关键词： 内皮炎症   功能紊乱   内皮细胞   ATF3蛋白   转录激活因子3   SUMO化   血管紧张素Ⅱ  

摘要： 研究背景与目的:随着研究的深入，蛋白质翻译后修饰在心血管疾病中的作用也逐渐被揭示。SUMO化(small ubiquitin-related modification，SUMOylation)作为蛋白质翻译后修饰的一种，是类似于泛素化的一种酶级联反应，因此也称作类泛素化。它的基本过程是，SUMO小分子通过酶促反应共价结合到靶蛋白的赖氨酸位点上，进而调控靶蛋白的活性，功能，细胞定位等等。同时蛋白质的SUMO化也是一个可逆的过程。转录激活因子3(activating transcription factor3，ATF3)是一种适应性的转录因子，可以被许多外界刺激所诱导进而参与疾病的发生。内皮细胞作为血管的第一道屏障，在维持血管稳态中发挥关键性作用。现有的研究多聚焦在ATF3蛋白水平的变化影响了细胞的功能等等，但ATF3 SUMO化的功能研究还不明确。我们研究发现在血管活性物质AngiotensinⅡ(AngⅡ)的作用下，内皮细胞中的ATF3 SUMO化水平升高，而SUMO化这种蛋白质翻译后修饰是否在AngⅡ诱导的内皮炎症和内皮功能紊乱中发挥作用还不清楚。因此本研究的目的旨在:1、探讨ATF3 SUMO化在体内和体外内皮细胞中的发生。2、探讨ATF3SUMO化在内皮细胞中的作用。\n 研究方法与结果:体外培养的脐静脉内皮细胞系(HUVECs)，加入AngⅡ刺激后ATF3和SUMO1蛋白表达量升高。同时，我们通过免疫荧光和En face染色发现在AngⅡ诱导的高血压小鼠的胸主动脉的内皮细胞中，ATF3和SUMO1的表达量也升高了，而且共定位显示两者表达位置一致。进一步，我们通过HUVECs的免疫共沉淀(co-IP)实验发现，ATF3在AngⅡ的刺激下可以被SUMO1结合发生SUMO化，且发生的位点是ATF3的第42位赖氨酸。ATF3蛋白水平的升高不伴有mRNA水平的升高提示我们ATF3的SUMO化可能与ATF3的稳定性有关。因此我们检测了AngⅡ刺激的HUVECs中沉默SUMO1基因后ATF3的表达量，结果显示ATF3的表达不再被AngⅡ所调节。此外，泛素小分子ubiquitin和SUMO1同时过表达时，我们发现ATF3优先与SUMO1结合而逃避了泛素化降解这一过程。接着我们探索了ATF3 SUMO化在内皮炎症和内皮功能紊乱方面的作用。结果显示ATF3和其他的bZIP蛋白一起参与了内皮炎症的发生，并且ATF3SUMO化可以调控内皮一氧化氮的产生。在血管环实验中，SUMO化抑制剂银杏酸(GA)有效地改善了AngⅡ诱导的高血压小鼠主动脉的舒张功能。\n 研究结论:本研究发现AngⅡ可以在体内和体外的内皮细胞中上调ATF3 SUMO化水平。SUMO化增加了ATF3蛋白在体内的稳定性。SUMO化的ATF3的参与了内皮炎症和内皮功能紊乱的发生。

关键词： ACTIVATING TRANSCRIPTION FACTOR-3  

关键词： 生长阻滞和DNA损伤基因45(Gadd45)   激活转录因子3(ATF3)   荧光素酶报告质粒   启动子活性  

摘要： 目的 :构建大鼠生长阻滞及DNA损伤诱导基因45(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 45,Gadd45)β/γ启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在大鼠肾小球系膜细胞(glomerular messangial cells,GMCs)中过表达激活转录因子3(activating transcription factor 3,ATF3)后分别对大鼠Gadd45β/γ基因启动活性的影响。同时筛选其可能的ATF3结合位点。方法:采用PCR技术,将扩增出的大鼠Gadd45β基因启动子全长(-1 105^+236 nt)和Gadd45γ基因启动子全长(-913^+72nt)分别插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得Gadd45β/γ基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-Gadd45β/γ-FL),再将p GL3-Gadd45β/γ-FL分别与课题组前期构建的大鼠野生型ATF3过表达质粒(p IRES2/ATF3)共转染GMCs,检测其荧光素酶活性,以确定ATF3对Gadd45β/γ基因的启动作用。另用生物信息学软件预测Gadd45β/γ基因启动子上ATF3潜在的结合位点,并据此构建4个Gadd45β和3个Gadd45γ基因启动子截短片段的荧光素酶报告质粒。将Gadd45β/γ基因启动子全长和各截短片段的荧光素酶报告质粒与p IRES2/ATF3共转染GMCs,再行荧光素酶活性测定,以筛选ATF3的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠Gadd45β/γ基因启动子(全长和截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-Gadd45β/γ-FL分别和p IRES2/ATF3共转染GMCs发现,Gadd45β/γ基因启动子活性均显著增加。而将Gadd45β启动子全长及4个截短质粒分别与p IRES2/ATF3共转染GMCs后显示,p GL3-Gadd45β-4的启动活性显著低于p GL3-Gadd45β-FL、p GL3-Gadd45β-1、p GL3-Gadd45β-2和p GL3-Gadd45β-3。提示ATF3可能结合在Gadd45β基因启动子的(-146^+23 nt)区域。同样,将Gadd45γ启动子全长及3个截短质粒分别与p IRES2/ATF3共转染GMCs后显示,p GL3-Gadd45γ-2、p GL3-Gadd45γ-3的启动活性显著低于p GL3-Gadd45γ-FL和p GL3-Gadd45γ-1。提示ATF3可能结合在Gadd45γ基因启动子的(-456^-61 nt)区域,且这段区域可能包含1个以上ATF3结合位点。结论:成功构建了大鼠Gadd45β/γ基因启动子全长及各截短片段荧光素酶报告质粒,并初步确定了ATF3在Gadd45β/γ基因启动子上的结合区域。

关键词： 炎症反应   重组高密度脂蛋白   载脂蛋白   突变体   活化转录因子3   基因表达  

摘要： 目的：ATF3在抑制炎症信号中通过抑制TLR的产生而发挥重要作用，高密度脂蛋白（HDL）或其主要蛋白成份 ApoA-I具有显著的抗炎症作用。本研究探讨载脂蛋白 A-Ⅰ（ApoA-Ⅰ）及其半胱氨酸突变体重组高密度脂蛋白对ATF3表达量的影响。\n 方法：⑴利用pET原核表达系统表达载脂蛋白A-Ⅰ74，A-Ⅰ228，A-Ⅰm和A-ⅠWT，亲和层析纯化后，加入DPPC，制作成重组高密度脂蛋白。⑵培养RAW264.7细胞，LPS刺激诱导炎症细胞模型，然后给于重组高密度脂蛋白干预，ELISA试剂盒检测炎症因子IL-6和TNF-α的表达水平，观察细胞形态学的改变，RT-PCR和western blotting检测细胞中转录激活因子ATF3mRNA和蛋白表达水平的变化。\n 结果：细胞形态学观察发现，与正常组比较，LPS组与 rHDL228组细胞形态趋向于巨噬细胞化并出现降解，rHDL74、rHDLM和rHDLWT对LPS刺激的细胞有不同的保护作用。ELISA检测发现，rHDL74、 rHDLm和rHDLwt中TNF-ɑ与IL-6的表达水平恢复到接近空白对照组水平，rHDL228组TNF-ɑ与IL-6水平较较空白对照组明显升高（p<0.01）。rHDL74、 rHDLM和rHDLWT中TNF-ɑ与IL-6水平较LPS组明显降低（P<0.01）。Western blotting结果显示,与对照组相比，LPS组与rHDL228组ATF3的表达水平下降，具有显著性差异（p<0.01）。rHDL74、rHDLM和rHDLWT组表达水平明显升高且差异显著(p<0.05)。\n 结论：重组高密度脂蛋白rHDL74、rHDLWT、rHDLM促进ATF3在mRNA和蛋白水平上的表达。而rHDL228下调其表达。

关键词： coronary heart disease   myocardial ischemia reperfusion injury   activating transcription factor 3   Toll-like receptor 4   GENE-EXPRESSION   ATF3   PROTECTS   INFLAMMATION   FAMILY   HEART  

摘要： Coronary heart diseases, particularly acute coronary syndrome, have increased in morbidity and mortality in recent decades. Percutaneous coronary intervention, coronary artery bypass grafting and thrombolytic agents are effective strategies to rescue the infarcted myocardium. In addition to acute myocardial infarction, the resulting myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI) leads to serious secondary injury of the heart. Studies have demonstrated that activating transcription factor (ATF)/cyclic adenosine monophosphate response element binding family member ATF3 had a negative regulatory role in IRI, particularly in the kidney, cerebrum and liver. The present review expounded the expression characteristics of ATF3 and its protective effects against MIRI, providing a theoretical basis for the overexpression of ATF3 in the myocardium as a promising gene-therapeutic strategy for MIRI.

关键词： akt   ATF3   PTEN   prostate cancer   ACTIVATING TRANSCRIPTION FACTOR-3   ANDROGEN RECEPTOR   P53   UBIQUITINATION  

摘要： Stress response mediator activating transcription factor 3 (ATF3) engages in diverse oncogenic pathways including the androgen receptor signaling essential for prostatic proliferation. In line with frequent downregulation of ATF3 expression in human prostate cancers, we have provided the first genetic evidence supporting the role of ATF3 as a tumor suppressor in a subset of prostate cancers with PTEN dysfunction.

关键词： 尿道下裂   ATF3   包皮  

摘要： 目的:检测散发性单纯性尿道下裂患者包皮组织中激活转录因子3(Activating transcription factor 3,ATF3)的表达情况,探索ATF3与散发性单纯性尿道下裂之间的关系。方法:1、标本收集:实验组标本为散发性单纯性尿道下裂患者在尿道成形术中的多余的包皮组织(共35例,其中轻度10例,中度15例,重度10例),对照组标本为单纯包皮过长(包括包茎)患者在包皮环切术中去除的多余的包皮组织(共20例)。2、通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测实验组和对照组ATF3mRNA的表达情况。3、通过免疫组织化学方法检测实验组和对照组ATF3蛋白的表达情况。4、统计学处理:实验过程中采集的数据均进行了严格检查,重复测量对偏出均值3个标准差的数据进行删除。采用SPSS12.0统计学软件进行数据录入,构建数据库。计数资料使用(均值±标准差)的形式表示,计量资料之间的比较采用F/t检验。计数资料用阳性例数或阳性率(%)表示,阳性率之间的比较用卡方检验。检验水准α取值0.05,检验概率为双侧概率。结果:通过RT-PCR方法测得散发性单纯性尿道下裂患者包皮组织中ATF3 mRNA的相对表达量为:0.54±0.06,对照组的包皮组织中ATF3 mRNA的相对表达量为:0.44±0.07,从结果中可以得出在散发性单纯性尿道下裂患者的包皮组织中ATF3的表达情况比正常的包皮组织中明显增加,两组结果比较(t=5.89,P=0.00),差异有统计学意义。比较不同严重程度中尿道下裂患者ATF3mRNA相对表达量,不同严重程度相对表达量差异并不显著(F=0.13,P=0.88)。通过免疫组织化学方法测得ATF3蛋白在散发的单纯性尿道下裂中的阳性表达率为:85.7%(30/35),对照组中阳性率为:15.0%(3/20),两组人群比较,ATF3蛋白阳性表达率差异显著(χ2=7.95,P=0.01),具有统计学意义。比较不同严重程度中尿道下裂患者免疫组化检测ATF3蛋白阳性表达率情况发现,不同严重患者ATF3蛋白阳性表达率呈现递增关系,但是统计学分析差异不明显(χ2=0.65,P=0.72)。结论:在散发性单纯性尿道下裂患者的包皮组织中ATF3的表达比单纯包皮过长(包括包茎)患者的包皮组织中明显增多,提示ATF3和散发性单纯性尿道下裂存在着密切的关系。为将来研究ATF3在尿道下裂中产生的相关信号转导通路提供相关实验基础,及研究尿道下裂的发病机制提供理论依据。

关键词： 热应激   孕酮   大鼠   黄体退化   NR4A1   HSP70   MAPK   ATF3   PKB  

摘要： 热应激影响雌性动物的许多生殖功能,如卵泡发育、卵母细胞成熟和早期胚胎发育。目前,研究表明热应激通过干扰动物的生殖内分泌等发挥作用。同时,热休克反应依赖于细胞信号途径的调控。因此,本论文以假孕大鼠为研究对象,建立热应激模型。应用ELISA、Western blot和IHC等方法,研究孕酮合成及分解代谢相关蛋白及相关信号通路元件的表达模式,以揭示热应激影响卵巢黄体退化的作用机制,为研究热应激影响雌性动物繁殖性能提供理论依据。主要内容如下:1热应激对大鼠黄体孕酮合成及分解代谢相关蛋白表达的影响为探讨热应激对黄体孕酮合成及分解代谢通路相关蛋白表达的影响,本研究采用PMSG/hCG(DO)联合处理70只(28日龄)大鼠诱导假孕,然后随机分为非热应激(NHS)和热应激(HS)两组。每天在相同时间,将HS组置于40℃热应激2h。每天测定大鼠的饮水量、采食量及热应激前后的直肠温度。假孕第3天,热应激结束后2h,采集两组大鼠的血清和卵巢组织(n=5)。假孕第7天,热应激结束后2h,处死或PGF分别处理0h、1h、2h、8h或24h后处死,然后收集血清和卵巢组织(n=5)。应用ELISA检测血清孕酮浓度、Western blot和IHC检测孕酮合成及分解代谢通路相关蛋白的表达。ELISA结果表明,热应激对黄体形成过程中孕酮浓度无显著影响。Westernblot结果表明热应激对黄体形成过程中StAR、P450scc和3βHSD表达无显著影响,但PKA磷酸化底物在第3天表达高于第7天(P<0.05)。PGF降低了两组大鼠血清孕酮浓度,且热应激抑制了 PGF诱导的孕酮浓度下降(P<0.05);PGF或热应激单一处理均对PKA磷酸化底物、StAR、P450scc、3βHSD及NR4A1-F表达无显著影响,但均诱导NR4A1-S表达上调(P<0.05),且热应激降低PGF诱导的NR4A1-S表达(P<0.05);IHC结果表明,PKA磷酸化底物主要在黄体细胞的细胞核中表达,而StAR、P450scc、3βHSD和NR4A1-F均在黄体细胞的细胞质表达。上述结果提示,热应激降低假孕大鼠PGF诱导的黄体退化过程中NR4A1-S的表达,NR4A1-S可能参与调控黄体退化过程中孕酮的分解代谢。2热应激对大鼠黄体退化中ERK1/2磷酸化及HSP70与ATF3表达的影响为研究热应激对PGF诱导的黄体退化过程中HSP70及MAPK/ATF3和PKB信号通路元件表达的影响,以假孕大鼠为试验对象,构建热应激模型(同试验1)。假孕第7天,热应激结束2h后,大鼠以PGF分别处理0h、1 h、2h、8h或24h后处死,收集卵巢组织。应用Western blot和IHC检测HSP70及MAPK/ATF3和PKB信号通路元件蛋白的表达。Western blot结果表明:与NHS组相比,热应激没有改变HSP70和p-ERK-1/2的基础水平,但热应激促进PGF诱导的HSP70和p-ERK-1/2水平的上升(P<0.05);热应激促进p-p38MAPK基础水平的上调(P<0.05);在PGF处理2h后,ATF3的表达量显著上升,且热应激抑制PGF诱导的ATF3表达(P<0.05)。对于PKB通路,在PGF处理8 h和24 h后,p-Akt(Thr308/Ser473)的表达量显著降低(P<0.05),但热应激对其没有显著影响。这些结果提示,在PGF诱导的假孕大鼠黄体退化过程中,热应激促进HSP70和p-ERK-1/2表达,抑制ATF3的表达,这可能有助于减少PGF诱导孕酮的下降,维持黄体功能。

关键词： ATF3   dPRL   FOXO1   miR-135b   蜕膜化   人子宫内膜间质细胞  

摘要： 目的探究转录因子ATF3参与调控8-Br-cAMP联合MPA诱导人子宫内膜间质细胞蜕膜化泌乳素分泌的分子机制。方法通过免疫组化方法明确ATF3在子宫内膜中表达及定位。采用Western blotting实验调查胚胎反复种植失败女性与胚胎一次移植成功女性分泌期子宫内膜ATF3的表达情况。利用Western blotting、Q-PCR对应检测8-Br-cAMP联合MPA诱导子宫内膜间质细胞体外蜕膜化后ATF3与miR-135b表达变化。以Q-PCR、ELFA方法调查AIF3和miR-135b对间质细胞蜕膜化泌乳素(decidual prolactin,dPRL)表达、分泌的调控作用;细胞免疫荧光实验分析二者对间质细胞形态的影响。采用染色质免疫共沉淀、Q-PCR实验探究ATF3对miR-135b的调控作用。运用 Westernblotting、Q-PCR 实验验证 ATF3 及 miR-135b 对 FOXO1蛋白及mRNA的调控作用。结果ATF3表达于人子宫内膜间质细胞及上皮细胞。胚胎反复种植失败患者(n=31)分泌期子宫内膜组织中ATF3表达较胚胎一次移植成功女性(n=29)显著降低(P<0.001)。8-Br-cAMP联合MPA诱导间质细胞ATF3 mRNA早期表达增多,于lh升高5倍;ATF3蛋白表达也相应增高,于16 h增加4倍以上。无外源激素存在时,腺病毒介导ATF3的过表达以浓度依赖方式显著增加人子宫内膜间质细胞蜕膜化标志分子dPRL的表达与分泌(P<0.01),同时促进间质细胞骨架蜕膜化样改变;功能缺失实验进一步验证沉默内源性ATF3表达可抑制8-Br-cAMP联合MPA诱导下蜕膜化间质细胞分泌的dPRL至60%(P<0.01),并使细胞呈去蜕膜样变。miR-135b在间质细胞蜕膜化过程中表达显著降低,16 h减少至30%(P<0.001)。MiR-135b与FOXO1 3'UTR区种子序列结合,过表达miR-135b使hESCs中FOXO1蛋白表达减少至30%,并显著抑制蜕膜化间质细胞dPRL分泌(P<0.01)。ATF3结合miR-135b启动子区,抑制miR-135b转录(P<0.001),上调FOXO1蛋白表达,修复miR-135b导致的蜕膜细胞dPRL分泌减少,促进细胞蜕膜化进程。结论人子宫内膜间质细胞体外蜕膜化过程中,ATF3表达明显升高而miR-135b表达显著降低。miR-135b下调FOXO1表达,过表达ATF3转录抑制miR-135b,促进FOXO1表达,参与调控8-Br-cAMP联合MPA诱导人子宫内膜间质细胞体外蜕膜化过程中dPRL的表达。ATF3调控子宫内膜蜕膜化过程机制的研究,有望为提高胚胎种植率和妊娠成功率提供新的分子靶点和治疗方向。

关键词： Thy-1肾炎(Thy-1N)   E1A结合蛋白p300(p300)   早期生长应答蛋白-1(Egr-1)   激活转录因子3(ATF3)   生长阻滞及DNA损伤诱导基因45(Gadd45)   慢病毒载体(LV)   凋亡   增生  

摘要： 第一部分Thy-1肾炎大鼠肾组织中乙酰基转移酶(p300)、转录因子(Egr-1、ATF3)及凋亡基因(Gadd45α/β/γ)的表达情况目的:检查Thy-1肾炎(Thy-1 nephritis，Thy-1N)大鼠肾组织中E1A结合蛋白p300(E1A binding protein p300,p300)、早期生长应答蛋白-1(early growth response protein-1,Egr-1)、激活转录因子 3(activating transcription factor 3,ATF3)和生长阻滞及DNA损伤诱导基因45(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 45,Gadd45)α/β/γ的表达情况,并进一步测定 p300与Egr-1或ATF3的相互作用及Egr-1和ATF3的乙酰化水平。方法:给大鼠尾静脉注射抗胸腺细胞血清(anti-thymocyte serum，ATS)复制Thy-1N模型,在肾炎发病的不同时间点(0h、1h、2h、3h、6h、12h)取大鼠肾皮质,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR，qRCR)和蛋白质印迹(western blot，WB)实验检查Thy-1N大鼠肾组织中p300、Egr-1、ATF3和Gadd45α/β/γ的mRNA和蛋白表达水平。然后,通过免疫共沉淀(immunoprecipitation，IP)和WB检查大鼠Thy-1N发病不同时间点肾组织中p300与Egr1或ATF3的相互作用及Egr1和ATF3的乙酰化水平。结果:Thy-1N大鼠肾组织中,p300、Egr-1、ATF3和Gadd45α/β/γ表达水平均以时间依赖性的方式逐渐升高,且在Thy-1N发病1h和3h时(p300为3h,余下因子为1h)mRNA丰度达到峰值,蛋白水平则在2h和3h时(Egr-1为2h,其余蛋白为3h)达到高峰。此外,实验还发现,Thy-1N大鼠肾组织中p300能够与ATF3发生相互作用,且在3h时作用最为显著,但实验并未测到p300与Egr-1间的相互作用。与此同时,ATF3的乙酰化水平也以时间依赖性的方式升高,并在3h达到高峰,但实验亦未测到Egr-1的乙酰化修饰。结论:在Thy-1N大鼠的肾组织中,p300、Egr-1、ATF3和Gadd45α/β/γ的表达均明显升高,且p300能够与ATF3相互作用并使其发生乙酰化。第二部分沉默肾组织中p300、Egr-1、ATF3和Gadd45β/γ基因后对Thy-1肾炎大鼠GMC凋亡和增生病变的影响目的:研究沉默肾组织中的p300、Egr-l、ATF3和Gadd45β/γ基因后对Thy-1N大鼠GMC凋亡和后续增生病变及尿蛋白分泌的影响。方法:分别包装p300、Egr-l、ATF3和Gadd45β/γ shRNA慢病毒载体,形成LV-shp300、LV-shEgr-1、LV-shATF3 和 LV-shGadd45β/γ,通过侵染细胞实验验证其相应慢病毒滴度,并确定其侵染大鼠GMC的能力。然后,通过大鼠肾动脉灌注术将 LV-shp300、LV-shEgr-1、LV-shATF3 和 LV-shGadd45β/γ 悬液分别导入大鼠两侧肾脏,再经尾静脉注射抗胸腺细胞血清(ATS)复制Thy-1N模型。分别在大鼠注射ATS后2h、3h和7d取大鼠肾组织,并留取7d时的24h尿液。通过蛋白质印迹(WB)检查各组大鼠肾组织中相应p300、Egr-l、ATF3和Gadd45β/γ的蛋白表达水平以验证其干扰效果。在确定了相关蛋白能被成功干扰后再用WB检查沉默肾内p300、Egr-1和ATF3后,其肾组织中凋亡相关蛋白Gadd45β/γ的表达情况。另采用免疫共沉淀(IP)和WB实验测定沉默肾内p300后对Thy-1N大鼠肾组织中ATF3乙酰化水平的影响。此外,利用病理学实验技术检查不同处理的Thy-1N大鼠发病3h及7d时,其肾组织的相关病理学改变,并测定各组大鼠7d时的24h尿蛋白总量。结果:包装的 LV-shp300、LV-shEgr-1、LV-shATF3 和 LV-shGadd45β/y 能够侵染大鼠GMC。利用大鼠肾动脉灌注术将LV-shRNAs注入大鼠肾脏,沉默相应p300、Egr-1和ATF3后,Thy-1N大鼠肾组织中凋亡相关蛋白Gadd45β/γ的表达水平显著降低。同样,在干扰了 p300后,Thy-1N大鼠肾组织中的ATF3乙酰化水平也明显下调。此外,沉默相应p300、Egr-1、ATF3和Gadd45β/y后,Thy-1N大鼠发病3h时,其肾组织内肾小球的凋亡细胞数大量减少,并在Thy-1N大鼠发病第7d时,肾组织内GMC增生和细胞外基质(ECM