关键词： ACTIVATING TRANSCRIPTION FACTOR-3   CELL-DEATH   CYSTINE/GLUTAMATE ANTIPORTER   CANCER-CELLS   RESPONSE GENE   EXPRESSION   P53   INDUCTION   ROLES   ANGIOGENESIS  

摘要： The amino acid antiporter system Xc(-) is important for the synthesis of glutathione (GSH) that functions to prevent lipid peroxidation and protect cells from nonapoptotic, iron-dependent death (i.e., ferroptosis). While the activity of system Xc(-) often positively correlates with the expression level of its light chain encoded by SLC7A11, inhibition of system Xc(-) activity by small molecules (e.g., erastin) causes a decrease in the intracellular GSH level, leading to ferroptotic cell death. How system Xc(-) is regulated during ferroptosis remains largely unknown. Here we report that activating transcription factor 3 (ATF3), a common stress sensor, can promote ferroptosis induced by erastin. ATF3 suppressed system Xc(-), depleted intracellular GSH, and thereby promoted lipid peroxidation induced by erastin. ATF3 achieved this activity through binding to the SLC7A11 promoter and repressing SLC7A11 expression in a p53-independent manner. These findings thus add ATF3 to a short list of proteins that can regulate system Xc(-) and promote ferroptosis repressed by this antiporter.

关键词： NR5A1   ATF3   interaction   transcriptional activity   SUMOylation   phosphorylation   NUCLEAR RECEPTOR   FACTOR-I   SUMO MODIFICATION   TARGET GENES   EXPRESSION   SUMOYLATION   SUPPRESSES   PROSTATE   SYNERGY   DAX-1  

摘要： Steroidogenic Factor 1 (SF-1/NR5A1), an orphan nuclear receptor, is important for sexual differentiation and the development of multiple endocrine organs, as well as cell proliferation in cancer cells. Activating transcription factor 3 (ATF3) is a transcriptional repressor, and its expression is rapidly induced by DNA damage and oncogenic stimuli. Since both NR5A1 and ATF3 can regulate and cooperate with several transcription factors, we hypothesized that NR5A1 may interact with ATF3 and plays a functional role in cancer development. First, we found that NR5A1 physically interacts with ATF3. We further demonstrated that ATF3 expression is up-regulated by NR5A1. Moreover, the promoter activity of the ATF3 is activated by NR5A1 in a dose-dependent manner in several cell lines. By mapping the ATF3 promoter as well as the site-directed mutagenesis analysis, we provide evidence that NR5A1 response elements (-695 bp and -665 bp) are required for ATF3 expression by NR5A1. It is well known that the transcriptional activities of NR5A1 are modulated by post-translational modifications, such as small ubiquitin-related modifier (SUMO) modification and phosphorylation. Notably, we found that both SUMOylation and phosphorylation of NR5A1 play roles, at least in part, for NR5A1-mediated ATF3 expression. Overall, our results provide the first evidence of a novel relationship between NR5A1 and ATF3.

关键词： NUCLEOTIDE EXCISION-REPAIR   XERODERMA-PIGMENTOSUM   DNA-REPAIR   PROTEIN   UV   DEGRADATION   DEFICIENCY   MUTATIONS   CSB/ERCC6   CDK5RAP2  

摘要： Cockayne syndrome (CS) is a rare genetic disorder caused by mutations (dysfunction) in CSA and CSB. CS patients exhibit mild photosensitivity and severe neurological problems. Currently, CS diagnosis is based on the inefficiency of CS cells to recover RNA synthesis upon genotoxic (UV) stress. Indeed, upon genotoxic stress, ATF3, an immediate early gene is activated to repress up to 5000 genes encompassing its responsive element for a short period of time. On the contrary in CS cells, CSA and CSB dysfunction impairs the degradation of the chromatin-bound ATF3, leading to a permanent transcriptional arrest as observed by immunofluorescence and ChIP followed by RT-PCR. We analysed ChIP-seq of Pol II and ATF3 promoter occupation analysis and RNA sequencing-based gene expression profiling in CS cells, as well as performed immunofluorescence study of ATF3 protein stability and quantitative RT-PCR screening in 64 patient cell lines. We show that the analysis of few amount (as for example CDK5RAP2, NIPBL and NRG1) of ATF3 dependent genes, could serve as prominent molecular markers to discriminate between CS and non-CS patient's cells. Such assay can significantly simplify the timing and the complexity of the CS diagnostic procedure in comparison to the currently available methods.

关键词： 宫颈癌   激活转录因子3   临床病理因素   预后  

摘要： 目的分析激活转录因子3(activating transcription factor 3,ATF3)表达与宫颈癌临床病理因素及预后的关系。方法收集180例在青岛市市立医院住院治疗的宫颈癌患者临床病理资料,进行激活转录因子3蛋白免疫组化分析,并对180例入组的宫颈癌患者进行5年跟踪随访,分析ATF3表达情况对宫颈癌患者5年总生存率及无进展生存率的影响。结果ATF3表达与宫颈癌的临床分期、淋巴结转移、脉管浸润、新辅助化疗相关(P<0.05),与患者年龄、肿瘤直径大小、组织学分级等临床病理因素无关(P>0.05)。ATF3阳性表达的患者5年总生存率是80.7%,无进展生存率是78.7%;ATF3阴性表达的患者5年总生存率是90.4%,无进展生存率是89.4%;相比ATF3阴性表达的患者,ATF3阳性表达患者的5年总生存率及无进展生存率更低,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论ATF3表达与宫颈癌的浸润、转移有关,可能作为评价宫颈癌预后的重要指标之一。

关键词： apoptosis   cell cycle   endoplasmic reticulum   glioblastoma   unfolded protein response   DEATH RECEPTOR 5   STRESS-INDUCED SENSITIZATION   BREAST-CANCER CELLS   ER STRESS   UP-REGULATION   DEPENDENT APOPTOSIS   MOLECULAR-MECHANISM   CYCLE ARREST   IN-VITRO   INHIBITION  

摘要： Objective Withaferin A (WA) is a bioactive compound with a remarkable anti-cancer effect derived from Withania somnifera, commonly known as ashwagandha. However, the anti-cancer mechanisms of WA in glioblastoma multiforme (GBM) are still unclear. Materials and Methods Cell viability assays and xenografted nude mice were used to evaluate the effects of WA, along with flow cytometry to detect apoptosis and cell cycle of GBM. RNA-seq analysis, Western blotting, immunofluorescence staining, qRT-PCR and siRNA gene silencing were carried out to determine the signalling pathways affected by WA. Results Withaferin A significantly inhibited the growth of GBM in vitro and in vivo and triggered the intrinsic apoptosis of GBM cells by up-regulating expression of Bim and Bad. WA arrested GBM cells at the G2/M phase of the cell cycle through dephosphorylating Thr(161) of CDK1 by activating p53-independent p21 up-regulation. Knockdown of p21 restored cell cycle progression and cell viability by down-regulating the expression of Bad rather than Bim. We demonstrated that endoplasmic reticulum (ER) stress induced by WA through the ATF4-ATF3-CHOP axis, initiated apoptosis and G2/M arrest in GBM cells. Conclusion We revealed a novel pathway that elucidated WA activation of apoptosis and G2/M arrest in GBM cells through the ATF4-ATF3-CHOP axis. This discovery is important for optimization of WA-based regimens for prevention and/or treatment of GBM.

关键词： CHO细胞   CRISPR/Cas9   ATF3   CK2α   稳定细胞株  

摘要： 背景和目的:中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是重组蛋白、单克隆抗体等生物大分子药物生产的主要宿主细胞之一,尤其适合需要复杂翻译后修饰的分子类型,例如需糖基化的细胞因子、各类全长单克隆抗体等。然而,与大肠杆菌、酵母等表达系统相比,以CHO细胞为代表的哺乳动物细胞表达系统的培养成本较高,导致产品价格昂贵、病人难以负担。因此,提高CHO工程细胞株的生长性能及外源蛋白表达能力,对降低药物成本、进而提高市场可及性具有重要意义。以往研究证实,培养基和培养条件优化、筛选外源基因整合位点等方式能够有效提高CHO的生长及表达水平,而近年来,随着高通量测序、高效基因编辑等新兴技术等的涌现,使得功能基因筛选及CHO细胞的精确基因编辑成为可能。本实验室前期进行了CHO细胞的DNA甲基转移酶3A(DNMT3a)敲除,在此基础上通过RNA-seq发现转录激活因子3(ATF3)基因受DNMT3a敲除的影响出现转录水平上调,可能与CHO细胞的生长、代谢及表达水平的变化相关。另一方面,本实验室采用规律成簇的间隔短回文重复/规律成簇的间隔短回文重复结合蛋白9(CRISPR/Cas9)建立了CHO细胞的基因敲除及外源基因整合技术,并筛选到C12orf35、HPRT等稳定性较好的外源基因整合位点,可用于基因定点整合的稳定细胞株建立。本研究中,我们结合前期研究及文献检索,选取具有细胞生长代谢调节功能的ATF3及酪蛋白激酶Ⅱ的α亚基(CK2α)两个基因,深入研究其过表达对CHO细胞的作用。方法:为了探究ATF3和CK2α两个基因对CHO细胞增殖和外源蛋白表达的作用,首先我们构建了瞬时表达ATF3和CK2α的质粒,并将这两种质粒各自转染到红色荧光蛋白(mCherry)稳定表达的CHO细胞株KCSG6中,通过转染后1～5天细胞计数、培养结束时m Cherry蛋白的表达水平检测,来初步评价ATF3和CK2α基因过表达对CHO细胞生长及蛋白表达的影响。为了更严谨地研究ATF3和CK2α两个基因的功能,我们采用CRISPR/Cas9介导的稳定细胞株构建技术,选取HPRT作为整合位点,选取向导RNA(sgRNA)序列,并设计和构建定点整合的Donor质粒ATF3-Donor、CK2α-Donor和ATF3+CK2α-Donor。在KCSG6细胞株上通过电转染、加压筛选以及5’/3’junction PCR的鉴定,获得相应的稳转细胞池,并通过有限稀释法铺板,对得到的单克隆细胞进行5’/3’junction PCR和OUT-OUT PCR的鉴定和测序等鉴定,挑选KCSG6细胞株背景下的ATF3、CK2α以及ATF3+CK2α过表达的细胞株。通过对所筛选到的稳定细胞株进行插入基因表达验证、生长特性以及模式蛋白表达水平检测,并进一步探究插入基因对CHO细胞凋亡和相关信号通路的影响,系统地研究ATF3和CK2α两个基因对CHO细胞的作用和机制。结果:通过瞬时转染ATF3和CK2α质粒进入KCSG6细胞,我们发现ATF3和CK2α对细胞增殖及蛋白表达均具有促进趋势。经过CRISPR/Cas9基因编辑技术将ATF3基因、CK2α基因以及ATF3+CK2α基因成功插入KCSG6细胞株的HPRT位点,最终成功得到3株稳转细胞株:ATF3-8、CK2α-3、AC-2。通过对这三株细胞进行相关性质的探究,证明目的基因定点整合到HPRT位点,并得到成功表达,且ATF3和CK2α对CHO细胞增殖具有促进作用,CK2α对mCherry总蛋白的产量具有促进作用。通过对比这3株细胞株与对照细胞株的细胞凋亡,我们发现AC-2细胞株的ATF3+CK2α过表达具有抑制细胞凋亡的作用,而单独的ATF3或CK2α基因无明显作用;通过对这3株细胞株的信号通路进行初步探究,发现相对于空白细胞,这3株细胞的ERK信号通路水平上调。其中,对DNMT3a敲除的CHO细胞进一步研究发现,ATF3基因的启动子区胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)甲基化水平受DNMT3a调控,这对理解ATF3的调控机制具有一定的启示。综上,本研究证实ATF3基因以及CK2α基因过表达对CHO细胞增殖具有促进作用且CK2α对于细胞总蛋白表达具有促进作用,提示该细胞改造策略具有重要意义。本研究中我们还获得了ATF3及CK2α基因过表达的CHO稳定细胞株,可结合细胞培养工艺优化等进行更深入的研究,不断提高CHO细胞培养和蛋白生产水平。

关键词： TRPV1   福尔马林实验   足水肿   痛觉过敏   ATF3  

摘要： 研究背景和目的瞬时受体电位(TRP,Transient receptor potential)离子通道家族是一类在神经系统中广泛分布的非选择性阳离子通道,在感觉信号传导中起重要作用。瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1,Transient receptor potential vanilloid 1)是最早克隆的、在伤害感受中起重要作用的TRP通道,与炎症密切相关。福尔马林致痛模型是一种常用的炎性痛模型,除急性自发痛外,还可引起局部水肿、长时程的机械痛和热痛敏。福尔马林导致持续性痛敏的机制还不明确;TRPV1在不同浓度福尔马林致痛小鼠行为学中的作用也不明确。为此,本研究使用TRPV1基因敲除小鼠和WT小鼠,研究了两组小鼠在足底福尔马林注射后的双相痛、足水肿、机械痛和热痛觉过敏以及福尔马林注射后第三天DRG中ATF3(一种应激蛋白,可作为神经损伤标志物)的表达差异,初步探索了TRPV1在不同浓度(0.5%、2.5%、5%)福尔马林致小鼠炎症和痛觉过敏中的作用及可能机制。研究方法1、福尔马林实验:小鼠足底注射福尔马林后录像45分钟,统计其舔脚和甩脚的自发痛行为持续时间。2、小鼠足肿胀测量:用电子游标卡尺测量小鼠脚掌厚度来评估小鼠足水肿的程度。3、Von Frey实验:用von Frey触觉测量套件测小鼠机械痛。根据Dixon的up-and-down方法计算小鼠50%缩脚阈值。4、Hargreaves实验:用热辐射仪测量小鼠的热痛阈值。5、ATF3免疫荧光成像:DRG冰冻切片进行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜拍片。6、统计与分析:多个时间点的行为学实验结果采用双因素方差分析;多重比较采用Bonferroni法校正。P<0.05为有统计学差异。研究结果1、随着福尔马林浓度的上升,两组小鼠(WT小鼠和TRPV1小鼠)的自发痛反应时间均增加,但两组小鼠之间没有统计学差异。2、0.5%(F=8.649,P=0.0115)和2.5%(F=6.237,P=0.0256)福尔马林注射后,TRPV1小鼠足水肿程度比WT小鼠轻。3、0.5%福尔马林可导致两组小鼠均机械痛敏,而2.5%、5%福尔马林会导致两组小鼠机械痛丧失,且恢复时间随给药浓度上升而延长,但两组小鼠之间没有统计学差异。4、TRPV1小鼠热痛基础值高于WT小鼠。WT小鼠注射2.5%福尔马林后6小时出现热痛敏,1天时恢复;而TRPV1小鼠热痛阈值不变。5、两组小鼠DRG神经元中,ATF3阳性率均随福尔马林浓度的上升而增加,但两组小鼠之间没有统计学差异。研究结论敲除TRPV1可以减轻较低浓度福尔马林导致的小鼠足水肿,并使福尔马林导致的热痛敏消失,但不影响福尔马林引发的急性自发痛、机械痛敏以及DRG中ATF3的表达。上述结果提示,TRPV1可能在炎症导致的水肿和热痛敏中起促进作用,是有潜力的消肿止痛药开发靶点。

关键词： ATF3   砷   人支气管上皮细胞损伤   DR5   BCL-XL  

摘要： 背景:无机砷是一种自然界中广泛存在的毒物,职业性砷中毒是一种慢性砷中毒途径,从事采矿、冶炼、焙烧矿石、农药制备等行业的工人会长期通过呼吸道或皮肤接触砷,从而危害健康。近年来研究发现,转录激活因子3(Activating transcription factor3,ATF3)基因表达异常与肿瘤的发生发展相关,ATF3在不同癌症中的作用有明显差异,是一个既有促癌作用又有抑癌作用基因。目的:本文的目的在于探究ATF3在As导致的人支气管上皮细胞的损伤中的作用,并阐明其潜在机制,探究ATF3基因在肺癌的形成过程中可能存在的作用,为肺癌的发生发展提供潜在的治疗靶点。方法:首先利用细胞增殖毒性实验和流式细胞仪检测As对人支气管上皮细胞的损伤情况,再利用蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR检测As刺激下的人支气管上皮细胞中ATF3的蛋白以及m RNA的表达量,利用双荧光酶素报告基因实验检测As对ATF3启动子活性的影响。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建ATF3敲除的人支气管上皮细胞以便探究ATF3在As致人支气管上皮细胞损伤中的作用和机制,利用蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR分别在野生型和ATF3的人支气管上皮细胞中检测ATF3可能的上下游基因和信号通路的表达,其中包括p38、JNK、DR5、BCL-X,还利用了染色质免疫沉淀技术检测ATF3与DR5和BCL-X的特异性结合位点,最后使用了蛋白免疫印迹反应检测了使细胞发生程序性凋亡的关键蛋白酶caspase家族。结果:我们发现了As能够在人支气管上皮细胞中通过p38和JNK信号通路上调ATF3的表达,并且ATF3能够通过内源性和外源性的两条途径诱导细胞的凋亡,其中外源性途径为ATF3能够上调DR5的表达引起caspase 8的激活而内源性的途径为ATF3抑制抑凋亡基因BCL-X的表达,激活caspase 9。活化的caspase 8和caspase 9最终共同激活凋亡执行者caspase 3,导致细胞的凋亡。这一结果说明ATF3能够通过两种途径使As导致的受损的人支气管上皮细胞发生凋亡,在肺癌的发生过程中起到抑制的效果。

关键词： 木通苯乙醇苷B   ATF3   p53   细胞周期   凋亡  

摘要： 背景:肝细胞癌(HCC)是我国主要发病率和最具威胁生命的癌症之一,如何战胜肝癌是摆在患者面前的世界性难题。木通及其果实预知子是一种具有抗炎和抗肿瘤作用的中药,文献研究发现中药木通及其果实预知子对肝癌有抑制作用,但是否与其质量标志物木通苯乙醇苷B有关,其作用机制如何,尚未明确。目的:研究木通苯乙醇苷B对肝癌细胞周期、凋亡的影响,并初步探究其作用机制。方法:用木通苯乙醇苷B处理肝癌细胞。MTT法检测细胞存活率,流式细胞术和蛋白印迹法检测细胞凋亡与周期;转录组学观察木通苯乙醇苷B对肝癌细胞mRNA的影响,筛选可能机制;沉默ATF3 RNA,流式细胞术、qPCR和蛋白印迹法检测木通苯乙醇苷B处理细胞后,对细胞周期和凋亡的影响。结果:木通苯乙醇苷B抑制了肝癌细胞的增殖,阻滞了细胞周期于S期并诱导了细胞凋亡。此外,转录组学证实了木通苯乙醇苷B处理肝癌细胞之后对周期和凋亡信号的影响。进一步的研究表明,木通苯乙醇苷B可增加ATF3、p53、以及细胞周期因子p21、凋亡因子Cleaved-PARP、Cleaved-caspase-3的表达,降低细胞周期因子CDK2、Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E的表达;并能减轻ATF3 siRNA对p53、ATF3信号及细胞周期、凋亡的影响。结论:木通苯乙醇苷B通过激活ATF3/p53信号,从而阻滞了肝癌细胞的周期并诱导了凋亡。

关键词： 山羊   5-HT   全转录组测序分析   竞争内源性RNA   乳腺上皮细胞   钙代谢  

摘要： 围产期奶山羊由于胎儿生长、产道收缩和形成初乳需要消耗大量钙离子,因此血液中钙离子浓度迅速降低,使围产期的奶山羊极易发生低血钙症,进而引发产后瘫痪、乳腺炎、酮病、胎衣不下等疾病。5-羟色胺(5-hydorxytyrptamine,5-HT)可以动员骨骼中的钙释放到血液中,进而平衡围产期奶山羊体内的钙稳态。乳腺上皮细胞的钙代谢和凋亡对奶山羊的泌乳性能有至关重要的影响,但5-HT调控山羊乳腺上皮细胞钙代谢和凋亡的分子机制尚不明确。本研究通过给围产期奶山羊注射5-羟色氨酸(5-HTP,5-hydroxytryptophan),提高奶山羊体内的5-HT浓度,对分娩当天的血液进行全转录组测序分析,筛选出受5-HT浓度正调控并且与钙代谢和细胞凋亡相关的基因,并在山羊乳腺上皮细胞中进行功能验证,研究获得主要结果如下:1.围产期注射5-HTP奶山羊的血液全转录组分析通过在预产期前7天每天给奶山羊按体重(0.8 mg/kg)静脉注射5-HTP(处理组)或生理盐水(对照组),采集分娩当天血液样本进行全转录组测序分析,筛选到受5-HT调控的差异表达的基因999个、LncRNA 967个、Circ RNA 95个、micro RNA 87个。通过功能注释和富集分析发现这些差异表达基因和转录本主要影响钙代谢、脂代谢、免疫反应、细胞增殖和细胞凋亡等生理过程。根据竞争内源性RNA(Competition Endogeno us RNA,ce RNA)作用机制,利用Cytoscape3.6.1构建了LncRNA/Circ RNA-micro RNAm RNA调控网络,并对网络中的差异表达基因作富集分析,结果发现有3个与钙代谢相关的基因,分别是Toll样受体9(Toll Like Receptor 9,TLR9)、缝隙连接蛋白γ2(Ga p Junction Protein Gamma 2,GJC2)和连接素1(Junctophilin1,JPH1)。具体的调控关系为LncRNA MSTRG.101405.3和MSTRG.63774.3都可以分别与JPH1和GJC2竞争性地结合micro RNA NC＿030814.1＿19917,进而调控JPH1和GJC2的表达,LncRNA MST RG.1354.2可以TLR9竞争性地结合micro RNA NC＿030825.1＿46027,进而调控TLR9的表达。***3对山羊乳腺上皮细胞钙离子浓度和细胞凋亡的影响研究围产期注射5-HTP奶山羊的血液转录组分析得到受5-HT调控的差异表达基因999个,结合分析GEO数据库中注射5-HTP的小鼠乳腺转录组测序数据,筛选出受5-HT浓度正调控的ATF3基因,并在山羊乳腺上皮细胞中对其功能进行验证。用5-HTP处理山羊乳腺上皮细胞后,RT-q PCR检测ATF3和钙代谢相关基因的表达变化,荧光染料检测细胞内钙离子浓度变化。结果发现5-HTP处理山羊乳腺上皮细胞后ATF3的表达量升高(p<0.001),这与小鼠和山羊的转录组测序分析结果一致。5-HTP处理山羊乳腺上皮细胞后细胞内的钙离子浓度降低(p<0.05),细胞内与钙代谢相关的基因表达也发生变化,其中SPCA1的表达升高(p<0.001),SPCA2和SERCA2的表达降低(p<0.001)。山羊乳腺上皮细胞中过表达/干扰ATF3后,检测细胞内钙离子浓度变化和凋亡情况,发现ATF3可以降低细胞内的钙离子浓度,并促进山羊乳腺上皮细胞凋亡。以上研究表明,奶山羊产前注射5-HTP使体内血液中5-HT浓度升高,分娩当天血液全转录组测序分析发现5-HT主要影响钙代谢、脂代谢、细胞增殖、细胞凋亡、免疫反应等生理过程。在ce RNA调控网络中发现TLR9、GJC2和JPH1基因与钙代谢相关,在离体培养的山羊乳腺上皮细胞中,5-HT可通过促进ATF3的表达降低细胞内的钙离子浓度,并促进山羊乳腺上皮细胞凋亡。