关键词： Abscisic acid   Arabidopsis thaliana   Ca2+ channel   guard cell   heterotrimeric G protein   reactive oxygen species   stomata   ABSCISIC-ACID ACTIVATION   ANION CHANNEL SLAC1   HYDROGEN-PEROXIDE   PLASMA-MEMBRANE   ION CHANNELS   STOMATAL CLOSURE   NITRIC-OXIDE   PHOSPHATASE 2A   ALPHA-SUBUNIT   CA2+ CHANNELS  

摘要： Heterotrimeric G proteins composed of G alpha, G beta, and G gamma subunits are important signalling agents in both animals and plants. In plants, G proteins modulate numerous responses, including abscisic acid (ABA) and pathogen-associated molecular pattern (PAMP) regulation of guard cell ion channels and stomatal apertures. Previous analyses of mutants deficient in the sole canonical Arabidopsis G alpha subunit, GPA1, have shown that G alpha-deficient guard cells are impaired in ABA inhibition of K+ influx channels, and in pH-independent activation of anion efflux channels. ABA-induced Ca2+ uptake through ROS-activated Ca2+-permeable channels in the plasma membrane is another key component of ABA signal transduction in guard cells, but the question of whether these channels are also dependent on G alpha for their ABA response has not been evaluated previously. We used two independent Arabidopsis T-DNA null mutant lines, gpa1-3 and gpa1-4, to investigate this issue. We observed that gpa1 mutants are disrupted both in ABA-induced Ca2+-channel activation, and in production of reactive oxygen species (ROS) in response to ABA. However, in response to exogenous H2O2 application, I-Ca channels are activated normally in gpa1 guard cells. In addition, H2O2 inhibition of stomatal opening and promotion of stomatal closure are not disrupted in gpa1 mutant guard cells. These data indicate that absence of GPA1 interrupts ABA signalling between ABA reception and ROS production, with a consequent impairment in Ca2+-channel activation.

关键词： 蒺藜苜蓿   MtROP5   角果   侧器官  

摘要： 【目的】利用拟南芥异源表达MtROP基因并研究其功能,为蒺藜苜蓿中MtROP蛋白的功能研究,及进一步探索MtROP蛋白在蒺藜苜蓿和微生物共生互作过程中的作用提供理论依据。【方法】利用同源克隆方法获得了蒺藜苜蓿(Medicagotructula)中与拟南芥AtROP5高度同源的ROP蛋白基因MtROP5,用MtROP5表达载体转化拟南芥并严格筛选转化植株,观察T2代转化植株角果、侧枝分叉、簇毛等器官的表型,并结合启动子-GUS、GFP、RT-PCR等试验手段,研究MtROP5的组织表达特性及其对各种激素的应答反应,通过拟南芥异源表达MtROP5对其功能进行研究。【结果】与对照相比,过表达CA-MtROP5(Constitute activityMtROP5,CA-MtROP5)、MtROP5、GFP-MtROP5的拟南芥植株的角果变短,而角果数目相应增加。过表达CA-MtROP5植株角果的顶端具有较多花粉管,DN-MtROP5(Dominant negativeMtROP5,DN-MtROP5)及MtROP5转化植株的花粉管则较早凋亡。过表达CA-MtROP5、DN-MtROP5植株的侧生器官及花序的极性发生改变,转化CA-MtROP5和MtROP5的转基因拟南芥的簇毛分支数目增加。启动子-GUS及GFP-MtROP5的表达模式表明,该基因在叶脉、花药、下胚轴、气孔及簇毛等部位特异表达。RT-PCR及启动子-GUS表达分析表明,生长激素可诱导该基因的上调表达。【结论】MtROP5在果实及侧器官的极性发育中具有较为重要的作用,可能参与了生长素相关途径的调控。

关键词： 拟南芥   蔗糖转运蛋白   蛋白质互作   共转化  

摘要： 蔗糖转运蛋白是一类介导细胞跨膜转运蔗糖的膜蛋白，广泛存在于生物体内。糖在生物体内的生产、运输、消耗和储藏是一个由多种信号网络严格控制的过程，这个过程的调节服从于细胞的发育和对环境适应的需求，而糖运载蛋白是这个复杂网络中的一个重要组分或者调节者。到目前为止，人们对植物糖运载蛋白功能调节的细胞信号过程知之甚少。本文在克隆拟南芥蔗糖转运蛋白基因AtSUC4的基础上，应用酵母双杂交和双分子荧光互作技术研究了拟南芥蔗糖转运蛋白AtSUC4的蛋白-蛋白互作信号，结果如下：\n 利用Clontech公司的SMART技术建立了拟南芥叶片的全长cDNA文库。在第一链合成中，CD III/3’PCRPrimer作为3’引物，而SMARTⅣOligo作为mRNA5’的暂时模板，因此合成的单链cDNA5’末端有一段补足的SMARTⅣOligo序列，在利用长片段PCR反应合成双链cDNA时，此序列将成为引物结合位点。\n 利用Split Ubiquitin System筛选拟南芥蔗糖转运蛋白AtSUC4的互作因子。在筛选过程中，首先以拟南芥蔗糖转运蛋白AtSUC4为“诱饵”连接到Split Ubiquitin System系统中的“诱饵”载体pTMBV4上，拟南芥cDNA文库则连接到“猎物”载体pDL2-Nx上。然后将连接好的载体对pTMBV4-AtSUC4/pDL2-Nx-cDNA共转化到受体酵母菌株DSY-1中，在缺乏色氨酸、亮氨酸和组氨酸，并添加了100mmol.L-3-AT的SD筛选平板上筛选培养。最后，获得了拟南芥蔗糖转运蛋白AtSUC4的互作因子：拟南芥光系统Ⅰ亚基H(PsaH)。这是目前世界上发现的第一个定位于叶绿体上的拟南芥蔗糖转运蛋白AtSUC4的互作因子。\n 将AtSUC4和AtPsaH基因分别连接到Bimolecular Fluorescence Complementation(BiFC)的载体上，共转化拟南芥原生质体，通过激光共聚焦显微镜观察，在原生质体的叶绿体上观察到了黄色荧光，因此验证了拟南芥蔗糖转运蛋白AtSUC4和PsaH的体内互作，并且将其互作部位定位在叶绿体上。

关键词： 拟南芥   小G蛋白   RabD2b   定位   功能  

摘要： Rab是小G蛋白超家族中最大的一个家族,它们广泛存在于动物、植物及微生物中,在囊泡运输的不同阶段发挥其调控作用。Rab1类小G蛋白是Rab蛋白家族的一个亚家族,酵母和哺乳动物的Rab1类蛋白(Ypt1和Rab1)调控从内质网到高尔基体的囊泡运输过程。植物中Rab1类小G蛋白归属于RabD亚家族。拟南芥RabD亚家族又被分为功能不同的两个亚类AtRabD1(包括一个成员AtRabD1)和AtRabD2(包括三个成员AtRabD2a、AtRabD2b和AtRabD2c)。目前,AtRabD1和AtRabD2a的功能研究开展较多,它们的功能类似于Ypt1和Rab1,调控内质网到高尔基体的囊泡运输过程。但另外两个成员AtRabD2b和AtRabD2c的细胞学和生理学功能还不清楚。本研究中,我们分析了AtRabD2b的表达谱和亚细胞定位,同时,利用基因敲除突变体和转基因植株对AtRabD基因的生理功能进行了研究。主要研究结果如下： (1)不同物种(拟南芥,酵母以及哺乳动物)Rabl类小G蛋白的氨基酸序列高度保守,而且它们都具有保守的功能结构域(核苷酸结合结构域和效应因子结合结构域);AtRabD2b能够互补酵母温敏突变体ASY01(ypt1)的缺陷表型,表明AtRabD2b与Ypt1是功能上相似的同源蛋白;(2)烟草叶片表皮细胞瞬时转化结果表明AtRabD2b主要定位在细胞内的高尔基体上。通过定点诱变的方法获得了AtRabD2b的两种突变形式：组成性结合GTP的活性形式AtRabD2b[Q67L]和无核苷酸结合的非活性形式AtRabD2b[N121I]。AtRabD2b[Q67L]主要定位在高尔基体上,而AtRabD2b[N121I]则弥散在细胞质中,表明不同的核苷酸结合状态会影响AtRabD2b的亚细胞定位;(3)RT-PCR结果显示AtRabD2b基因在植株的根、茎、叶、花、角果等组织中都有表达,表明它是组成型表达的蛋白。GUS组织染色结果显示AtRabD2b在幼苗和成熟期的不同组织中都有表达,但是在幼嫩以及生长发育比较旺盛的部位中优先表达;(4)atrabd2b单突变体和atrabd2b/atrabd2c双突变体没有出现异于野生型植株的表型。YFP-AtRabD2b [Q67L]的超表达植株出现矮化、莲座叶宽度增加以及果柄与花序轴夹角减少等异常表型。超表达YFP-AtRabD2b[Q67L]还导致了AtRabD2b基因的共抑制,产生了AtRabD2b, AtRabD2c和AtRabD1基因下调表达的转基因植株,这些转基因植株的茎顶端部分由绿变紫,并逐渐坏死,成熟期植株表现出矮化、丛生、不育等表型。这些结果表明AtRabD基因参与了植物的多个生长发育过程,而且AtRabD亚家族蛋白间存在着高度的功能冗余。 (5)显微切片结果表明,AtRabD2b基因共抑制植株茎段的坏死起始于细胞的死亡,坏死细胞首先在外围的表皮细胞层中发现,然后沿着切面在细胞和细胞之间蔓延。透射电镜观察结果表明在即将死亡的细胞中,叶绿体发育异常,内囊体片层膜数目减少,并且这些细胞中的细胞器被液泡逐渐吞噬。这些结果暗示了AtRabD基因在体内调控的囊泡运输过程对于维持植物某些组织的细胞活性有重要的作用。 (6) AtRabD2b蛋白C末端两个保守的半胱氨酸残基是蛋白质进行异戊二烯化修饰的重要位点。PCR扩增获得了AtRabD2b单个半胱氨酸突变或两个半胱氨酸缺失的序歹AtRabD2bC199s和AtRabD2bΔCC。亚细胞定位结果显示两个突变蛋白都定位在细胞质中;酵母互补实验表明两个突变基因不能互补vpt1温敏突变体,而且tRabD2bC199S(?)tRabD2bΔCC超表达拟南芥植株表现出与AtRabD2b达植株不同的表型。这些结果表明保守半胱氨酸的突变造成了AtRabD2b亚细胞定位和功能的改变。

关键词： 拟南芥   异三聚体G蛋白   eATP   离子通道   膜片钳  

摘要： eATP对于高等植物的生长以及对环境的适应等过程都具有调节作用,已有实验证明eATP可以激活拟南芥根表皮细胞质膜上的超极化激活的钙离子通道,使胞质中游离钙离子的含量增加。 为了检测异三聚体G蛋白在eATP调节细胞质膜上离子通道过程中是否发挥作用,本文使用模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的根细胞原生质体做为研究对象,采用异三聚体G蛋白α亚基的突变体作为实验材料,利用外源ATP处理根细胞原生质体,采用膜片钳技术,检测eATP对于拟南芥根细胞质膜上离子通道(钙离子通道,钾离子通道)活性的影响。 本实验采用全细胞电压钳的方式记录了拟南芥根细胞质膜上超极化激活的钙离子通道,外源ATP处理后钙离子通道的开放电压提高,电流强度增大,在异三聚体G蛋白α亚基缺失突变体中,外源ATP处理后钙通道的开放电压以及电流强度变化不大,在Gα超表达株系中外源ATP处理后钙通道的开放电压以及电流强度明显增大,证明异三聚体G蛋白在eATP调节细胞质膜上钙离子通道的信号转导机制中可能发挥作用。 为了检测异三聚体G蛋白在eATP调节细胞质膜上钾离子通道过程中是否发挥作用,采用全细胞电压钳的方式分别记录了拟南芥根细胞质膜上内向与外向钾离子通道,结果显示野生型拟南芥外源ATP处理后外向钾离子通道电流增强,内向电流无变化。在异三聚体G蛋白α亚基缺失突变体中,外源ATP处理后内、外向钾通道电流均无变化。在Gα超表达株系中外源ATP处理后外向钾通道电流增强,内向电流无变化。表明异三聚体G蛋白在eATP调节细胞质膜上外向钾离子通道过程中发挥作用,但对于内向钾离子通道活性无明显影响。 通过本实验的结果可以推测异三聚体G蛋白在eATP激活根表皮细胞质膜上超极化激活的钙离子通道,引起胞质钙离子增加的过程中发挥重要作用,并且还在eATP调节细胞质膜上外向钾离子通道过程中发挥作用。

关键词： 拟南芥   DHHC   锌指蛋白   At5g04270   scc10-D   过量表达   分枝  

摘要： 植物株型的形成是一个受多种因素,如基因型、激素、环境和营养条件等影响的复杂生物学现象,而腋生器官的发生发育在此过程中起着非常重要的作用。在长日照条件下(16小时光照,8小时黑暗),以拟南芥隐花素突变体cry1cry2为研究背景构建了T-DNA激活标签突变体库,筛选得到与株型变化相关的突变体scc10-D,通过T-DNA激活标签插入位点的鉴定、T-DNA强启动子作用基因的克隆、重组、抗性筛选、遗传和生物信息学分析等研究,获得了以下主要研究结果： (1)以拟南芥隐花素突变体cry1cry2为背景,用激活标签技术构建了拟南芥的基因功能获得型T-DNA突变体库,获得了近2000个独立转化株系。通过抗性基因筛选和表型观察分析,在T1代转化植株中,共发现4个有显著的表型变化的株系,从中筛选得到一个与分枝相关的突变体scc10-D。采用IPCR等技术对拟南芥多分枝突变体scc10-D的插入位点进行分析鉴定,获得T-DNA在突变体cry1cry2基因组的插入位点是第5号染色体的90708核苷酸处。采用RT-PCR和实时定量PCR的方法对T-DNA基因组插入位点上游和下游6个侯选基因进行了mRNA转录表达水平的差异分析,结果发现在scc10-D多分枝突变体中,T-DNA的插入引起了DHHC型的锌指蛋白基因At5g04270的表达量上调,其余基因的表达量基本无明显上调变化。研究结果表明scc10-D突变体多分枝的表型由At5g04270基因表达量上调所致。 (2)克隆At5g04270并通过酶切连接的方法将其重组到过表达载体pEGAD,然后通过农杆菌GV3101浸花蕾的方法将(?)EGAD-At5g04270重组体通过转化整合到拟南芥野生型Col-4基因组,构建过量表达转基因植株35S::GFP-At5g04270。通过除草剂的连续三代筛选得到转基因植株的纯合体,结果发现该转基因植株分枝增加。同时,采用RT-PCR检测了转基因纯合体植株的mRNA水平,发现At5g04270基因的表达量上调,该结果进一步证实scc10-D突变体多分枝表型是由At5g04270基因表达量上调所致。采用三引物法对At5g04270基因T-DNA插入突变体(SALK006515)的DNA进行分子鉴定及纯合株系的筛选。采用RT-PCR的方法进行At5g04270转录mRNA表达分析,在SALK06515的纯合突变体中基本上检测不到At5g04270基因的表达,结果表明我们筛选到了SALK06515的纯合突变体。通过RT-PCR对拟南芥根、茎、莲座叶、茎生叶、花中分别提取At5g04270基因的mRNA转录表达的检测,At5g04270基因在各个不同器官中均有表达,在花和莲座叶中表达量较高,根、茎、茎出叶较低,莲座叶中表达量比花中高。 (3)利用拟南芥TAIR和NCBI网站提供的生物信息学数据对At5g04270的对该基因锌指结构域DHHC定点突变的At5g04270C105A进行了氨基酸修饰位点、信号肽序列、跨膜结构以及亲疏水性对比分析,预测结果发现At5g04270所编码的蛋白是一个膜蛋白,存在3个主要的跨膜结构域及一个次要的跨膜结构域和DHHC-CRD结构域,可能具有蛋白质酰基转移酶的活性。氨基酸C(半胱氨酸)是脂肪族含巯基的极性氨基酸,氨基酸A(丙氨酸)是脂肪族的非极性氨基酸。At5g04270的DHHC定点突变的DHHA后,由于氨基酸极性的改变,预测其可能改变了结构域与锌离子的结合能力,使其失去了蛋白质酰基转移酶的活性。 (4)采用搭桥PCR方法将At5g04270基因的DHHC结构域定点突变为DHHA,然后将At5g04270和发生定点突变的At5g04270C105A克隆到酵母的表达载体pYES260,然后将该重组载体转化到酵母蛋白酰基转移酶ARK1的突变体ark1,结果发现在30℃的条件下,通过载体上的GAL1强启动子在半乳糖的选择培养基中过表达At5g04270,能够使成ARK1的突变体ark1表型恢复为ARK1表型,而发生定点突变的At5g04270C105A在同等培养条件下却不能恢复其表型,该研究结果说明At5g04270具有蛋白质酰基转移酶活性,DHHC结构域是该酶的功能结构域。通过酶切连接技术成功构建了原核表达质粒pCold-At5g04270;通过Gateway技术成功构建了原核表达质粒pDEST17-At5g04270,将At5g04270克隆到原核表达载体pCold和pDEST17,为进一步研究At5g04270基因的功能提供基础。

关键词： 香蕉   MaROP1   拟南芥   盐胁迫   干旱胁迫   ABA  

摘要： ROP（Rho-related GTPases from plants）蛋白作为高等植物体内广泛存在的一类GTP结合蛋白,是一类重要的信号分子,在植物的生长发育过程中起着重要的调控作用。利用抑制差减杂交分离香蕉果实采后差异表达基因时获得了一个香蕉ROP基因,将其命名为MaROP1。该基因具有一个完整的开放阅读框,编码196个氨基酸,具有保守的ROP结构域,Blastx表明该基因与其它物种的ROP基因的同源性较高。实验室前期结果表明,该基因在香蕉基因组中的拷贝数较低,在香蕉的根、球茎、叶、花、果实中差异表达且在香蕉球茎中的表达量最高。 为了深入研究MaROP1基因对逆境和激素的应答,本实验构建了MaROP1基因的融合植物表达载体pCAMBIAl 302-MaROP1,通过根癌农杆菌EHA105介导的花序浸蘸法将pCAMBIA1302-MaROP1植物表达载体转化哥伦比亚生态型野生拟南芥,经过35ug/mL潮霉素筛选各代种子（T1-T3）获得了14个MaROP1转基因拟南芥纯合株系,southern杂交表明MaROP1基因已经整合到各转基因株系的基因组中,RT-PCR证实MaROP1基因在各转基因株系中转录水平上表达。利用其中5个经过Southern和RT-PCR鉴定的转基因株系进行盐、干旱等逆境处理和***处理。 MaROP1转基因拟南芥与野生型相比对盐胁迫抵抗能力增强。在不同浓度的NaCl培养基上,MaROP1转基因拟南芥与野生型相比种子发芽率提高,200mM NaCl处理下野生型萌发率为23.42%,各转基因纯合株系发芽率在46.21%-79.76%之间。根长被抑制程度较低,150mM NaCl处理下,野生型平均根长为0.29 cm,各转基因纯合株系平均根长在0.57-0.79cm之间。对野生型和各转基因拟南芥成苗进行高盐胁迫后发现,MaROP1转基因拟南芥的存活率大于野生型,300mM NaCl处理14天后,野生型的存活率几乎为零,而各转基因拟南芥存活率均在30%以上。 MaROP1转基因拟南芥与野生型相比对干旱胁迫抵抗能力增强。在不同浓度甘露醇模拟干旱的培养基上,MaROP1转基因拟南芥与野生型相比种子发芽率提高,在400mM甘露醇培养基上野生型发芽率为23.12%,各转基因拟南芥发芽率在73.83%-85.00%之间。根长被抑制程度较低,在400mM甘露醇培养基中上野生型的根长几乎为零,而各转基因株系的根长仍然在1.00-1.42 cm之间。对野生型和各转基因拟南芥的离体叶片进行失水率测定发现,野生型离体叶片失水率明显高于各转基因株系,第240min时,野生型失水率为38.07%,而各转基因株系叶片离体失水率在22.04%-29.43%之间,说明各转基因拟南芥离体叶片在干旱胁迫下保水能力较高。对野生型和各转基因拟南芥进行干旱胁迫后发现,MaROP1转基因植株的存活率大于野生型,野生型的存活率为16%,而各转基因株系存活率在35%-65%之间。 MaROP1转基因拟南芥与野生型相比降低了对ABA的敏感性。种子在胚胎萌发后期,产生大量内源ABA抑制种子萌发,本实验将刚收获的野生型和各转基因拟南芥播于MS培养基上,不经春化,按时间梯度统计萌发率,观测内源ABA对种子休眠的影响,结果发现各转基因拟南芥与野生型相比萌发速率较快,说明内源ABA对MaROP1转基因拟南芥的抑制作用低于野生型。外源ABA抑制种子萌发,在不同浓度外源ABA的处理下,各MaROP1转基因拟南芥种子发芽率均大于野生型,在5uMABA培养基上,野生型萌发率为38.77%,各转基因株系发芽率在54.62%-70%之间。在不同浓度外源ABA的处理下垂直培养和平放培养野生型和各转基因株系均表明,外源ABA对各转基因株系根长和生长速率的影响均比野生型小。

关键词： 非生物胁迫   拟南芥   转基因植物   高迁移率族蛋白  

摘要： [目的]研究高等真核生物细胞核中的高迁移率族蛋白B(HMGB)在植物胁迫反应的转录调控中的作用方式。[方法]克隆了拟南芥中编码HMGB蛋白的基因At2G33450,将其转化拟南芥并筛选出超表达的转基因植株,检测干旱、高盐等非生物胁迫对转基因拟南芥的影响。[结果]在盐或干旱胁迫下,过度表达At2G33450的转基因拟南芥与野生型相比,出现萌发及生长迟缓现象。[结论]HMGB蛋白家族中的At2G33450蛋白对各种胁迫条件下拟南芥的生长发育具有重要作用。

关键词： 非生物胁迫   拟南芥   转基因植物   高迁移率族蛋白  

摘要： [目的]研究高等真核生物细胞核中的高迁移率族蛋白B(HMGB)在植物胁迫反应的转录调控中的作用方式。[方法]克隆了拟南芥中编码HMGB蛋白的基因At2G33450,将其分别转化拟南芥并筛选出超表达的转基因植株,检测干旱、高盐等非生物胁迫对转基因拟南芥的影响。[结果]在盐或干旱胁迫下,过度表达At2G33450的转基因拟南芥与野生型相比,出现萌发及生长迟缓现象。[结论]HMGB蛋白家族中的At2G33450蛋白对各种胁迫条件下拟南芥的生长发育具有重要作用。

关键词： SECONDARY CELL-WALL   PLASMA-MEMBRANE PROTEIN   GLUCURONOXYLAN BIOSYNTHESIS   SYNTHESIS INHIBITOR   HYDROGEN-PEROXIDE   BINDING MOTIFS   NADPH OXIDASE   GENE ENCODES   THALIANA   SYNTHASE  

摘要： The Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) trichome birefringence (tbr) mutant has severely reduced crystalline cellulose in trichomes, but the molecular nature of TBR was unknown. We determined TBR to belong to the plant-specific DUF231 domain gene family comprising 46 members of unknown function in Arabidopsis. The genes harbor another plant-specific domain, called the TBL domain, which contains a conserved GDSL motif known from some esterases/lipases. TBR and TBR-like3 (TBL3) are transcriptionally coordinated with primary and secondary CELLULOSE SYNTHASE (CESA) genes, respectively. The tbr and tbl3 mutants hold lower levels of crystalline cellulose and have altered pectin composition in trichomes and stems, respectively, tissues generally thought to contain mainly secondary wall crystalline cellulose. In contrast, primary wall cellulose levels remain unchanged in both mutants as measured in etiolated tbr and tbl3 hypocotyls, while the amount of esterified pectins is reduced and pectin methylesterase activity is increased in this tissue. Furthermore, etiolated tbr hypocotyls have reduced length with swollen epidermal cells, a phenotype characteristic for primary cesa mutants or the wild type treated with cellulose synthesis inhibitors. Taken together, we show that two TBL genes contribute to the synthesis and deposition of secondary wall cellulose, presumably by influencing the esterification state of pectic polymers.