关键词： Metabolic syndrome   Activating transcription factor 3   Scaffold -hopping   Structure -activity relationship   ADAPTIVE-RESPONSE GENE   ATF3   DERIVATIVES   COUMARIN   DESIGN   DIFFERENTIATION   INHIBITORS   GLUCOSE   KINASE   AGENTS  

摘要： The induction of activating transcription factor 3 (ATF3) was identified as a promising therapeutic mechanism to overcome metabolic syndrome. Hence, a structure-activity relationship campaign on the chiral lead (1b) was conducted with a scaffold-hopping approach, whereby achiral 7-methoxy-3-methyl-1H-chromeno[4,3-c]pyrazol4-one (16c) was recognized as a potential ATF3 inducer with a lipid-lowering feature in a pre-differentiated 3T3L1 cell model. Also, in a high-fat diet scenario, mice subjected to 16c demonstrated robust weight loss with shrinkage of the white adipose mass and fewer hypertrophic adipocytes, accompanied by a preferable glycemic profile compared to 1b. Additionally, the biochemical analysis revealed that 16c further ameliorated the liver function and improved the plasma triglyceride profile that were absent from mice treated with 1b. Taken together, 16c shows promise as an ATF3 stimulant for further development to alleviate metabolic syndrome.

关键词： MicroRNA-217   Neurofibromatosis type 1   Breast cancer   Chemoresistance   Proliferation   Migration   Autophagy   SHOCK FACTOR-1 HSF1   RESISTANCE   MIR-217   EXPRESSION   AUTOPHAGY   GENE   NF1   ATF3  

摘要： Application of microRNA-mediated mRNA expression in treatment of diverse cancers has been documented. The current study was explored to study the role of miR-217 in breast cancer (BC) progression and the related downstream factors. Clinical tissue samples, BC cell lines and the established xenograft models were prepared for ectopic expression and depletion experiments to discern the regulatory roles of miR-217-mediated NF1 in BC cell proliferation, metastasis and chemoresistance as well as tumorigenic ability of BC cells in nude mice. miR-217 was upregulated in BC, which was a predictor of poor prognosis of BC patients. NF1 could be targeted by miR-217. miR-217 promoted malignant characteristics of BC cells through enhancing ATF3-MMP13 interaction by inhibiting NF1. miR-217 repressed sensitivity against anti-cancer drugs by inducing autophagy of BC cells through the NF1/HSF1/ATG7 axis. Also, miR-217 could inhibit NF1 to facilitate tumorigenic ability of BC cells in vivo. Our study emphasized that miR-217 could potentially inhibit NF1 expression to activate the c-Jun, thus enhancing the expression and interaction of ATF3/MMP13 and promoting the malignant features of BC cells. Furthermore, miR-217 conferred chemoresistance on BC by enhancing BC cell autophagy, which was achieved by limiting NF1 expression to induce the HSF1/ATG7 pathway.

关键词： 神经病理性疼痛   ATF3   小胶质细胞   泛素化  

摘要： 研究背景神经病理性疼痛(neuropathicpain,NP)是由躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛,是由与神经系统相关的组织损伤或炎症引起的异常病理改变导致的慢性疾病。NP患者临床表现多样,病程长,是公认最难治疗的疼痛综合征之一,其治疗效果常不理想。因此,明确NP的发病机制具有重要的临床意义和社会价值。本研究通过小鼠SNI模型的脊髓组织样本芯片及测序数据进行生物信息学分析,利用小鼠坐骨神经分支选择性损伤(SNI)模型和LPS刺激的小鼠脊髓小胶质细胞(BV2)模型探讨E3泛素连接酶MDM2(Transformed 3T3 Cell Double Minute 2)泛素化修饰激活转录因子 3(Activating Transcription Factor 3,ATF3)调控脊髓小胶质细胞炎性反应介导神经病理性疼痛的分子机制。研究方法利用GEO数据库下载有SNI小鼠模型DRG及脊髓样本的芯片数据GSE5425及测序数据集123919。通过RStudio软件、比较毒理学数据库(CTD)对数据集进行关键基因筛选,利用Ubibrowser在线泛素化数据库筛选出关键基因上游的E3泛素连接酶。利用RStudio软件,做下游功能富集分析,结合单细胞数据集对筛选目的基因ATF3做分析,并通过小鼠SNI模型和LPS诱导BV2细胞模型验证。在LPS刺激BV2小胶质细胞中,分别过表达MDM2和抑制ATF3的表达,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ATF3的表达水平,利用Western blot检测下游NF-κB、NLRP3及炎性因子指标。同时,利用小鼠脊髓小胶质细胞ATF3敲除鼠造SNI模型,观测敲除鼠小胶质细胞中ATF3对小鼠疼痛行为学的改变,利用免疫荧光检测小胶质细胞激活状态的改变。最后用泛素化相关实验检测验证MDM2是ATF3的E3泛素连接酶。结果通过对GEO数据库的GSE5425数据集和GSE123919数据集进行生物信息学分析,筛选出差异基因ATF3。同时,Ubibrowser泛素化数据库分析结果显示了 MDM2可能是ATF3的E3泛素连接酶。研究发现在BV2细胞模型中,LPS诱导小胶质细胞激活模型中MDM2及ATF3高表达,过表达MDM2抑制ATF3的表达,过表达MDM2及敲除ATF3都显著减少了 NF-κB、NLRP3和相关炎性因子的表达。且ATF3表达与NF-κB、NLRP3及炎性因子表达呈正相关,MDM2呈负相关。此外,ATF3和MDM2在SNI小鼠脊髓中表达明显升高。与flox小鼠相比,敲除小胶质细胞中ATF3的SNI小鼠的机械痛阈上调且小胶质细胞活化减弱。最后通过泛素化相关实验验证了 E3泛素连接酶MDM2可能通过泛素化作用调控底物蛋白ATF3的表达水平。结论这些结果表明,E3泛素连接酶MDM2通过泛素化作用调控ATF3减轻炎性反应,抑制小胶质细胞活化,从而缓解了神经病理性疼痛的发展。

关键词： 甲基汞   铁死亡   ATF3   Xc-系统   脂质过氧化  

摘要： 目的:甲基汞（methylmercury,MeHg）是一种环境蓄积性污染物,具有强烈神经毒性,其主要存在于水生环境中。MeHg进入机体后可在大脑组织中蓄积,从而造成中枢神经系统损伤。铁死亡是一种依赖于铁的细胞死亡方式,与ATF3及p53表达异常以及Xc系统功能紊乱有关,并且Xc系统受到p53和ATF3的调控。研究发现MeHg可以诱导铁死亡的发生。然而,ATF3、p53以及Xc系统在MeHg诱导的铁死亡中的具体机制尚不清楚。本研究分别通过体内动物实验以及体外细胞实验,研究MeHg诱导大脑神经细胞铁死亡发生的分子机制,为MeHg中毒的防制提供实验及理论依据。方法:利用昆明小鼠建立MeHg暴露动物模型。使用8周龄的小鼠72只,随机分为以下4组:对照组、4μmol/kg MeHg组、8μmol/kg MeHg组、12μmol/kg MeHg组,每组18只,雌雄各半。每天上午十点灌胃一次,连续灌胃4周。染毒期间每周城中一次并;用旷场实验、爪抓力实验检测小鼠神经行为学;HE染色、尼氏染色观察小鼠大脑的病理学损伤;流式细胞术检测ROS含量;试剂盒测量组织铁、Glu、GSH、GSSG、GSH/GSSG及MDA含量;RT-qPCR和Western blotting检测铁死亡及ATF3/p53通路相关指标的表达水平。利用HT22细胞建立MeHg暴露细胞模型。HT22细胞于37℃、5%CO恒温培养箱中培养。第一部分包括4组:对照组、Fer-1组、MeHg组、MeHg+Fer-1分组。使用CCK-8法测定细胞活性、流式细胞术以检测细胞中ROS水平,Western blotting检测HT22细胞中铁死亡相关蛋白表达水平。第二部分包括4组:对照组,control si RNA组,MeHg组,ATF3 si RNA+MeHg组。Western blotting检测细胞中ATF3、p53、SLC7A11蛋白表达水平,双重免疫荧光染色检测细胞中ATF3、p53的共定位水平。结果:***暴露导致小鼠神经系统功能异常及大脑病理损伤:MeHg暴露后,小鼠体重增长减缓;自发活动性和主动探索能力下降;肢体力量下降。小鼠大脑皮质中HE染色可以观察到组织病理变化,尼氏染色可以观察到神经元病理损伤。***诱导神经细胞发生铁死亡:MeHg暴露后,小鼠大脑皮质中铁含量升高,组织内铁离子沉积增加;MDA含量升高;ROS水平升高;ferritin、GPX4及SLC7A11的蛋白及m RNA的表达水平显著降低。HT22细胞中,与对照组相比,MeHg组细胞活力降低;ROS水平升高;ferritin、GPX4及SLC7A11的蛋白表达水平降低;与MeHg组相比,MeHg+Fer-1组细胞活力升高;ROS水平降低;ferritin、GPX4及SLC7A11的蛋白表达水平升高,差异均具有统计学意义。***致铁死亡过程中ATF3激活p53抑制Xc系统的表达:MeHg暴露后,小鼠大脑皮质中ATF3、p53的表达水平升高;Glu、GSSG含量升高;GSH、GSH/GSSG含量显著降低。HT22细胞中,与对照组相比,MeHg组ATF3、p53蛋白表达水平升高;SLC7A11蛋白表达降低;细胞中ATF3、p53共定位水平升高。与MeHg组相比,ATF3 si RNA+MeHg组ATF3、p53蛋白表达水平降低;SLC7A11蛋白表达水平升高;细胞中ATF3、p53共定位水平降低,差异均具有统计学意义。结论:MeHg暴露诱导大脑神经细胞铁死亡的具体机制与ATF3表达增加有关。ATF3可激活p53抑制SLC7A11的表达,从而抑制Xc系统,最终诱导大脑神经细胞发生铁死亡。

关键词： 胶质母细胞瘤   胶质瘤干细胞   circRPPH1   ATF3  

摘要： 目的:胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是最致命的成人颅内恶性肿瘤,因其弥漫性浸润生长的特性和背后复杂多变的未知分子机制,使得患者预后极差。非编码环状RNA(circRNA)因为其环状结构的性质,在体内的存在较为稳定,并且可以通过结合蛋白质以保持蛋白稳定,并最终促进肿瘤的发生发展。本研究从恶性胶质母细胞瘤中的胶质瘤干细胞出发,着重探究circRPPH1在胶质瘤干细胞(glioma stem cells)中的表达情况,并深入研究其内在的调控机制。本研究涉及胶质瘤干细胞和动物模型两个层面,着重探究circRPPH1对胶质瘤干细胞增殖、侵袭、自我更新能力的影响,考察其下游circRPPH1-ATF3信号及其转录调控作用,以及对TGF-β1/Smad信号通路的激活作用,以期发现新的治疗靶点,为靶向治疗提供依据。研究方法:选取胶质母细胞瘤患者来源的新鲜肿瘤组织,从中提取出胶质瘤干细胞细胞系GSC38和GSC35分别进行circRPPH1与ATF3体外敲低和过表达实验研究。通过转染技术敲低或过表达circRNA后,采用MTS增殖实验、Transwell侵袭实验、有限稀释法实验检测circRPPH1敲低与过表达后GSC的增殖、侵袭与自我更新能力的改变。采用RNA-pull down技术验证circRPPH1与ATF3的相互作用。采用RT-qPCR、Western Blot检测转染后GSC中干性标志物的表达情况。采用基因富集GSEA、双荧光素酶报告基因、RT-qPCR、ELISA、Western Blot检测ATF3的转录调控作用以及其下游TGF-β1/Smad信号通路的转导。最后,我们通过裸鼠颅内成瘤实验,在体内观察了敲低以及过表达circRPPH1对胶质母细胞瘤增殖特性的改变。结果:组织RT-qPCR结果显示circRPPH1在胶质母细胞瘤中呈现高表达。MTS实验、Transwell实验、有限稀释实验结果表明敲低circRPPH1和ATF3可以抑制GSC的增殖、侵袭与自我更新,而基因过表达能够促进这一作用。RNApulldown、Western Blot实验证明了circRPPH1能够结合ATF3蛋白,并能够提升ATF3的稳定性。双荧光素酶报告基因实验表明了ATF3可以转录调控Nestin表达。Western Blot实验证明了ATF3对下游TGF-β1/Smad信号的促进作用,同时它能够促进干性标志物表达,从而使肿瘤接受生长信号,不断增殖浸润,增加恶性程度。体内实验证明敲低circRPPH1表达能够抑制胶质瘤的增殖,而过表达circRPPH1则会促进肿瘤生长。结论:circRPPH1在胶质瘤干细胞中呈现高表达,且会导致患者的不良预后。Circ RPPH1可以通过结合ATF3,通过维持其稳定性,促使ATF3转录调控干性标志物Nestin表达,并激活下游TGF-β1/Smad信号持续表达,促进胶质母细胞瘤的增殖、侵袭与自我更新。这表明,circRPPH1-ATF3-TGF-β1/Smad信号在胶质瘤干细胞的增殖中发挥了重要调控作用。靶向circRPPH1可能是一种胶质母细胞瘤治疗的新靶点。

关键词： 芒柄花素   铁死亡   慢性肾脏病   Smad3   ATF3  

摘要： 目的:慢性肾脏病(CKD)是一种由多种原因造成的肾脏损害的疾病,肾纤维化(RF)是其发生发展过程中的关键病理过程,肾小管上皮细胞铁死亡可促进RF的发生发展。芒柄花素(FN)是存在于中药黄芪的一种应用广泛的值得开发的单体成分,已经有研究表明,FN可以抑制Smad3的表达,而ATF3与Smad3有直接相互结合关系并且被发现能抑制SLC7A11的表达,因此,从靶向Smad3出发治疗铁死亡相关RF成为新的治疗策略。本研究拟从铁死亡-RF进程角度探讨中药小分子单体FN在改善慢性肾脏病中的作用及其通过Smad3/ATF3/SLC7A11信号通路的调节机理。方法:1)体内实验:构建叶酸(FA)型肾病及单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠梗阻性肾病的CKD模型,FN(40 mg/kg)以及阳性对照药物血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂缬沙坦(VST,20 mg/kg)灌胃干预,FA模型验证组分组为:Vehicle组,FA组,FA+FN组,FA+VST组;UUO模型验证组分为:Sham组,UUO组,UUO+FN组,UUO+VST组。检测血清中的肌酐在不同组中的含量和尿素氮的水平评估药物对肾功能的影响,HE染色观察肾小管扩张程度,计算损伤评分。谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)以及组织铁的含量反应铁死亡水平,同时检测铁死亡标志物胱氨酸/谷氨酸转运体系统Xc(x CT,也称为SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达、氧化应激水平(Keap1,Nrf2和4-HNE)、纤维化程度(Masson染色,ɑ-SMA,fibronectin和Col1a1)的影响;蛋白水平评估FN药物干预对Smad3和ATF3活化的影响。2)体外实验:通过检测FN不同药物浓度处理p TECs的吸光度计算出细胞存活率而筛选出芒柄花素对细胞没有伤害的适宜浓度,铁死亡激动剂RSL3/erastin处理原代肾小管上皮细胞诱导肾脏铁死亡发生,并在不同浓度FN(20-80μM)的作用下,检测铁死亡水平(GSH、MDA、组织铁含量、铁死亡标志物SLC7A11和GPX4、脂质过氧化程度、细胞内铁含量)、纤维化程度(ɑ-SMA,fibronectin和Col1a1)的改变;胞质、核分离提取蛋白检测芒柄花素对Smad3、ATF3活化以及Nrf2入核的影响;并在293FT细胞中通过蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)验证芒柄花素对外源性Smad3与ATF3结合的影响,评估其对ATF3下游转录因子SLC7A11表达水平的影响。结果:动物体内实验表明:1.小鼠的血清肌酐、尿素氮水平在FA模型组中的含量明显比在正常组血清中检测到的高,而FN干预处理显著降低了这一水平。***染色显示在FA和UUO模型中受损的肾小管管腔损伤在FN干预处理后得到明显改善。***染色以及纤维化基因ɑ-SMA,fibronectin,Col1a1的IHC染色,PCR检测和Western blot实验表明,沉积在肾组织间质的胶原纤维以及纤维蛋白的表达在FN灌胃组明显降低,且FN的效果优于VST。***降低了4-HNE的表达以及促进了Nrf2的入核。***逆转了在FA和UUO模型中升高的组织铁水平,MDA水平和降低的GSH水平以及铁死亡负相关蛋白GPX4和SLC7A11的表达。6.在FA和UUO模型中被激活的Smad3以及表达量明显增多的活化形式的p-Smad3和ATF3水平,在FN处理组显著降低。细胞体外实验结果显示:***处理p TECs的适宜浓度是0-80μM,超过80μM FN对细胞表现出明显的抑制作用。2.通过Western blot检测发现纤维化蛋白的表达在RSL3/erastin的刺激下表达增多,FN干预后其含量显著降低。3.氧化应激生物标志物4-HNE和铁死亡的负相关蛋白GPX4和SLC7A11与体内实验呈现一致的表达变化。在铁死亡环境中升高的MDA水平和脂质过氧化程度以及降低的GSH水平和细胞内铁含量在FN处理后被逆转。4.在铁死亡微环境中,FN促进了Nrf2的入核。***3和ATF3在铁死亡刺激下从细胞质易位到细胞核,在FN干预后易位现象得到明显抑制。***干预阻断了Smad3与ATF3的结合。结论:***可改善叶酸小鼠肾功能损伤,修复肾小管损伤。***在体内和体外对肾脏纤维化水平和铁死亡水平都有很好的抑制作用。***通过阻断Smad3与ATF3的结合及促进SLC7A11的表达减轻p TECs铁死亡从而抑制纤维化来缓解CKD。总之,FN可以通过Smad3/ATF3/SLC7A11信号通路抑制铁死亡降低RF水平延缓CKD进程,可作为CKD的候选治疗药物。

关键词： Lipofermata   FATP2   ATF3   PI3K/Akt/mTOR   EMT   膀胱癌  

摘要： 研究背景及目的:至2020年,全球已有786,000人因膀胱癌去世且新增死亡病例占总死亡病例的70%以上。在我国男性患者中,膀胱癌新发病例为7万,排名第8位,其病例数逐年增加,已然成为危害我国居民健康的重要疾病。根据“种子与土壤”假说,肿瘤生长的最佳环境是一种能够增强癌细胞增殖能力并抑制其死亡的环境。这种环境在体内由肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)提供,在肿瘤转移及对药物的耐受中发挥重要作用。在与脂肪高度相关的卵巢癌及乳腺癌等肿瘤的研究中,经脂肪细胞提供的脂质被认为是肿瘤代谢生长的能量来源。脂肪酸转运蛋白家族(Fat acid transport proteins,FATPs)主要在脂质代谢旺盛及摄取脂肪酸活跃的组织表达,内毒素、TNFα等炎症因子及胰岛素之类的激素都能调节FATPs成员的表达。FATPs被报道在哺乳动物中过表达时会增加脂肪酸的摄取,而脂质代谢的失调往往与肿瘤的发生发展有关。FATP2主要在肝脏、肾脏和肠道中表达,在调节外源性脂肪酸运输和维持细胞内脂质平衡方面起着重要作用。有研究表明脂肪酸转运蛋白2抑制剂(Lipofermata)可以增强免疫抑制剂的疗效并通过抑制FATP2抑制多形核骨髓源性抑制细胞(Polymorphonuclear-Myeloid derived srppressor cells,PMN-MDSCs)的促癌作用。多项研究结果表明FATP2在肿瘤治疗方面有着很大的潜力,而Lipofermata作为FATP2的抑制剂,在PMN-MDSCs和黑色素瘤中的研究中已经显示了一定的抗肿瘤作用。在本研究中,我们将深入探究Lipofermata对膀胱癌细胞增殖、迁移等细胞生物学影响以及Lipofermata如何通过调控FATP2-ATF3轴影响膀胱癌细胞的增殖和EMT,探讨Lipofermata作为膀胱癌新型治疗药物的可行性。研究方法:实时荧光定量(Real time quantitative PCR,RT-q PCR)及蛋白质印记(Western blot,WB)用于检测m RNA及蛋白的相对表达量。免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)及免疫荧光(Immunofluorescence,IF)实验用于检测蛋白在细胞中的定位并检测其表达。CCK-8(Cell Counting Kit-8)、细胞平板克隆实验、伤口愈合实验、Transwell及流式细胞术用来检测T24、J82两株肌层浸润型膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭等能力。裸鼠皮下成瘤实验研究Lipofermata在体内实验中对膀胱癌肿瘤的影响及药物本身的毒副作用。有参转录组测序检测药物作用后细胞的分子及通路变化。研究结果:RT-q PCR、IHC及WB结果表明FATP2在大部分膀胱癌细胞及组织中表达升高,CCK-8法、细胞平板克隆实验、伤口愈合实验、Transwell实验等细胞功能实验表明敲减SLC27A2能抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移能力。细胞半数抑制浓度(IC50)结果显示膀胱癌细胞对Lipofermata敏感性与FATP2的表达正相关。各种细胞实验表明Lipofermata能诱导膀胱癌细胞的凋亡而阻滞周期并抑制其侵袭、迁移及增殖。裸鼠成瘤实验表明Lipofermata在体内依然能发挥抗膀胱癌作用且无明显毒副作用。测序及细胞回复实验表明Lipofermata是通过FATP2-ATF3轴抑制膀胱癌EMT并通过调控PI3K/Akt/m TOR信号通路抑制膀胱癌增殖。研究结论:***2在人膀胱癌细胞及组织中表达升高且高表达患者预后更差,其存在促进细胞增殖及迁移,是膀胱癌治疗的潜在分子靶点。***2抑制剂Lipofermata能通过下调FATP2的表达从而抑制膀胱癌细胞的增殖、EMT并阻滞周期诱导细胞凋亡,其在裸鼠体内亦能发挥抗肿瘤作用且对体重无明显影响。***通过FATP2-ATF3轴发挥抗膀胱肿瘤能力与PI3K/Akt/m TOR信号通路高度相关。

关键词： ATF3   IR损伤   C2C12细胞   PAX7   Myh3  

摘要： 研究背景:骨骼肌损伤后的修复依赖于成肌细胞的增殖和分化。C2C12细胞是小鼠的一种成肌细胞系,它具备很强的增殖和分化能力,因此常被作为体外研究成肌细胞增殖和分化的细胞模型。转录激活因子3(Activating transcription factor 3,ATF3)是ATF/CREB家族中含有碱性亮氨酸拉链结构的转录因子。目前,已有许多报道显示ATF3能够参与多种细胞的周期调控、增殖、分化以及凋亡进程。然而,人们对于ATF3在骨骼肌中的作用仍然知之甚少。研究目的:本论文旨在探讨ATF3在骨骼肌再生中的功能以及它在C2C12成肌细胞中的作用机制。研究方法:(1)分离野生型小鼠的卫星细胞(离体后称为原代成肌细胞),通过对离体培养的成肌细胞进行ATF3和PAX7(Paired box protein 7)的免疫荧光染色,来检测ATF3是否在卫星细胞中表达。(2)通过构建野生型(Wild type,WT)小鼠的缺血再灌注(Ischemia reperfusion,IR)损伤模型和C2C12细胞的分化模型,来探究ATF3在骨骼肌的损伤修复过程和C2C12细胞分化过程中的表达情况。(3)通过构建过表达ATF3的C2C12细胞(ATF3-C2C12),并以转入LV5空载的C2C12细胞(LV5-C2C12)作为对照,用以探究过表达ATF3对C2C12细胞增殖和分化的影响。(4)利用染色质免疫共沉淀(ChIP)和双荧光素酶报告基因实验,来研究ATF3与PAX7或Myh3的结合位点,以及ATF3是否能够影响PAX7和Myh3的转录。研究结果:(1)成肌细胞的免疫荧光染色结果显示,ATF3在成肌细胞的细胞核内表达。(2)RT-qPCR(Quantitative Real-time PCR),Western blot 以及免疫组织化学染色的实验结果显示,在骨骼肌缺血再灌注损伤修复过程和C2C12细胞分化过程中,ATF3的表达呈下降趋势,这与胚胎肌球蛋白重链(Embryonic myosin heavy chain,eMyHC)和肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MyHC)的表达呈负相关。(3)LV5-C2C12细胞和ATF3-C2C12细胞的EdU和Ki67染色以及CCK8的实验结果显示,过表达ATF3会抑制C2C12细胞的增殖,并且RT-qPCR和Western blot的实验结果显示,过表达ATF3会降低C2C12细胞中PAX7的表达。(4)LV5-C2C12细胞和ATF3-C2C12细胞中的MyHC免疫荧光染色和Western blot的实验结果表明,在C2C12细胞中过表达ATF3能够显著抑制细胞分化进程。(5)ChIP和双荧光素酶报告基因的实验结果显示,ATF3是通过直接结合PAX7和Myh3的启动子抑制二者的表达。研究结论:(1)ATF3在成肌细胞的细胞核内表达,并在骨骼肌缺血再灌注损伤修复和细胞分化过程中表达下调。(2)在成肌细胞C2C12内过表达ATF3,显著抑制了 C2C12细胞的增殖与分化。(3)ATF3通过结合PAX7和Myh3启动子,抑制PAX7和Myh3的转录,最终导致C2C12细胞的增殖和分化功能下降。因此,我们认为ATF3在骨骼肌的再生过程中可能起到负调节作用。

关键词： ATF3   细胞焦亡   急性肺损伤   肺泡巨噬细胞  

摘要： 背景和目的急性肺损伤(ALI)及其更严重的形式急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是ICU脓毒症患者常见的并发症,具有较高的发生率和病死率,且潜在发病机制及病理生理机制尚不明确。研究表明,严重的炎症反应是ALI/ARDS发生和进展的主要病理生理机制。肺泡巨噬细胞(AM)最先对肺部炎症作出反应,是抵御病原体入侵的第一道防线。细胞焦亡是一种与炎症相关的程序性细胞死亡,它的特征是可以释放大量炎症因子,最终引起强烈的炎症反应。AM焦亡在脓毒症肺损伤的进展中起着重要的作用。既往有研究发现,激活转录因子3(ATF3)在ALI中发挥保护作用,但作用机制尚未阐明。因此,本研究通过体内外实验探究ATF3的表达水平,并建立脂多糖(LPS)联合三磷酸腺苷(ATP)诱导的小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)焦亡模型,探究ATF3调控细胞焦亡的机制,为保护ALI提供实验基础和理论依据。方法***体内模型的构建及ATF3的表达差异采用C57BL/6小鼠作为体内模型,随机分为两组:对照组和LPS组。对照组给予气管内滴注生理盐水,LPS组给予气管内滴注LPS(5mg/kg),构建ALI模型。24h后处死小鼠并收集眼球血及肺组织。HE染色观察肺组织形态学变化,并做出肺损伤病理评分。计算肺组织湿/干重(W/D)比值。ELISA及实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测血清以及肺组织中炎症因子IL-1β、IL-18的水平。应用蛋白免疫印迹法(WB)、RT-q PCR、免疫组化技术检测肺组织中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1、Caspase-11、焦孔素D(GSDMD)、IL-1β、IL-18水平。透射电镜观察肺组织超微结构。应用WB、RT-q PCR、免疫荧光技术检测肺组织中激活转录因子3(ATF3)的表达与定位。***体外模型的构建及ATF3的表达差异对MH-S进行实验分组:(1)对照组:正常培养。(2)LPS+ATP组:采用不同浓度的LPS(0、50、100、200、500和1000μg/L)刺激分别6h、12h、24h后,继续采用不同浓度的ATP(0.5、2、5m M)刺激0.5h建立体外ALI模型。采用细胞计数试剂盒(CCK)-8测定细胞活力;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定细胞培养上清中LDH释放情况;Hoechst33342/PI染色检测MH-S的损伤情况;光镜及透射电镜观察细胞形态及膜完整性;WB、RT-q PCR检测MH-S中NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-18水平,ELISA检测细胞培养上清中炎症因子IL-1β、IL-18的水平,WB、RT-q PCR、免疫荧光技术检测MH-S中ATF3的定位与表达。***3对ALI体外模型的影响利用转染试剂瞬时转染小干扰RNA(si-RNA),构建敲低ATF3表达的MH-S,RT-q PCR、WB验证ATF3敲低。将转染后的细胞分为四组:阴性对照(NC)-si RNA组、ATF3-si RNA组、NC-si RNA+LPS+ATP组、ATF3-si RNA+LPS+ATP组。通过检测CCK-8和LDH释放,分析ATF3对LPS+ATP诱导的MH-S的存活率及损伤的影响。WB、RT-q PCR、免疫荧光技术检测ATF3对MH-S焦亡相关分子NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18表达水平的影响。ELISA评估各组细胞培养上清中IL-1β、IL-18的水平。结果***体内模型的成功构建且ATF3呈高表达状态HE染色显示LPS组小鼠肺泡完整性破坏,肺泡腔及肺泡间隔内有大量炎症细胞浸润,肺病理损伤评分显著升高。LPS组小鼠肺组织W/D比值显著升高。ELISA及RT-q PCR检测显示LPS组小鼠血清以及肺组织中炎症因子IL-1β、IL-18的水平显著升高。WB、RT-q PCR、免疫组化技术检测显示LPS组小鼠肺组织中NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18水平显著升高。透射电镜观察肺组织超微结构发现LPS组小鼠细胞出现细胞膜完整性破坏、细胞内空泡增多、染色质聚集、线粒体肿胀等细胞焦亡的特征。WB和RT-q PCR结果显示,LPS组小鼠肺组织ATF3蛋白的表达显著增加。免疫荧光结果显示,LPS组小鼠肺组织ATF3表达增加,且主要定位于细胞核。***体外模型的成功构建且ATF3呈高表达状态CCK-8测定细胞活力,确定最适条件为100μg/L浓度的LPS诱导6h加用0.5m M浓度的ATP诱导0.5h。LDH检测显示LPS+ATP组LDH释放增加。Hoechst33342/PI染色显示LPS+ATP组细胞的损伤增多。光镜及