关键词： activating transcription factor 3 inducer   anti-obesity   adipocyte   adipogenesis   lipolysis   browning   HORMONE-SENSITIVE LIPASE   GENE-EXPRESSION   ADIPOSE-TISSUE   CYCLIC-AMP   3T3-L1 PREADIPOCYTES   FAT   DIFFERENTIATION   BINDING   TRANSCRIPTION   ACTIVATION  

摘要： In this study, we investigated whether the activating transcription factor 3 (ATF3) inducer ST32db, a synthetic compound with a chemical structure similar to that of native Danshen compounds, exerts an anti-obesity effect in 3T3-L1 white preadipocytes, D16 beige cells, and mice with obesity induced by a high-fat diet (HFD). The results showed that ST32db inhibited 3T3-L1 preadipocyte differentiation by inhibiting adipogenesis/lipogenesis-related gene (and protein levels) and enhancing lipolysis-related gene (and protein levels) via the activation of beta 3-adrenoceptor (beta 3-AR)/PKA/p38, AMPK, and ERK pathways. Furthermore, ST32db inhibited triacylglycerol accumulation in D16 adipocytes by suppressing adipogenesis/lipogenesis-related gene (and protein levels) and upregulating browning gene expression by suppressing the beta 3-AR/PKA/p38, and AMPK pathways. Intraperitoneally injected ST32db (1 mg kg(-1) twice weekly) inhibited body weight gain and reduced the weight of inguinal white adipose tissue (iWAT), epididymal WAT (eWAT), and mesenteric WAT, with no effects on food intake by the obese mice. The adipocyte diameter and area of iWAT and eWAT were decreased in obese mice injected with ST32db compared with those administered only HFD. In addition, ST32db significantly suppressed adipogenesis and activated lipolysis, browning, mitochondrial oxidative phosphorylation, and beta-oxidation-related pathways by suppressing the p38 pathway in the iWAT of the obese mice. These results indicated that the ATF3 inducer ST32db has therapeutic potential for reducing obesity.

关键词： Heparanase 2   ER stress   Hypoxia   Cisplatin   Gene expression   ATF3   ACTIVATING TRANSCRIPTION FACTOR-3   TUMOR-GROWTH   CANCER   HEAD  

摘要： Activity of heparanase, endoglycosidase that cleaves heparan sulfate side chains in heparan sulfate proteo-glycans, is highly implicated in tumor progression and metastasis. Heparanase inhibitors are therefore being evaluated clinically as anti-cancer therapeutics. Heparanase 2 (Hpa2) is a close homolog of heparanase that lacks HS-degrading activity and functions as an endogenous inhibitor of heparanase. As a result, Hpa2 appears to attenuate tumor growth but mechanisms that regulate Hpa2 expression and determine the ratio between heparanase and Hpa2 are largely unknown. We have recently reported that the expression of Hpa2 is induced by endoplasmic reticulum (ER) and proteotoxic stresses, but the mechanism(s) underlying Hpa2 gene regulation was obscure. Here we expand the notion that Hpa2 is regulated by conditions of stress. We report that while ER and hypoxia, each alone, resulted in a 3-7 fold increase in Hpa2 expression, combining ER stress and hypoxia resulted in a noticeable, over 40-fold increase in Hpa2 expression. A prominent induc-tion of Hpa2 expression was also quantified in cells exposed to heat shock, proteotoxic stress, lysosomal stress, and chemotherapy (cisplatin), strongly implying that Hpa2 is regulated by conditions of stress. Further-more, analyses of the Hpa2 gene promoter led to the identification of activating-transcription-factor 3 (ATF3) as a transcription factor that mediates Hpa2 induction by stress, thus revealing, for the first time, a molecular mechanism that underlies Hpa2 gene regulation. Induction of Hpa2 and ATF3 by conditions of stress that often accompany the rapid expansion of tumors is likely translated to improved survival of cancer patients. (c) 2021 Elsevier B.V. All rights reserved.

关键词： 结直肠癌   真菌   白色念珠菌   进展   Enolase   巨噬细胞   ACOD1   ATF3   T细胞  

摘要： 第一部分白色念珠菌在结直肠癌中的丰度及其对结直肠癌的影响目的:本研究旨在研究白色念珠菌在结直肠癌中的丰度及其对结直肠癌的影响。方法:收集结直肠癌患者、结肠息肉患者及健康人三组共粪便标本,进行18S r RNA基因和内转录间隔(ITS)区进行初步分析。筛选出在结直肠癌丰度最高且差异明显的真菌-白色念珠菌。建立DSS+AOM诱导的小鼠结直肠癌和小鼠结直肠癌皮下瘤模型,给予白色念珠菌灌胃,统计各组肿瘤生长速度和肿瘤体积等指标。结果:(1)结直肠癌患者肠道中的白色念珠菌水平显著增加。(2)白色念珠菌促进结直肠癌进展。结论:白色念珠菌在结直肠癌患者肠道中增多,且可以促进结直肠癌的进展。第二部分白色念珠菌分泌的Enolase调控巨噬细胞促进结直肠癌进展的机制目的:本研究旨在进一步探索白色念珠菌分泌的Enolase调控巨噬细胞促进结直肠癌进展的机制。方法:1)使用原位杂交技术检测正常肠道组织和结直肠癌组织中白色念珠菌的菌丝相比例。(2)检测Enolase对结直肠癌细胞和巨噬细胞增殖、细胞因子分泌、蛋白质组学及有机酸代谢的影响。检测敲低ACOD1和ATF3对巨噬细胞功能及代谢的影响。运用Ch IP-q PCR一步探究转录因子ATF3下游靶基因。(3)研究Enolase中和抗体对白色念珠菌作用于结直肠癌的治疗作用及对肿瘤微环境中T细胞的影响。结果:(1)白色念珠菌分泌的Enolase在结直肠癌患者结直肠癌组织中富集。(2)肿瘤细胞分泌的聚胺促进白色念珠菌由酵母态向菌丝态转变,诱导白色念珠菌分泌更多的Enolase。(3)Enolase特异性地影响巨噬细胞而不是结肠直肠癌细胞。(4)Enolase影响RAW264.7巨噬细胞代谢相关蛋白水平的变化。(5)Enolase通过Dectin-1/SYK级联激活巨噬细胞中的ACOD1表达。(6)ATF3作为Dectin-1/SYK/ACOD1轴的下游靶点调节巨噬细胞中PGE2的转录。(7)巨噬细胞RAW264.7体外产生的PGE2抑制CD8+CTLs的比例及功能。(8)体内实验,Enolase中和抗体对白色念珠菌作用于结直肠癌具有治疗作用,能增加结直肠癌微环境中CD8+CTLs的比例及功能。(9)组织芯片结果显示,ATF3的表达与结直肠癌的生存期成负相关。结论:(1)结直肠癌患者肠道白色念珠菌增多,肿瘤细胞分泌的聚胺诱导白色念珠菌分泌更多的Enolase。(2)Enolase刺激结直肠癌微环境的肿瘤相关巨噬细胞乌头酸脱羧酶1(ACOD1)的表达增高,进而促进衣康酸的生成,衣康酸影响巨噬细胞三羧酸循环并影响ACOD1/ATF3信号通路。(3)转录因子ATF3下游因子PEG2通过影响肿瘤微环境中CD8+细胞毒性T细胞,进而促进结直肠癌进展。

关键词： Hec1   ATF3   心肌致密化不全   卵泡发育   五氯硝基苯  

摘要： 先天性心脏病(CHD)是婴儿因出生缺陷死亡的最常见原因,在我国出生缺陷中位居首位。先天性心脏病的主要特征是胚胎发育过程中心脏或大血管的大体结构异常,包括房间隔缺损、室间隔缺损、主动脉干永存和心肌致密化不全等,它是一种多因素的复杂疾病,由遗传因素、环境因素以及遗传和环境交互作用引起。心肌致密化不全是一种直接影响心肌组织内壁的先天性病变,导致心脏内壁血液充盈形成小梁、心膜变薄和心肌细胞增殖活性降低等。五氯硝基苯(PCNB)是一类有机氯农药,广泛分布在田地和草场等区域。我们实验室前期研究发现小鼠孕期灌胃暴露PCNB诱导胎鼠心肌致密化不全样病理表型,通过转录组测序筛选对照和PCNB处理组E17.5胎鼠心脏差异表达基因,发现PCNB心脏毒性机制与PCNB下调Ndc80复合物成员Hec1的表达有关,导致染色体排列和分离异常,抑制心肌细胞有丝分裂和增殖。此外,我们实验室前期报道PCNB能改变青春前期大鼠卵巢甾体激素的合成,加速原始卵泡的发育。本论文基于前期研究,探究了 PCNB下调心脏Hec1表达及影响卵泡发育的分子机制。我们以H9c2和HL-1心肌细胞作为实验材料,用不同浓度PCNB进行处理,Western blot检测结果表明PCNB暴露显著降低Hec1蛋白表达水平。为了探究PCNB下调Hec1的分子机制,我们克隆并鉴定了 Hec1的启动子区,通过Jaspar和hTF target软件预测了 Hec1启动子区潜在的转录因子,结合PCNB处理组E17.5胎鼠心脏获得的差异表达基因,候选压力响应型转录因子ATF3进行后续研究。利用对照和PCNB处理组心脏组织进行Real time PCR检测,证实PCNB显著下调心脏组织ATF3的转录水平。免疫组化结果显示,ATF3在PCNB处理组的E17.5胎鼠心脏组织中表达量明显减少。用不同浓度PCNB处理H9c2和HL-1细胞后,Western blot结果显示ATF3的蛋白表达水平显著降低。这些结果与PCNB下调心脏组织和体外心肌细胞的Hec1的表达一致。为了探究ATF3与Hec1之间的调控关系,我们构建Myc-ATF3真核表达质粒,将空载体、Myc-ATF3表达质粒和Hec1启动子报告质粒分别共转染HEK293ET细胞,双荧光素酶报告基因实验检测发现ATF3能激活Hec1启动子。我们将空载体和Myc-ATF3表达质粒分别转染HEK293ET和H9c2细胞,Real-time PCR检测表明ATF3过表达显著升高Hec1的mRNA水平,而特异性靶向ATF3的siRNA分别转染HEK293ET和H9c2细胞后都显著降低Hec1的mRNA水平。Western blot结果显示ATF3过表达显著升高Hec1的蛋白水平,而ATF3敲低显著降低Hec1的蛋白水平。我们进一步通过Jaspar软件预测分析ATF3结合在Hec1启动子的位点,发现Hec1启动子区-26/-19位点存在ATF3可能识别的ATF/CRE元件,构建针对-26/-19区域的缺失和点突变报告质粒,进行双荧光素酶报告基因实验,结果显示-26/-19元件的缺失突变和点突变都显著降低了ATF3对Hec1启动子的转录激活作用,表明Hec1启动子区的ATF/CRE元件介导了 ATF3的转录激活作用。染色质免疫沉淀实验结果显示ATF3能结合含ATF/CRE元件的区域。这些研究表明ATF3能转录激活Hec1的表达。随后我们分析了 ATF3在PCNB抑制心肌细胞增殖中的作用,用EdU和H3组蛋白在第10位丝氨酸磷酸化修饰(pH3)作为标志物进行免疫荧光染色,分别检测H9c2细胞增殖和有丝分裂情况。结果显示ATF3过表达援救了 PCNB对心肌细胞增殖和有丝分裂的抑制作用,而ATF3敲低加剧了 PCNB抑制心肌细胞的增殖和有丝分裂。纺锤体标志物β-tubulin免疫荧光染色显示ATF3过表达援救了 PCNB诱导的纺锤体形态和染色体分离异常,而ATF3敲低加剧了纺锤体形态和染色体分离异常。结合Hec1在体外心肌细胞增殖中的作用研究,为了进一步探索Hec1对心脏发育的影响,我们利用CRISPR/Cas9技术构建了 Hec1心脏特异性条件敲除小鼠,基因型鉴定结果显示得到了野生型和杂合型的小鼠,未得到纯合子基因型小鼠,提示条件性敲除Hec1的纯合子小鼠可能因为Hec1缺失引起心脏发育过程中心肌细胞增殖异常导致胚胎致死。此外,为了探索PCNB影响大鼠卵泡发育的分子机制,我们将青春前期大鼠进行PCNB灌胃一周后,卵巢组织HE染色观察并统计大鼠卵巢各级卵泡数目,发现PCNB处理组原始卵泡显著减少,生长卵泡显著增加,确定了 PCNB加速大鼠卵泡发育。随后通过RNA-Seq测序筛选对照组和PCNB处理组卵巢组织差异表达基因,共筛选出261个差异表达基因,其中上调基因有62个,下调

关键词： ATF3   ARL4C   乳腺癌   抑癌基因   DNA甲基化  

摘要： 背景:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内发病率呈逐年上升的趋势,严重威胁广大女性的生命健康。尽管目前人们对乳腺癌疾病的认识逐步深入,以手术为主的抗肿瘤综合治疗日臻成熟,乳腺癌死亡率有所下降,但是全球患病女性人数仍然逐年增长。因此,对乳腺癌分子机制的研究至关重要。转录激活因子3(Activating Transcription Factor 3,ATF3)是一种适应性反应基因,其参与多种细胞生物学过程,与诸多疾病的发生和发展密切相关。目前关于ATF3在乳腺癌中的研究相对较少并且存在争议,ATF3被认为既可发挥促癌作用,又能够充当抑癌基因。ATF3调控乳腺癌的具体分子机制尚未完全明确。目的:本文以ATF3为研究对象,探究其在乳腺癌中的作用,并进一步寻找ATF3的下游靶蛋白及其发挥作用的分子机制。方法:1、对TCGA数据库中1053例乳腺癌患者与109例癌旁正常组织中的ATF3的表达情况进行差异分析,并通过Kaplan-Meier法研究ATF3表达水平对乳腺癌总生存(Overall survival,OS)的影响;实时定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)、免疫印迹(Western blot,WB)和免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)验证乳腺癌组织与细胞株中ATF3的表达量。2、通过慢病毒稳定转染构建稳定过表达ATF3的MDA-MB-231与MDA-MB-435细胞株,通过体外细胞增殖,细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移与侵袭实验以及构建裸鼠乳腺脂肪垫下移植瘤模型,验证高表达ATF3后乳腺癌生物学行为的改变。3、采用Pearson相关性分析寻找与ATF3存在共表达关系的基因,分析其表达情况并结合转录因子预测数据库TRANSFAC 2.0的预测结果,锁定候选目标蛋白,随后采用qRT-PCR、Western blot进行表达验证。进一步通过虫荧光素酶报告实验和染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)实验对ATF3及其目标靶蛋白之间的关系进行验证。4、通过甲基化特异性PCR(MSP)实验研究ATF3是否受甲基化调控。5、最后根据上述结果,通过慢病毒稳定转染构建稳定过表达下游靶蛋白的MDA-MB-231与MDA-MB-435细胞株并进行细胞增殖,细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移与侵袭以及裸鼠体内成瘤实验,验证该目标靶蛋白在体内、外水平对乳腺癌细胞发挥的生物学功能。结果:1、TCGA公共数据的差异表达分析结果显示乳腺癌患者中ATF3的表达低于癌旁正常组织,并且ATF3的低表达降低乳腺癌患者的OS;qRT-PCR,Western blot,IHC证实临床乳腺癌样本中ATF3较癌旁正常组织低表达。2、通过慢病毒稳定转染成功在乳腺癌细胞系MDA-MB-231与MDA-MB-435中过表达了 ATF3,细胞功能学实验证实ATF3过表达能够显著抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并促进乳腺癌细胞的凋亡。裸鼠乳腺脂肪垫下移植瘤成瘤实验显示,过表达ATF3能够显著抑制移植瘤的生长。3、生物信息分析发现ARL4C与ATF3存在共表达关系,qRT-PCR及Western blot证实乳腺癌组织中ARL4C的表达与ATF3正相关,提示ARL4C可能是受ATF3调控的下游靶蛋白。ChIP和荧光素酶实验证实ATF3能够与ARL4C的启动子区直接结合,促进ARL4C的表达,发挥转录因子的功能。从而证实ARL4C受ATF3调控。4、甲基化特异性PCR(MSP)实验揭示了 ATF3在乳腺癌中存在异常高甲基化的现象,且经DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-dC处理后ATF3表达上调,说明ATF3受甲基化调控。5、qRT-PCR,Western blot,IHC实验证实ARL4C在乳腺癌中的低表达,体内、外功能学实验结果表明,在乳腺癌细胞中过表达ARL4C能够抑制其增殖、迁移和侵袭能力,并抑制乳腺癌细胞的体内成瘤能力。结论:ATF3在乳腺癌中低表达,且其低表达与乳腺癌不良预后相关;ATF3能够抑制乳腺癌的增殖、迁移和侵袭能力,发挥抑癌作用;ATF3启动子区存在甲基化位点,其在乳腺癌中的低表达与其超甲基化有关;ARL4C是ATF3的下游靶蛋白,ATF3可作为转录因子结合ARL4C启动子,促进其转录;ARL4C亦在乳腺癌中发挥抑癌基因功能,抑制乳腺癌的增殖、迁移和侵袭能力。本研究初步探讨了 ATF3在乳腺癌中的生物学功能,其作为潜在的预后评估分子指标和治疗靶点,具有一定的临床意义。

关键词： 生物信息学   WGCNA   糖尿病肾病   ATF3   蛋白尿  

摘要： 目的:探讨糖尿病肾病(Diabetic kidney disease,DKD)患者血清关键基因转录激活因子3(Activating transcription factor 3,ATF3)水平变化及其与蛋白尿的相关性,为进一步寻找早期识别DKD的生物标志物提供理论依据。方法:首先在GEO数据库中根据纳入排除标准选择合适的基因数据集,之后对其进行差异基因和加权基因共表达网络分析(WGCNA),最后将二者结果取交集获得DKD相关基因。将其导入Cytoscape软件,根据Degree算法,进行筛选获得排名靠前的5个关键基因。之后选取2020年12月-2021年11月在我院肾内科门诊或住院部明确诊断为DKD患者,根据纳入及排除标准,筛选符合条件的DKD患者。测定其随机尿白蛋白/肌酐(UACR),根据测定的UACR值将最终纳入的病例分为:正常白蛋白尿组(UACR<30mg/g)、微量白蛋白尿组(UACR:30-300mg/g)、大量白蛋白尿组(UACR>300mg/g)。收集其一般资料及生化指标,运用酶联免疫吸附法(ELISA)对患者血清ATF3浓度进行测定;三组间一般资料及各项临床指标差异采用方差分析或非参数检验进行比较;血清ATF3与各项临床指标的相关性采用Pearson或Spearman进行分析;采用多重线性逐步回归法对血清ATF3的影响因素进行分析。结果:1.选择GSE142153数据集作为研究,进行差异基因及WGCNA分析并取交集后,共获得48个DKD相关基因,进一步筛选后获得前5个关键基因,分别为IL10、IL1A、ATF3、CCL2、CXCR3。2.最终纳入88例DKD患者,正常白蛋白尿组26例,微量白蛋白尿组30例,大量白蛋白尿组32例。三组患者间年龄、性别比、BMI均未见明显差异。与正常白蛋白尿组相比,微量白蛋白尿组与大量白蛋白尿组Hb、ALB显著降低(P<0.05),Scr、BUN、UACR及24小时尿蛋白定量显著升高(P<0.05),差异具有统计学意义。3.与正常白蛋白尿组相比,其他两组血清ATF3浓度明显升高,大量白蛋白尿组血清ATF3浓度最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.在对血清ATF3浓度与各临床指标及蛋白尿进行相关性分析后发现,血清ATF3浓度与Hb、ALB、GFR呈负相关(r=-0.525,-0.751,-0.406,P均<0.05),与BUN、Scr、UACR及24小时尿蛋白定量呈正相关(r=0.497,0.426,0.992,0.946,P<0.05);5.将上述有意义的指标与血清ATF3浓度进一步行多重线性逐步回归分析后发现,Hb、UACR、24小时尿蛋白定量均为ATF3的影响因素,且24小时尿蛋白定量对其影响较大。结论:DKD患者血清ATF3水平明显升高,与蛋白尿的严重程度存在正相关,有望成为监测DKD的临床指标。

关键词： ATF3   Ca Ski   Cervical cancer   HPV16   NF-κB  

摘要： Background: As a novel tumor suppressor mediator, activating transcription factor 3 (ATF3) has recently aroused an interest in its possible therapeutic applications in various cancers. In this study, we evaluated the effect of ATF3 overexpression on the cellular level of nuclear factor kappa B (NF-κB) in human papillomavirus (HPV)-infected Ca Ski cells. Further, we examined whether ATF3 could mediate cell cycle arrest and alter the apoptosis level of Ca Ski cells. Methods: The biological behavior of Ca Ski cells was evaluated prior and subsequent to the overexpression of ATF3 by MTT assay, fluorescence microscopy, cell cycle and annexin V/PI flow cytometric analysis. The effect of ectopic ATF3 expression on the cellular level of NF-κB in HPV-positive cells was evaluated by western blotting assay. Results: The overexpression of ATF3 in Ca Ski cells led to significant apoptosis and cell cycle arrest in the G1 phase. Western blotting assay revealed a discernible reduction of NF-κB p65 level in cervical cancer cells. Conclusion: ATF3 acts as a tumor suppressor factor in HPV16-infected Ca Ski cells and exerts anti-cancer effects on HPV16-related cervical cancer cells potentially by hindering cell growth and inducing cell cycle arrest through the down-regulation of NF-κB. Our results suggest that ATF3 induction or NF-κB suppression may be useful targets for HPV16-related cervical cancer prevention and treatment. © 2022, The Author(s).

关键词： 依布硒啉   神经母细胞瘤   ATF3  

摘要： 研究背景:神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是一种常见的儿童实体瘤,它的发病年龄小,风险较大,目前治疗以手术切除、化疗、放疗为主,但由于部分患者对以上治疗方法不能耐受,或者预后较差,所以需要开发新且高效的治疗方法。依布硒啉(Ebselen)是一种含硒化合物,我们预实验发现Ebselen可以诱导NB细胞死亡,目前还未有相关报道,因此,我们拟对Ebselen诱导NB细胞死亡的机制进行研究,为Ebselen作为潜在的NB治疗药物提供理论依据。目的:通过测定Ebselen在NB细胞系中的IC50,观察Ebselen作用后的NB细胞形态的改变,验证Ebselen对NB的细胞毒性,使用WB、转录组测序等实验方法检测经Ebselen处理前后NB细胞蛋白和基因表达的变化,采取裸鼠皮下成瘤实验对Ebselen在体内抑制肿瘤的作用进行研究,最终综合以上实验结果来综合探讨Ebselen诱导NB细胞死亡的机制。方法:(1)采用ATP法试剂盒测定Ebselen对不同NB细胞系以及其他肿瘤细胞和正常细胞的细胞毒性;(2)光镜下观察Ebselen作用于NB细胞后的存活情况,电镜下观察Ebselen作用后的NB细胞膜、染色质的改变;(3)加入五种细胞死亡抑制剂,观察对Ebselen诱导NB细胞死亡的挽救作用;(4)收集Ebselen作用后的NB细胞总RNA,进行转录组测序,寻找潜在化合物调控靶点;(5)收集Ebselen作用后的细胞总蛋白,通过Western Blot(WB)进行检测靶点基因蛋白的表达水平;(6)为了检测Ebselen在体内对肿瘤细胞的作用,构建裸鼠成瘤模型,连续给药21天后,与溶剂组比较,从瘤体的体积变化角度分析Ebselen的作用,并对瘤体组织进行WB检测。结果:(1)ATP法以及光学显微镜观察表明,Ebselen可以引起NB细胞死亡,并导致细胞染色质断裂,直至细胞膜破坏;(2)转录组测序筛选出389个上调基因,从中挑选出HSP70和ATF3两个表达差异大的基因进行下一步研究,发现抑制HSP70蛋白功能不能挽救Ebselen导致的细胞死亡,说明该蛋白表达量的增加可能是细胞对抗死亡被动应答,而后WB对ATF3蛋白进行检测发现该蛋白水平升高,拟进一步对ATF3进行基因沉默后观察细胞在Ebselen作用下表型;(3)裸鼠皮下成瘤实验中,与溶剂组相比,Ebselen对NB瘤体生长有明显抑制作用,同时WB检测显示瘤体组织ATF3蛋白的表达明显增加,与细胞实验中ATF3蛋白增加现象一致。结论:本研究显示Ebselen可诱导NB细胞死亡,抑制NB瘤体生长,推测ATF3可能参与了 Ebselen的作用过程。

关键词： 鼻咽癌   PLUNC   DDX17   β-catenin   ATF3   PD-L1  

摘要： 目的:探讨PLUNC在鼻咽癌中如何通过调控DDX17/β-catenin相互作用进而来调控ATF3和PD-L1的表达。方法:用5-8F,HNE2细胞构建过表达PLUNC的稳转细胞株。用HNE2,S18细胞构建过表达β-catenin或DDX17的稳转细胞株。向5-8F,HNE2细胞转染PLUNC干扰质粒或DDX17干扰质粒。向5-8F和HONE1转染β-catenin干扰质粒。WB检测鼻咽癌细胞过表达或干扰PLUNC、DDX17、β-catenin表达后β-catenin通路相关蛋白质(β-catenin、p-GSK3β,TCF4),ATF3 和 PD-L1 的表达水平。细胞免疫荧光实验检测鼻咽癌细胞过表达或干扰PLUNC,过表达或干扰β-catenin后ATF3、PD-L1在鼻咽癌细胞中的表达以及定位情况。通过Co-IP和细胞免疫荧光实验来研究PLUNC、DDX17、β-catenin的相互作用关系。结果:WB结果显示在5-8F和HNE2细胞中,PLUNC抑制β-catenin 通路相关蛋白质(β-catenin、p-GSK3β),ATF3 和 PD-L1的表达。细胞免疫荧光实验结果显示,过表达PLUNC后,ATF3在细胞核的表达减弱,PD-L1在细胞核、细胞膜、细胞浆的表达减弱。向5-8F和HNE2细胞转染干扰PLUNC质粒后,β-catenin通路相关蛋白质(β-catenin、p-GSK3β、TCF4),ATF3 和 PD-L1 表达上调。在5-8F和HNE2过表达PLUNC稳转细胞株进行Co-IP和细胞免疫荧光实验,结果显示PLUNC与DDX17存在相互作用,在细胞浆和细胞核中存在共定位。WB显示在5-8F和HNE2细胞中PLUNC抑制DDX17的表达以及干扰DDX17后,ATF3和PD-L1的表达下调。用过表达β-catenin或DDX17的HNE2和S18稳转细胞株进行Co-IP和免疫荧光实验,结果显示DDX17与β-catenin存在相互作用,在细胞核中存在共定位。用过表达β-catenin的HNE2和S18细胞进行WB和细胞免疫荧光实验,干扰5-8F和HONE1的β-catenin表达后,进行WB和细胞免疫荧光实验,结果表明β-catenin上调ATF3和PD-L1的表达。结论:PLUNC可通过抑制DDX17/β-catenin相互作用下调ATF3和PD-L1在鼻咽癌中的表达。图7幅,表11个,参考文献70篇

关键词： 角膜成纤维细胞   机械拉伸   核心基因   ATF3   基质重塑  

摘要： 角膜扩张(Corneal Ectasia)是—类以角膜进行性变薄和异常凸起为特征的疾病,表现为角膜异常膨隆、不规则散光、生物力学性能降低,患者视力受损,严重时需进行角膜移植。力刺激是角膜扩张疾病的影响因素之—,但其作用机制尚不明确。作为承载组织,角膜受到来自眼内压和外界环境的应力刺激。已有研究结果显示,揉眼、屈光手术等可以导致角膜组织所受的牵张力增大,更易发生形变,进而促进角膜扩张疾病的发生和发展。了解角膜细胞响应力刺激的分子机制对圆锥角膜、屈光术后角膜扩张等疾病的早期诊断和临床治疗具有重要的意义。本研究通过机械拉伸处理体外培养的人角膜成纤维细胞,基因芯片获得角膜成纤维细胞的表达谱变化,采用生物信息学方法筛选角膜细胞响应力刺激的核心基因并进行验证。在此基础上,对所筛选的力响应核心基因ATF3在角膜成纤维细胞中的作用进行分析,探究力刺激影响圆锥角膜等角膜扩张疾病的分子机制,为揭示角膜扩张性疾病的发病机理提供依据。主要工作总结如下:(1)对机械拉伸处理早期角膜成纤维细胞表达谱数据进行分析,以p<0.05、|log2FC|≥1.5为标准,筛选机械拉伸处理角膜成纤维细胞1 h和6 h时的差异表达基因(DEGs)和差异表达miRNA(DEMs),构建miRNA-mRNA作用网络。结果显示,机械拉伸处理1 h时共获得236个DEGs,和9个差异表达miRNAs。机械拉伸6 h数据集中筛选获得1955个DEGs和33个差异表达miRNAs。(2)对筛选的差异表达基因进行GO功能和KEGG富集分析。结果发现,力刺激响应基因主要参与角膜细胞内的转录调控、细胞增殖、凋亡、粘附、信号转导等生物学过程。KEGG富集分析的结果表明,力刺激能够通过PI3K-Akt、TNFα、Foxo、细胞粘附等多种信号传导途径参与调控角膜成纤维细胞的生理功能。构建差异基因的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络,采用Cytohubba软件的“Degree”算法筛选角膜成纤维细胞响应力刺激的核心基因,包括:IL6、JUN、MYC、IL8、ATF3、VEGFA、STAT3、IL1B、NOTCH1、HIF1A等。进—步采用qPCR对机械拉伸处理后角膜细胞中力响应核心基因的表达进行验证,与基因芯片结果—致。(3)激活转录因子3(ATF3)是—种快速响应基因,机械拉伸能够诱导角膜成纤维细胞中ATF3基因的表达。此外,与正常角膜细胞相比,圆锥角膜成纤维细胞中ATF3基因的表达升高。通过siRNA方法降低角膜成纤维细胞中ATF3的表达,对其功能进行分析,结果发现,降低ATF3的表达后,细胞增殖水平升高,细胞凋亡基因Casp3的表达降低,细胞凋亡率下降。此外,胶原合成基因(COL1A1、COL1A2、COL3A1)、胶原交联基因LOX1及蛋白聚糖基因OGN的表达上升,胶原降解相关基因MMP1的表达下降。结果表明,ATF3能够抑制角膜成纤维细胞增殖,促进细胞凋亡,参与角膜成纤维细胞基质重塑的调控。(4)通过启动子元件分析、qPCR、Western Blot等方法对ATF3调控胶原合成基因表达的信号途径进行研究,结果显示,NFATC3结合元件是胶原合成基因COL1A2、COL3A1启动子区的共有元件;降低ATF3基因表达后,角膜成纤维细胞中NFATC3基因和蛋白表达均显著降低,力刺激能够引发细胞氧化应激水平改变,采用H2O2处理角膜成纤维细胞模拟氧化应激环境,结果显示,H2O2处理能够诱导ATF3基因的表达,H2O2条件下降低ATF3的表达,胶原合成基因COL1A2、COL3A1的表达升高,NFATC3蛋白表达下降,表明力刺激通过氧化应激介导的ATF3-NFATC3信号途径调节角膜成纤维细胞中胶原的合成。