关键词： Basic (laboratory) research   science   translational research   science   liver transplantation   hepatology   innate immunity   liver disease: immune   inflammatory   macrophage   monocyte biology   activation   ACTIVATING TRANSCRIPTION FACTOR-3   ACUTE KIDNEY INJURY   ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY   FOCAL CEREBRAL-ISCHEMIA   CANCER CELLS   ATF3   NRF2   PATHWAY   MICE   INFLAMMATION  

摘要： Activating transcription factor 3 (ATF3) is a stress-induced transcription factor that has been shown to repress inflammatory gene expression in multiple cell types and diseases. However, little is known about the roles and mechanisms of ATF3 in liver ischemia/reperfusion injury (IRI). In warm and cold liver IRI models, we showed that ATF3 deficiency significantly increased ischemia/reperfusion (IR)-stressed liver injury, as evidenced by increased serum alanine aminotransferase levels, histological liver damage, and hepatocellular apoptosis. These may correlate with inhibition of the intrahepatic nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2/heme oxygenase-1 (NRF2/HO-1) signaling pathway leading to enhancing Toll-like receptor 4/nuclear factor kappa beta (TLR4/NF-B) activation, pro-inflammatory programs and macrophage/neutrophil trafficking, while simultaneously repressing anti-apoptotic molecules in ischemic liver. Interestingly, activation of NRF2/HO-1 signaling using an NRF2 activator, oltipraz (M2), during hepatic IRI-rescued ATF3 anti-inflammatory functions in ATF3-deficient mice. For in vitro studies, ATF3 ablation in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated bone marrow-derived macrophages (BMMs) depressed levels of NRF2/HO-1 and PI3K/AKT, resulting in enhanced TLR4/NF-B activation. Pretreatment of LPS-stimulated BMMs with M2 increased NRF2/HO-1 expression, promoted PI3K/AKT, which in turn suppressed TLR4/NF-B-mediated proinflammatory mediators. Thus, our results first demonstrate ATF3-mediated NRF2/HO-1 signaling in the regulation of TLR4-driven inflammatory responses in IR-stressed livers. Our findings provide a rationale for a novel therapeutic strategy for managing IR-induced liver injury. This study demonstrates that activating transcription factor 3 regulates toll-like receptor 4-driven inflammatory responses by nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2/heme oxygenase-1, and attenuates liver ischemia reperfusion injury.

关键词： Inflammation   Prostaglandins   Lipid mediators   ACTIVATING TRANSCRIPTION FACTOR-3   CELL-DIFFERENTIATION   NEUTROPHIL MIGRATION   FEEDBACK-REGULATION   GENE-TRANSCRIPTION   RESPONSE ELEMENT   KAPPA-B   CYCLOOXYGENASE-2   RESOLUTION   MEDIATORS  

摘要： By generating prostaglandins, cyclooxygenase-2 (Cox-2/Ptgs2) plays a critical role in regulating inflammatory responses. While several inflammatory stimuli have been shown to increase Ptgs2 expression, less is known about how the transcription of this gene is terminated. Here we show that stimulation of macrophages with yeast zymosan, a TLR2/6 and dectin-1 agonist, causes a transient increase in the expression of Ptgs2 accompanied by a simultaneous increase in the expression of the transcriptional repressor, activating transcription factor-3 (Atf3). The expression of Ptgs2 was significantly higher in resident peritoneal macrophages isolated from Atf3(-/-) mice than that from Atf3(+/+) mice and was associated with higher prostaglandin production upon stimulation with zymosan. In activated macrophages, Atf3 accumulated in the nucleus and chromatin-immunoprecipitation analysis showed that Atf3 is;recruited to the Ptgs2 promoter region. In acute peritonitis and in cutaneous wounds, there was increased leukocyte accumulation and higher levels of prostaglandins (PGE(2)/PGD(2)) in inflammatory exudates of Atf3(-/-) mice compared with WT mice. Collectively, these results demonstrate that during acute inflammation Atf3 negatively regulates Ptgs2 and therefore dysregulation of this axis could potentially contribute to aberrant Ptgs2 expression in chronic inflammatory diseases. Moreover, this axis could be a new therapeutic target for suppressing Ptgs2 expression and the resultant inflammatory responses. (C) 2015 Elsevier Inc. All rights reserved.

关键词： 肝再生   去迷走神经   Atf3   Nr2f1  

摘要： 目的:研究去迷走神经对大鼠再生肝中Atf3和Nr2f1的表达影响,进一步探讨迷走神经在肝再生过程中的作用及其调控机制。方法:将108只雄性大鼠分为随机的2组:PH组:2/3肝切除组;PHV组:去迷走神经2/3肝切除组。分别在术后0h、2h、12h、24h、36h、48h、72h、120h、168h处死,取大鼠的肝脏并分成两份,一份保存在中性福尔马林试剂中,另一份保存于液氮中。用免疫组织化学方法和免疫印迹法(Western Blot)检测肝组织中Atf3和Nr2f1蛋白的表达;实时荧光定量法(RT-PCR)检测肝组织中Atf3mRNA和Nr2f1 mRNA的表达。结果:(1)免疫组化法检测大鼠再生肝中Atf3的表达:PHV组大鼠在术后24h6h的阳性表达量明显高于PH组(P<0.01),在12h和48h表达量低于PH组。(2)免疫组化法检测大鼠的再生肝中Nr2f1的表达:相对于PH组来说,PHV组大鼠的表达量在术后12h、36h、48h、72h、168h低于PH组,在术后2h、24h、120h处表达量稍高于PH组,36h表达量上升到最高,在术后12h、48h和168h时与PH组有显著性差异(P<0.05)。(3)RT-PCR法检测大鼠再生肝组织中Atf3 mRNA的表达结果:与PH组相对比,PHV组的大鼠术后24h6h肝组织内Atf3 mRNA的表达量上升,且高于PH组,在术后2h、36h和120h有显著性差异(P<0.05)。(4)RT-PCR法检测大鼠再生肝组织中Nr2f1 mRNA的表达结果:与PH组相对比,PHV组的大鼠,手术后Nr2f1 mRNA的表达量在0h68h基本都低于PH组,在术后12h和48h有极显著差异(P<0.05)。(5)WB法检测大鼠的再生肝组织中Atf3的蛋白的表达结果:与PH组相对比,PHV组大鼠手术后至48h表达量高于PH组,在48h20h表达量低于PH组,有显著性差异(P<0.05)。(6)WB法检测大鼠再生肝组织中Nr2f1的蛋白表达结果:与PH组相比,PHV组大鼠术后Nr2f1的蛋白量表达变化与PH组的变化相似,但整体都比PH组的表达量低,与PH组相比有显著性差异(P<0.01)。结论:(1)研究结果进一步提示去迷走神经可能对大鼠肝组织再生起促进作用。(2)去迷走神经对大鼠肝再生的促进作用,可能是通过促进再生肝组织中Atf3的表达,抑制再生肝组织中Nr2f1的表达来实现的。II

关键词： PGF   大鼠   黄体   MAPK   ATF3   NR4A  

摘要： 黄体的主要功能是分泌孕酮,它的退化意味着下一个发情周期的开始,因此,它在卵巢周期性调节和妊娠的维持中起着重要作用。在啮齿类动物中,黄体退化首先会发生功能性退化(孕酮合成水平明显降低),而后发生结构性退化(细胞凋亡的发生)。本论文采用苏木素-伊红染色(HE)、酶联免疫测定(ELISA)、免疫组织化学(IHC)、RT-PCR、real-time PCR、免疫印迹(Western blot)等方法,研究MAPK与立早基因(ATF3、NR4A1和NR4A2)在PGF诱导的假孕大鼠黄体退化过程中的表达模式及其可能作用,为进一步研究哺乳动物卵巢黄体退化提供试验依据。主要内容如下:***3与MAPK参与PGF诱导假孕大鼠黄体退化的作用研究为了研究ATF3与MAPK成员参与PGF诱导假孕大鼠黄体退化的作用,本试验采用PMSG/hCG联合处理构建大鼠假孕模型。在假孕第七天注射PGF,分别在0h、10 min、30 min、1h、2 h和4 h颈椎脱臼法处死大鼠。ELISA结果表明:血中孕酮水平呈时间依赖性下降。WB结果表明:在PGF处理2h,ATF3的表达量显著上升(P<0.01);而在30min,p-ERK和p-JNK表达量显著上升(P<0.01);相比之下,p-p38的表达量却没有明显变化。IHC结果表明:PGF处理后,黄体中p-ERK的染色自外向里逐渐减弱;而ATF3的染色相对均匀的分布在大、小黄体细胞的细胞核。这些结果提示PGF会诱导MAPK部分成员的磷酸化,它们的变化可能参与调控黄体退化过程中ATF3表达的升高与孕酮水平的降低。2.核受体NR4A1与NR4A2在PGF诱导的大鼠黄体退化中的定位及其表达规律通过观察核受体NR4A成员NR4A1与NR4A2在PGF诱导的大鼠黄体退化中的表达规律,推测其在大鼠黄体退化过程中的可能作用。在假孕第七天行PGF不同时间点(0 h、30 min、1 h、2 h 和 4 h)注射,采用 RT-PCR 和 real-time PCR 方法检测卵巢中NR4A1与NR4A2mRNA表达变化,IHC观察黄体中NR4A1与NR4A2的定位。结果:NR4A1蛋白主要定位在黄体细胞的细胞质中,在卵母细胞和膜细胞上也有表达,且在PGF处理后,NR4A1mRNA水平先上升而后下降,并且在30min-lh表达量最高,与生理盐水组相比差异极显著(P<0.01)。而NR4A2在黄体中呈不均匀(片状或颗粒状)分布,大部分在黄体细胞的细胞质中表达,并且在PGF处理后,NR4A2 mRNA水平的变化趋势与NR4A1保持一致,处理30 min-1 h组NR4A2mRNA水平与生理盐水组相比差异极显著(P<0.01),但NR4A2mRNA水平的变化不及NR4A1敏感。上述结果提示核受体NR4A1和NR4A2可能与PGF诱导的假孕大鼠黄体退化有密切关系。

关键词： PGF   CL   P-4   ATF3   MAPK   Rat   MONOCYTE CHEMOATTRACTANT PROTEIN-1   GONADOTROPIN-RELEASING-HORMONE   CHORIONIC-GONADOTROPIN   LUTEINIZING-HORMONE   ENDOTHELIAL-CELLS   IMMUNE CELLS   FREE CALCIUM   INDUCTION   GENE   ERK  

摘要： The current study was conducted to evaluate the expression of ATF3, in association with the activation of mitogen-activated protein kinases (MAPK) during prostaglandin F-2 alpha analog (PGF)-induced luteal regression in rats. A sequential PMSG/hCG treatment paradigm was used to obtain a single, well-defined generation of corpora lutea (CL) in rats. Rats were treated with PGF for 0-4 h on day 7 of pseudopregnancy. Results showed that serum progesterone (P-4) concentrations declined in a time dependent manner. Western blot results revealed that ATF3 increased within 2 h post-PGF injection. Phosphorylated ERK1/2 (p-ERK) and JNK (p-JNK) increased within 30 min and then were gradually reduced in response to PGF. In contrast, the levels of phosphorylated p38 MAPK (p-p38) were not significantly altered. The immunostaining density for p-ERK decreased from the periphery to the center of the corpus luteum following treatment with PGF, while ATF3 was expressed uniformly in the nuclei of luteal steroidogenic cells. These results indicated that treatment with PGF in vivo could induce increases in MAPK phosphorylation, especially in p-ERK, which might be correlated with the increases in ATF3 expression and the decline in P-4 concentrations. To our knowledge, this is the first study to provide evidence for temporal relationships between MAPK activation and ATF3 expression during PGF-induced luteal regression in the rat. (C) 2015 Elsevier GmbH. All rights reserved.

关键词： 子宫内膜癌   浆液性癌   突变型P53   预后   激活转录因子3   SPEC-2细胞   增殖  

摘要： 背景子宫内膜癌是子宫内膜上皮来源的恶性肿瘤,属于女性生殖道三大恶性肿瘤之一,好发于老年妇女。随着人口老龄化、饮食结构和生活方式的改善,其发病率及死亡率在全球范围内呈现上升趋势,且发病年龄趋于年轻化。在欧美国家,子宫内膜癌发病率位于妇科恶性肿瘤首位,在我国位居第二位,但是近年来在北京、上海等发达城市其发病率已超过宫颈癌而位居妇科恶性肿瘤首位。其中浆液性癌是子宫内膜癌中恶性程度较高的一种病理类型,而关于子宫内膜浆液性癌的大宗病例研究少见报道。系统掌握子宫内膜浆液性癌的临床病理学特征、诊断及鉴别诊断,提高对此肿瘤生物学行为的认识,对于妇科、肿瘤科及病理科医师具有重要意义。目的探讨子宫内膜浆液性癌临床病理学特征、诊断、鉴别诊断及预后,进一步提高对该肿瘤的认识。方法回顾性分析烟台毓璜顶医院2005年1月至2013年12月期间确诊为子宫内膜浆液性癌患者的临床病理资料,患者均接受广泛子宫及双侧附件切除术加盆腔淋巴结清扫,术前均未做任何治疗,术后经组织病理学诊断为子宫内膜浆液性癌。对肿瘤组织进行雌激素受体、孕激素受体、突变型P53的免疫组织化学染色,统计分析雌激素受体、孕激素受体、突变型P53表达与临床病理学参数及预后情况的关系。计数资料采用x2检验,P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.本组33例子宫内膜浆液性癌占同期子宫内膜癌的比例为5.02%(33/672)。患者发病年龄44-73岁,中位年龄64岁。93.94%患者为绝经后女性(31/33)。肿瘤最大直径1-12cm,平均直径3.87cm。影像学检查以宫腔内占位多见(16/33,48.48%),其次表现为内膜不规则增厚(10/33,30.3%),仅少数患者表现为宫腔积液(7/33,21.21%)。临床症状多表现为绝经后阴道流血或流液(29/33,87.88%),3例患者表现为下腹疼痛或不适(3/33,9.09%),1例表现为外阴脱出肿物伴排尿困难(1/33,3.03%)。14例发生淋巴结转移(14/33,42.42%);19例患者肿瘤浸润深度<1/2肌层(19/33,57.58%);15例临床分期Ⅰ-Ⅱ期(15/33,45.45%),18例Ⅲ-Ⅳ期(18/33,54.55%)。其中浸润深度<1/2肌层的19例患者中有7例患者出现淋巴结转移(7/19,36.84%)。本组33例患者均获得随访,随访时间2-64个月,平均26.67个月,其中16例(16/33,48.48%)存活,17例(17/33,51.52%)患者死于本病。2.本组病例共同的组织学特点是肿瘤细胞呈复杂分支状的乳头结构、实性巢状或腺管状排列,乳头结构中央为纤维脉管轴心;肿瘤细胞体积大,边界不清,胞浆嗜酸性或粉染,核大小不一、形态不规则,扭曲分叶,染色质粗颗粒状,核仁显著嗜酸性,核分裂相易见。18例患者(18/33,54.54%)肿瘤组织内可见坏死;7例患者(7/33,24.24%)肿瘤组织内见砂粒体形成。3.子宫内膜浆液性癌中雌激素受体、孕激素受体及突变型P53阳性信号均定位于肿瘤细胞的细胞核。本组病例中27例患者雌激素受体、孕激素受体均为阴性表达(27/33,81.82%),2例(2/33,6.06%)雌激素受体(+)、孕激素受体(+),3例(3/33,9.09%)呈雌激素受体(-)、孕激素受体(+)表达模式,1例(1/33,3.03%)雌激素受体(+)、孕激素受体(-)表达;突变型P53免疫组化染色显示24例(24/33,72.73%)为阳性表达,9例为阴性表达(9/33,27.27%)。雌激素受体、孕激素受体、突变型P53表达差异与患者年龄、肿瘤大小、浸润深度、临床分期及淋巴结转移均无统计学意义(P>0.05)。4.在年龄、肿瘤大小、浸润深度、临床分期及淋巴结转移等因素中,仅淋巴结转移组中患者无病生存率具有显著差异(P<0.05)结论1.子宫内膜浆液性癌是一类少见的子宫内膜癌,以老年女性多见。绝经后阴道流血是常见的临床症状,影像学检查多表现为宫腔内息肉或占位。2.子宫内膜浆液性癌需要与低分化子宫内膜样腺癌、卵巢浆液性癌子宫内膜转移等多种恶性肿瘤鉴别,免疫组织化学染色具有一定帮助。3.子宫内膜浆液性癌为非激素依赖性肿瘤;p53基因突变与子宫内膜浆液性癌发生关系密切。4.子宫内膜浆液性癌生物学行为特殊,早期可发生淋巴结转移;患者预后差,淋巴结转移是预后不良因素。背景子宫内膜浆液性癌恶性程度高,死亡率占全部子宫内膜癌的50%,但子宫内膜浆液性癌确切的病因及发病机制尚不清楚,至今尚无针对性的治疗方法。基于上述情况,深入探讨子宫内膜浆液性癌的发病机制,寻找新的治疗靶点及切实有效的治疗方法,意义重大。子宫内膜浆液性癌的发生与p53基因突变密切相关。p53基因定位于人类第17号染色体短臂,编码393个氨基酸,根据氨基酸组成分为

关键词： Activating transcription factor 7   colorectal cancer prognosis   pathological stage   PROTEIN-TYROSINE-PHOSPHATASE   C-JUN   BINDING-PROTEIN   FAMILY   CELLS   GROWTH   TUMORS   PRL-1   ATF3   PHOSPHORYLATION  

摘要： Background: It is important to identify some tumor-related factors for early detection, treatment, and evaluation of prognosis in colorectal cancer (CRC). In our study, we inveatigated the clinical and prognostic role of activating transcription factor 7 (ATF7) in CRC. Materials and Methods: Expression of ATF7 was detected with immunohistochemistry in 72 cases with complete follow-up data and post-operation tissue specimens. Correlation between ATF7 and other clinicopathological factors was calculated with Chi-square test and the impact of ATF7 on survival were analyzed with Log-rank test and Cox regression models. Results: Among 72 cases, ATF7 expression was detected in 43 cases (59.7%) and 29 cases (40.3%) without ATF7 expression. The correlation between ATF7 expression and pathological stage was investigated (P = 0.041). The 5-year overall survival (OS) of with or without ATF7 expression was 79% versus 51% respectively (P < 0.001) and the 5-year progression free survival (PFS) was 74% versus 41% (P < 0.001). The media OS was 69 months versus 52 months (P = 0.002) and the media PFS was 65 months versus 42 months (P = 0.002). ATF7 expression and numbers of lymph nodes involvement were prognostic factors for OS according to univariated and multivariated analysis and for PFS it was ATF7 expression and lymph nodes involvement. Conclusion: It is negatively related between ATF7 expression and pathological stage and positive correlation with OS and PFS in CRC. ATF7 expression is a favorable factor for survival of patients with CRC.

关键词： 酒精性脂肪肝   原位灌流   kupffer细胞   ATF3   巨噬细胞极化  

摘要： 酒精性肝病(Alcoholic Hepatitis)是一种长期因大量饮酒从而导致的肝脏类疾病。通常脂肪肝为酒精性肝病的初期表现,进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。在我国,酒精性肝病目前是常见的肝脏疾病之一,给人民健康造成了严重的危害。近年来,在同期肝病住院患者中酒精性肝病所占的比例在不断攀升,因此对酒精性肝病的研究就显得尤其重要。枯否细胞(KCs)作为定居在肝脏内的巨噬细胞,在酒精性肝病的发病过程中起到了非常重要的作用。它具有吞噬功能的同时又具有分泌功能,因此它可以利用多种途径对肝脏造成损伤。由于巨噬细胞独特的可塑性和异质性,其可根据外在环境而发生功能和表型的改变。在巨噬细胞对外界做出应答的过程中,作一个为“适应响应性”基因,细胞利用ATF-3(ATF/环磷酸腺苷(cAMP)的反应元件结合蛋白(ATF/CREB)家族的转录因子3),以适应外和/或细胞内的变化。它可以调节巨噬细胞的炎症应答的作用和相关的信号通路,如TLR4及NF-κB,来对炎症起到一个负调控的作用。1.通过建立小鼠酒精性脂肪肝的模型,并采用肝脏原位灌流,分离出形态良好、具有生物学活性的枯否细胞(KCs),研究其在酒精性脂肪肝中的表型改变。采用Lieber-DeCarli液体饮食加一次急性酒精灌胃,建立小鼠酒精性脂肪肝模型。造模周期为16天,于第16天灌胃9小时后处死小鼠,取小鼠肝脏及血清及KCs。检测各组血清谷丙转氨酶/谷草转氨酶(ALT/AST),及肝匀浆及血清中总胆固醇/三酰甘油(tg/tc)水平变化和肝脏病理切片he及油红染色。选取原位灌流的方法分离kcs,流式细胞术分析肝脏内巨噬细胞表型及组成的改变。荧光实时定量pcr(q-pcr)检测组织及提取细胞中各细胞因子水平。alt/ast、tg/tc等反应肝损伤的指标模型组显著高于对照组,he及油红染色结果与之一致,表明小鼠酒精性脂肪肝模型建立成功。肝脏原位灌流每只小鼠细胞得率约在1.5×106.0×106个。以小鼠巨噬细胞表面标记分子f4/80及白细胞共同抗原cd45双标设门,流式细胞术分析f4/80和cd45双阳性细胞,在模型中肝脏固有cd68+细胞显著降低,并出现大量的浸润单核细胞。q-pcr结果显示,在肝组织及原代细胞中细胞因子,如肿瘤坏死因子(tnf-α)、白介素-6(il-6)、单核细胞趋化蛋白(mcp-1)水平显著升高。小鼠酒精肝模型建立成功,肝脏原位灌流法细胞得率较高,酒精性脂肪肝的发病可能与kcs构成、表型改变,与细胞因子升高介导外周单核细胞浸润有关。2.利用ifn-γ(10ng/ml)+lps(10ng/ml)诱导raw264.7细胞6h,il-4(15ng/ml)诱导raw264.7细胞48h,在细胞上建立m1及m2极化模型。运用westernblot和q-pcr检测诱导分型后的raw264.7细胞,m1及m2各型标志性蛋白inos,arg1的表达水平。q-pcr检测各组tnf-α、tgf-β、il-6、il-10mrna表达水平,elisa检测各组细胞培养上清中il-12及il-10表达水平。westernblot和q-pcr结果显示,ifn-γ(10ng/ml)+lps(10ng/ml)刺激6h后,m1型标志性蛋白inos水平明显升高,tnf-α、il-6mrna水平也明显升高;il-4(15ng/ml)刺激48h后,arg1水平升高且tgf-β、il-10mrna表达水平也明显升高。与此同时,elisa结果显示m1型细胞上清中il-12水平明显升高,而m2型中il-10水平也明显升高。***3对于巨噬细胞极化的影响。通过westernblot检测小鼠酒精性脂肪肝模型肝组织中atf3的表达。westernblot和q-pcr检测raw264.7细胞atf3,stat3以及磷酸化stat3的表达情况,用q-pcr检测tgf-β、il-10mrna表达水平,elisa检测各组细胞培养上清中IL-12及IL-10表达水平。利用LipofectamineTM 2000将特异性ATF3转染到RAW264.7内,下调ATF3的表达,降低其活性。实验结果发现,在小鼠酒精性脂肪肝模型中肝组织ATF3的表达水平明显下降。同时在IFN-γ(10 ng/ml)+LPS(10ng/ml),诱导的M1型及IL-4(15 ng/ml)诱导的M2型RAW264.7细胞中ATF3的表达在M2型中有显著升高,磷酸化STAT3表达水平升高。转染ATF3 siRNA后,明显抑制了M2型的极化,Arg1及磷酸化STAT3表达水平均降低。

关键词： 转录激活因子-3   MUC5AC   香烟烟雾   激活蛋白-1   白介素-6   白介素-8  

摘要： 背景：众所周知,粘液的过表达是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的重要病理特征。研究表明,香烟烟雾(cigarette smoke,CS)暴露与COPD的发生发展关系密切。气道粘液的过度分泌可引起气道阻塞,从而导致肺功能下降。转录激活因子3(Activating transcription factor3, ATF3)是一种参与细胞反应过程的适应性反应基因。研究显示其对炎症反应具有双向调节作用,通过调节不同的靶基因从而加强或抑制炎症反应,机体会根据应激条件的性质(如应激的类型和持续的时间)和应激信号影响靶组织/细胞类型的不同而发生不同的反应。据报道,气道粘液的过表达也是气道炎症反应的一种表现形式。然而,迄今为止国内外尚未有研究探讨气道上皮细胞中ATF3的表达在调控香烟烟雾诱导的气道粘液分泌中的作用。 目的：本课题拟探讨ATF3是否参与调控COPD中MUC5AC(气道粘液的一种重要组成成分)的表达,并探索其机制。 方法：检测香烟烟雾暴露对人体气道上皮细胞HBE(正常气道上皮细胞系),NCI-H292细胞(人肺粘液表皮样癌来源细胞系)和MTEC(小鼠原代气道上皮细胞)的ATF3和MUC5AC的表达影响。利用ATF3小干扰RNA(ATF3small-interfering RNA, ATF3siRNA)和ATF3过表达质粒探讨ATF3是否与香烟烟雾诱导的MUC5AC的表达有关。利用实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, Q-PCR),蛋白质印迹法(Western Blot, WB)和免疫荧光(immunofluorescence, IF)检测ATF3的缺失或过表达是否影响香烟烟雾诱导的MUC5AC的表达。进一步利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)及染色体免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, CHIP)法验证假设,即ATF3是否通过激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)间接结合到MUC5AC启动子区域从而调控其表达。在体内研究中,我们用通过CSE气道滴注和熏烟制造ATF3基因敲除小鼠(ATF3-/-mice)的COPD模型,从而验证ATF3是否参与调控香烟烟雾诱导的气道粘液的表达。 结果： 1.体外实验中,香烟烟雾能显著地诱导气道上皮细胞HBE, NCI-H292和MTEC中ATF3和MUC5AC的表达。当用ATF3siRNA特异性地敲除ATF3这个基因后,香烟烟雾诱导的MUC5AC的表达显著下降,而白介素-6(interleukin-6, IL-6)和白介素-8(interleukin-8, IL-8)的表达明显增高。然而,ATF3过表达质粒未对香烟烟雾诱导的MUC5AC的表达产生明显影响。这一现象提示,ATF3可能并非直接调控MUC5AC的表达。Co-IP和CHIP实验结果证实ATF3通过AP-1信号通路作用于MUC5AC的启动子区域,从而间接调控香烟烟雾诱导的气道MUC5AC的表达。 2.体内实验中,CSE气道滴注野生型小鼠(Wild Type mice, WT mice)大气道MUC5AC的表达较对照组明显升高,然而在ATF3-/-小鼠中气道MUC5AC的表达并未明显下降。这和体内的结果并不一致。然而,在ATF3-/-小鼠模型组中,气管及血管周围中性粒细胞的浸润明显增加。(体内模型需进一步参照熏烟小鼠的结果)。 结论：本研究结果提示ATF3通过AP-1促进香烟烟雾诱导的气道MUC5AC的表达,同时ATF3能抑制香烟烟雾诱导的IL-6, IL-8的表达。ATF3在调节COPD气道粘液高分泌和炎症反应中具有重要作用,研究结果为临床的靶向治疗提供重要参考。

关键词： 青光眼   视网膜神经节   转录激活因子3   细胞凋亡  

摘要： 目的：<br>　　青光眼(Glaucoma)是一组疾病晚期以特征性视神经凹陷和视野缺损为共同表现的不可逆性、致盲性眼病，严重危害人类的健康和生命质量，影响全球大约70万人。以往，青光眼的早期诊断依赖于眼压的升高，视野的损害和眼底的改变三大指标，但是现已证实，在青光眼患者视野出现特征性改变之前，其RGC轴突的30％-50％已经受损，并且只有大量视网膜神经纤维层(retinal nerve fiberlayer，RNFL)缺损后，临床才能检测到相应的眼底及视野的改变。由此可见，探讨青光眼损伤的早期机制对于疾病的诊断和治疗意义重大，尤其对于正常眼压性青光眼和开角型青光眼。目前普遍认为高眼压(intraocular pressure，IOP)是加速青光眼中视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)死亡的最显著危险因素，体外培养的细胞系给予高液体静压(elevated hydrostatic pressure，EHP)通常被用来作为青光眼的细胞模型。已有报道研究证实在高眼压大鼠模型和青光眼患者中RGCs的死亡方式为凋亡。细胞凋亡(apoptosis)是指生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下，其死亡途径被激活，并在有关基因的调控下发生的程序性死亡过程。细胞凋亡涉及一系列复杂的生化反应，是一个需要一系列酶参与的级联反应，涉及不同基因的表达及调控、信号传导。转录激活因子3(activating transcription factor3，ATF3)作为压力应答反应的早期基因，有研究显示，在大鼠的HIOP和鼠视网膜缺血再灌注模型中，其mRNA表达在损伤早期明显上调，且与损伤程度成线性正相关，而与此同时，尚未检测到凋亡信号标志物的明显改变。另外，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinases，MAPKs)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，有研究证实，MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应（如细胞增殖、分化、转化及凋亡等）。研究表明，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNKs)的激活可诱导细胞发生凋亡，同时JNKs信号通路是轴突损伤后引起RGCs死亡的主要的早期信号通路。综上所述，为了明确压力引起RGCs凋亡的早期分子机制，同时探索ATF3和MAPKs尤其是JNKs通路与青光眼早期损伤的关系，设计并展开了研究。首先本实验通过体外培养RGC-5细胞，给予不同大小的静水压处理，检测其凋亡率和各种因子的表达，明确能够引起RGC-5早期凋亡的压力值和作用时间;然后进一步通过给予ATF3siRNA和不同浓度的JNKs通路抑制剂(SP600125)干扰后，再检测细胞早期凋亡率和相关指标的表达，明确二者在静水压引起的RGCs早期凋亡中的作用，进一步明确静水压引起RGC-5早期凋亡的分子机制。具体实验分为:<br>　　1、时间-压力-早期凋亡曲线的描绘:<br>　　通过给予体外培养的RGC-5不同的静水压处理，分别为0、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70mmHg，明确引起RGC-5早期凋亡的压力值。<br>　　2、ATF3 siRNA的作用研究:<br>　　选取有效的ATF3 siRNA干扰RGC-5中ATF3 mRNA的表达，探讨siRNA ATF3对RGC-5早期凋亡及ATF3、c-Jun和Jun-B表达的影响。<br>　　3、JNKs通路抑制剂的作用研究:<br>　　在前两部分实验的基础上，通过应用特异性JNKs通路抑制剂SP600125，深入探讨静水压引起RGC-5早期凋亡的机制和ATF3、c-Jun和Jun-B的表达变化。<br>　　方法：<br>　　1、时间-压力-凋亡曲线的描绘:<br>　　体外培养RGC-5，给予不同的静水压处理24小时，通过流式细胞仪检测早期凋亡率，绘制时间-压力-凋亡曲线，明确引起细胞凋亡的静水压值，Real-time PCR检测ATF3、Jun-B和c-Jun mRNA的表达，Western Blot和免疫细胞组化检测ATF3、Jun-B和c-Jun蛋白的表达。<br>　　2、ATF3 siRNA的作用研究:<br>　　构建三种不同siRNA，Real-time PCR检测siRNA和lipo2000的用量和有效干扰ATF3 mRNA表达的siRNA，根据第一部分实验选取的压力值瞬时转染，用流式细胞仪检测早期凋亡率，Real-time PCR、Western Blot检测ATF3