倍(P=0.0020）及7.1倍(p=0.0191）;而Keap1 mRNA水平降低至0.65倍（P=0.0278），蛋白水平降至0.2倍（P<0.001）。　　（6）MTT结果显示，MA呈剂量依赖性促进MNCs增殖，以48h最为明显，200uM MA组比对照组明显增高（P=0.0017）;（7）凋亡检测，MA实验组与对照组相比，细胞凋亡率有所减低，以150uM MA实验组最为显著（P=0.0079）。　　结论：本实验研究初次证实MA可在体外实验中提高小鼠脾脏的Bregs水平及IL-10水平，MA可能籍此增强免疫抑制活性。MA不影响Tregs的水平。MA尚可抑制炎症因子IL-2、IFN-γ的转录及表达。MA也能在体外提高小鼠脾MNCs的Nrf2、此通路下游抗氧化酶NQO1的基因转录以及蛋白表达，并降低Keap1的转录及表达，因此MA可增强小鼠脾MNCs的Nrf2抗氧化通路的活性。MA可能通过上调Bregs参与免疫调控，抑制促炎细胞因子表达和分泌，并激活Nrf2通路通路防御免疫炎症损伤。MA可促进小鼠脾MNCs的增殖、抑制其凋亡，对此细胞具有保护作用而非细胞毒作用。MA可能成为有效、安全的免疫调控剂，可望用于防治cGVHD。MA的免疫调控机制及体内活性尚待进一步深入研究。

关键词： 红斑狼疮   系统性   调节性B细胞   CD4+T淋巴细胞亚群   相关性  

摘要： 目的:检测并分析不同活动期SLE患者外周血中的CD19CD24CD38Breg细胞、Th17细胞、Treg细胞与细胞因子IL-10的水平;并探讨CD19CD24CD38Breg细胞、细胞因子IL-10与Th17、Treg细胞的相关性。方法:选择符合入组条件的初治SLE患者50例,并选取与SLE患者性别、年龄相近的18例正常人作为对照组,并对选入组的SLE患者进行SLEDAI评分,按评分结果分为稳定期组、轻度活动组、中度活动组、重度活动组。收集所有实验对象空腹外周血,采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测CD19CD24CD38Breg、Treg、Th17细胞水平;同时留取所有实验对象血清,应用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞因子IL-10水平。所有数据结果均用SPSS软件进行分析处理。结果:***患者血清中IL-10水平(408.03±211.25)pg/ul与正常对照组(104.29±30.26)pg/ul相比存在明显增高(p<0.05);稳定期组(185.02±69.27)pg/ul、轻度活动组(306.98±65.09)pg/ul、中度活动组(431.37±127.50)pg/ul、重度活动组(625.61±201.27)pg/ul四组SLE患者血清中IL-10水平有差异(p<0.05)。SLE患者血清中IL-10与SLEDAI评分呈正相关(r=0.779,p<0.01)。***患者外周血中CD19CD24CD38Breg细胞水平(1.66±1.61)个/ul与正常对照组(6.96±3.58)个/ul相比有明显减少(p<0.05);稳定期组(3.58±2.20)个/ul、轻度活动组(1.85±1.32)个/ul、中度活动组(1.10±0.56)个/ul、重度活动组(0.66±0.46)个/ul四组SLE患者外周血中CD19CD24CD38Breg细胞水平比较差异有统计学意义(p<0.05)。SLE患者外周血中CD19CD24CD38Breg细胞与SLEDAI评分呈负相关(r=-0.703,p<0.01);与IL-10呈负相关(r=-0.593,p<0.01)。***患者外周血中Th17细胞的水平(40.76±48.37)个/ul与对照组(6.45±3.98)个/ul相比明显增高(p<0.05),Treg细胞的水平(4.94±4.19)个/ul与对照组(28.21±15.04)个/ul相比明显减少(p<0.05);Th17细胞的水平在SLE疾病稳定期组为(10.49±6.52)个/ul、轻度活动组(20.91±16.44)个/ul、中度活动组(42.61±31.50)个/ul、重度活动组(76.65±68.90)个/ul四组有差异(p<0.05);Treg细胞的水平在SLE疾病稳定期组为(10.08±5.23)个/ul、轻度活动组(5.74±1.83)个/ul、中度活动组(3.70±2.67)个/ul、重度活动组(1.83±2.00)个/ul四组比较有差异(p<0.05)。SLE患者外周血中的Th17细胞与SLEDAI评分呈正相关(r=0.756,p<0.01);Treg细胞与SLEDAI评分呈负相关(r=-0.733,p<0.01)。Th17细胞与CD19CD24CD38Breg细胞呈负相关(r=-0.410,p<0.01);Treg细胞与CD19CD24CD38Breg细胞呈正相关(r=0.568,p<0.01)。Th17细胞与IL-10呈正相关(r=0.607,p<0.01);Treg细胞与IL-10呈负相关(r=-0.477,p<0.01)。结论:CD19CD24CD38Breg细胞、IL-10均参与了SLE发病,其参与机制极有可能涉及了调节Th17、Treg细胞的平衡。

关键词： 多发性硬化   B淋巴细胞   调节性B细胞   过渡型B细胞   浆母细胞  

摘要： 目的通过检测多发性硬化患者与正常对照组调节性B细胞等相关B淋巴细胞占总B淋巴细胞百分率差异,并且分析患者不同临床严重度与调节性B细胞的相关性,探讨各B淋巴细胞亚群在多发性硬化中的潜在作用。方法收集从2016年7月到2017年3月入蚌埠医学院第一附属医院神经内科住院的多发性硬化患者(n=12,男8例,女4例,年龄41.42±4.53岁)及同期门诊体检的无神经系统或免疫系统疾病的健康者(n=12,性别、年龄均与多发性硬化组匹配)外周静脉血样本,并对所有多发性硬化患者进行EDSS伤残评分。采用流式细胞仪检测患者及对照组外周静脉血中CD19+CD24hi CD38hi细胞、CD19+CD27-CD38hi细胞、CD19+CD27hi CD38hi细胞占B淋巴细胞总数的百分率,酶联免疫吸附测定患者及对照组外周静脉血中IL-10水平。分析比较两组的B淋巴细胞亚群差异及MS组CD19+CD24hi CD38hi细胞比例与EDSS是否具有线性相关。结果多发性硬化患者外周血调节性B细胞(CD19+CD24hi CD38hi)及过渡型B细胞(CD19+CD27-CD38hi)占总B淋巴细胞的百分率及IL-10水平与对照组之间差异有统计学意义(P<0.05),多发性硬化患者外周血调节性B细胞、过渡型B细胞及IL-10水平均降低。多发性硬化患者浆母细胞(CD19+CD27hi CD38hi)占总B淋巴细胞的百分率与对照组相比无统计学意义(P>0.05)。临床严重性EDSS评分不同的多发性硬化患者与其调节性B细胞表达率无统计学差异(P>0.05)。结论MS患者发病期调节性B细胞及过渡型B细胞表达降低伴随IL-10减少,B淋巴细胞参与多发性硬化的发病。调节性B细胞表达降低与临床严重度可能无关。

关键词： 原发性免疫缺陷病   调节性B细胞   非同源末端连接   DNA连接酶IV  

摘要： 第一部分 DOCK8蛋白缺陷对调节性B细胞功能影响及机制研究　　背景： DOCK8免疫缺陷病（Dedicator of cytokinesis 8 deficiency）是一类以反复感染、血清 IgE 水平显著升高和嗜酸性粒细胞增多为特征的原发性免疫缺陷病;其患者具有明显的过敏症状和自身免疫性疾病表现。DOCK8 蛋白为一种细胞骨架调控分子可激活 Rho-GTP 酶从而参与淋巴细胞发育、迁移及活化等多种细胞功能。调节性 B 细胞（Regulatory B Cell;Breg）是一群可以负性调控T细胞免疫反应的B细胞;主要通过分泌IL-10在多种自身免疫病和过敏及炎症中发挥着缓解疾病的作用。本研究以DOCK8缺陷病患者及DOCK8KO小鼠为模型;拟探究DOCK8缺陷对Breg细胞发育及功能的影响。　　方法：利用流式细胞术检测 DOCK8 缺陷病患者外周血及DOCK8KO小鼠脾脏中Breg细胞的比例和数量。通过 DOCK8KO/WT骨髓嵌合体小鼠模型验证DOCK8蛋白缺陷时Breg缺陷是否固有存在。利用DOCK8KO小鼠脾脏CD4+ na?ve T细胞过继移植到CD4KO小鼠实验;明确DOCK8-/-CD4+T细胞是否影响Breg数量。再对DOCK8KO小鼠进行 IL-21替代治疗并观察其对Breg的影响。　　结果： 3名DOCK8缺陷病患儿外周血中Breg细胞的数量;与同龄正常对照相比明显下降（对照：2.271±0.1514%;n=10;DOCK8 患者：0.4240±0.2987%;n=3;P=0.0001）。DOCK8KO小鼠脾细胞Breg的数量也较WT小鼠降低;且OVA致敏后其下降更为明显（WT：1.477 ±0.1338%;n=3;KO：0.7133±0.1955%;n=3;P=0.03。WT-OVA：1.913±0.04702%;n=3;KO-OVA：0.09593±0.05788%;n=3;P<0.0001）。DOCK8KO/WT 骨髓嵌合体小鼠模型分析结果显示DOCK8-/-Breg数量下降（比例：WT：1.577±0.1618%;n=3;DOCK8KO：0.4267±0.1120%;n=3;P=0.0043;绝对数：WT：273047 ± 51773;n=3;DOCK8KO：45168±9175;n=3;P= 0.0123）;而DOCK8KO/μMT（B细胞缺陷小鼠） 骨髓嵌合体小鼠模型分析结果显示 DOCK8-/-Breg 数量正常（比例：WT：1.173±0.2849%;n=3;DOCK8KO：1.853±0.3032%;n=3;P=0.1775;绝对数：WT：509810±156319;n=3;DOCK8KO：590132 ±241800;n=3;P=0.7941）。将DOCK8KO小鼠或WT小鼠的CD4+na?ve T细胞过继移植到CD4+T细胞缺失（CD4KO）的小鼠中;经OVA或KLH免疫后检测;结果发现接受DOCK8-/-CD4+na?ve T细胞的CD4KO小鼠脾脏细胞Breg数量明显降低（WT-OVA：1.572±0.2849%;n=4;DOCK8KO-OVA：0.654±0.3523%;n=4;P=0.037;WT-KLH：1.260±0.3728%;n=4;DOCK8KO-KLH：0.2005±0.06033%;n=4;P=0.0309）。另一方面;通过给DOCK8KO小鼠补充外源性IL-21;其脾脏细胞Breg数量可恢复至正常。对于LPS诱导CD5+CD1dhi B细胞中的STAT3磷酸化水平;DOCK8KO小鼠较WT下降;而对于IL-21诱导CD5+CD1dhi B细胞中的STAT3磷酸化水平;DOCK8KO小鼠较WT无明显差异。　　结论：DOCK8 蛋白缺陷时 Breg 细胞数量及功能存在固有缺陷;且该缺陷是由于DOCK8蛋白缺失引起CD4+T分泌IL-21功能降低所导致;而外源性补充IL-21可恢复Breg数量至正常。推测其机制是由于DOCK8KO小鼠中LPS诱导STAT3磷酸化缺陷导致LPS诱导Breg分泌IL-10障碍;而IL-21可以通过诱导STAT3磷酸化从而恢复Breg分泌IL-10功能。　　第二部分 DNA连接酶IV综合征患儿临床、免疫学特征及基因突变分析　　背景：DNA 连接酶 IV 缺陷病是一种罕见的常染色体隐性遗传的原发性免疫缺陷病;由LIG4基因突变导致。临床表现为辐射敏感;生长发育迟缓;小头畸形;联合免疫缺陷;自身免疫性疾病和肿瘤等。国内外现有不到30例病例报道;尚无回复突变及其临床转归报道。该病的临床特点、分子和免疫学特征仍未完全阐明。　　方法：本研究纳入 7 名经 Sanger 测序或二代测序确诊具有 LIG4基因突变的病人;并对其临床资料进行分析。对一例疑

关键词： 调节性B细胞   原发性干燥综合征   IL-10   TGF-β   Foxp3  

摘要： 原发性干燥综合征(p SS)是一种主要侵犯唾液腺和泪腺等外分泌腺,并累及多个系统的慢性自身免疫性疾病。B细胞异常改变是p SS的主要特征之一,其他特征还包括B细胞过表达、外周血产生大量异常的自身抗体、出现高丙种球蛋白血症、B细胞亚群异常,选择性浸润外分泌腺等组织、形成异位淋巴样组织。调节性B细胞是B淋巴细胞中具有负向免疫调节功能的亚群。调节性B细胞主要通过分泌细胞因子如:IL-10、TGF-β、Foxp3等及与T细胞直接接触等参与固有及适应性免疫应答,抑制炎症反应。调节性B细胞在原发性干燥综合征表达及功能异常可导致原发性干燥综合征的发病。

关键词： 急性胰腺炎   Bregs细胞   严重程度  

摘要： 目的:观察急性胰腺炎(AP)患者Bregs细胞表达的变化,并探讨了其相关的临床意义。方法:收集2014-11-2016-07我院诊治的AP患者78例,另选取我院体检中心健康体检者40例对照。流式细胞技术检测Bregs细胞比例变化,Elisa法检测IL-10表达。结果:AP患者Bregs细胞比例为(13.74±2.47)%,显著低于对照组的(21.16±4.35)%(P<0.01),AP患者IL-10表达为(16.62±3.54)ng/ml,显著低于对照组的(27.48±5.62)ng/ml(P<0.01)。患者入院后第1、5、7天急性重症胰腺炎(SAP)患者Bregs细胞和IL-10表达均显著低于急性轻型胰腺炎(MAP)患者(P<0.05或P<0.01),MAP患者Bregs细胞和IL-10表达入院后第1天到第3和第7天逐渐升高(P<0.05),而SAP患者Bregs细胞和IL-10表达入院后第1天到第3天和第7天逐渐减低(P<0.05)。Pearson线性相关分析显示AP患者Bregs细胞与APACHE评分呈显著负相关(r=-0.412,P<0.05),IL-10表达也与APACHE评分呈显著负相关(r=-0.424,P<0.05)。结论:AP患者Bregs细胞和IL-10低表达,Bregs细胞和IL-10检测在预测AP严重程度和病情发展方面具有一定的临床意义。

关键词： 调节性B细胞   变态反应性疾病   免疫调节  

摘要： 近年来，对于免疫机制的研究越来越关注于负向调节方面。早些年更多关注于调节性T细胞，但最近也发现B细胞有亚群对免疫系统起负向调节作用，称之为调节性B细胞。变态反应性疾病存在机体的过度免疫且多迁延不愈，其重要的原因就是个体的负向调节机制发生变化。调节性B细胞作为一种重要的调节性细胞，可能在变态反应性疾病的发生和发展中起重要的抑制作用，并且在变态反应性疾病的治疗中可能存在广阔前景。

关键词： 类风湿关节炎   外周血   调节性B细胞   干扰素   IL-10  

摘要： 目的检测类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血CD19^+CD24^(hi)CD38^(hi)调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs)比例及功能的变化情况,初步探讨Bregs在RA发病中的作用。方法采用流式细胞染色方法检测健康对照组及RA患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中CD19^+CD24^(hi)CD38^(hi)B细胞和CD4 T细胞比例变化情况;活细胞荧光染料CFSE染色方法检测CD19^+CD24^(hi)CD38^(hi)B细胞对Nave CD4 T细胞增殖能力的影响;同时检测CD19^+CD24^(hi)CD38^(hi)B细胞分泌IL-10的能力及对CD4 T细胞分泌IFN-γ能力的影响。结果与健康对照组相比,RA患者外周血CD19^+CD24^(hi)CD38^(hi)B细胞比例显著降低,而CD4 T细胞比例显著升高,且随着病情严重程度升高,差异有统计学意义(P<0.05)。功能研究显示,RA患者外周血CD19+CD24hi CD38hiB细胞分泌IL-10水平显著降低(P<0.01),且其抑制Nave CD4 T细胞增殖及分泌IFN-γ的能力均显著降低(P<0.01)。结论 RA患者外周血CD19^+CD24^(hi)CD38^(hi)B细胞分泌IL-10能力下降,导致免疫抑制功能降低,进而引起CD4 T细胞比例升高和IFN-γ水平升高,影响RA病情进展。

关键词： 调节性B细胞   白细胞介素10   转化生长因子β   艾滋病病毒  

摘要： B淋巴细胞主要通过产生各种抗体和呈递抗原发挥免疫调节作用。研究表明,B淋巴细胞中存在着一些能够调节免疫应答的新细胞亚群——调节性B细胞,其主要是通过产生白细胞介素10(IL-10)和转化生长因子β(TGF-β)等抑制性细胞因子发挥免疫负向调节作用,在艾滋病病毒(HIV)感染中具有重要作用。对HIV感染者调节性B细胞表型和功能等的研究,将为深入了解艾滋病发病机制和治疗方法提供新的理论依据和研究方向。