关键词： 拟南芥   高迁移率族蛋白   毕赤酵母   真核表达  

摘要： [目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SalⅠ将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-AGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。

关键词： HETEROTRIMERIC G-PROTEIN   HYPOCOTYL ELONGATION   TRANSCRIPTION FACTOR   FUNCTIONAL-ANALYSIS   ALPHA-SUBUNIT   ABA RECEPTORS   BETA-SUBUNIT   AUXIN   GENE   GERMINATION  

摘要： G protein-coupled receptor-type G proteins (GTGs) are highly conserved membrane proteins in plants, animals, and fungi that have eight to nine predicted transmembrane domains. They have been classified as G protein-coupled receptor-type G proteins that function as abscisic acid (ABA) receptors in Arabidopsis thaliana. We cloned Arabidopsis GTG1 and GTG2 and isolated new T-DNA insertion alleles of GTG1 and GTG2 in both Wassilewskija and Columbia backgrounds. These gtg1 gtg2 double mutants show defects in fertility, hypocotyl and root growth, and responses to light and sugars. Histological studies of shoot tissue reveal cellular distortions that are particularly evident in the epidermal layer. Stable expression of GTG1(pro):GTG1-GFP (for green fluorescent protein) in Arabidopsis and transient expression in tobacco (Nicotiana tabacum) indicate that GTG1 is localized primarily to Golgi bodies and to the endoplasmic reticulum. Microarray analysis comparing gene expression profiles in the wild type and double mutant revealed differences in expression of genes important for cell wall function, hormone response, and amino acid metabolism. The double mutants isolated here respond normally to ABA in seed germination assays, root growth inhibition, and gene expression analysis. These results are inconsistent with their proposed role as ABA receptors but demonstrate that GTGs are fundamentally important for plant growth and development.

关键词： Arabidopsis   G-box   Jasmonate   JAZ2   MYC2   Promoter   RESPONSIVE ELEMENT   EAR MOTIF   GENES   EXPRESSION   DOMAIN   IDENTIFICATION   BIOSYNTHESIS   DEFENSE   TARGETS   CATABOLISM  

摘要： Jasmonate (JA) is a critical hormone for both plant defense and reproductive development. Until now, early JA-responsive promoters have not been well characterized. To identify the cis-acting DNA element involved in the early JA response at the transcriptional level, we analyzed the promoter of the Arabidopsis gene encoding jasmonate-ZIM domain2 protein (JAZ2). The full-length JAZ2 promoter in JAZ2::GUS plants is active in vegetative and reproductive tissue, with expression in stamen filaments being dependent on JA biosynthesis. We identified a G-box element in the JAZ2 promoter that is required for JA-mediated promoter activation in carrot protoplasts and Arabidopsis seedlings. Three copies of a G-box and flanking sequences has autonomous JA-dependent activity and was transactivated by MYC2, MYC3 and MYC4 transcription factors in carrot protoplasts. Expression of MYC2, MYC3 or MYC4 fused to an EAR (ETHYLENE RESPONSE FACTOR-associated amphiphilic repression) motif, or expression of JAZ1 or JAZ6 all repressed JA- and MYC-dependent activation of the JAZ2 promoter. A thymidine-rich sequence 3' to the G-box was required for full JA activation of the JAZ2 promoter. Because the G-box is also present in genes unresponsive to JA, we propose that this thymidine-rich sequence together with the G-box provides JA specificity to promoters induced early in the JA response. Together, these results indicate that an extended G-box located in the promoter region of an early JA-responsive gene is required for gene induction in vivo, probably through selective binding of MYC2, MYC3 and MYC4 transcription factors.

关键词： SCBP60g蛋白   表达模式   PCR技术   GUS组织化学染色   植物模型  

摘要： 钙调素结合蛋白的分离鉴定及其结构功能、理化性质的研究对阐明 Ca2+/CaM在生物体内的复杂调控机制具有重要意义。为了明确 SCBP60g蛋白在拟南芥中的表达模式及其功能，本论文进行了如下研究：\n 1、采用PCR技术从拟南芥中克隆了SCBP60g基因的启动子，并和GUS报告基因相融合，将构建好的重组表达载体转化野生型拟南芥，对获得的转基因株系进行GUS组织化学染色，结果表明：SCBP60g基因的启动子能指导GUS报告基因在拟南芥的根、茎、叶和花中表达，并且在这些部位的维管束表达较强。\n 2、通过 RT- PCR技术从拟南芥中克隆获得 SCBP60g基因的cDNA序列，利用Gateway克隆技术将SCBP60g基因的cDNA和GFP报告基因相融合，构建了 CaMV35S启动子驱动的融合表达载体 p35S::GFP-SCBP，以空载体 p35S::GFP为对照。将重组载体转化野生型拟南芥，并经筛选获得 T2代转基因株系。利用激光扫描共聚焦显微镜观察转基因株系的根部细胞，结果发现：转空载体的株系绿色荧光分布于整个细胞膜、细胞质和细胞核中，转 p35S::GFP-SCBP载体的株系绿色荧光分布于细胞核内，表明 SCBP60g蛋白定位于细胞核内。\n 3、通过 RT-PCR技术从拟南芥中克隆获得 SCBP60g基因的cDNA序列，利用Gateway克隆技术将SCBP60g基因的cDNA序列融合到双元载体 pMDC32上，构建了 CaMV35S启动子驱动的表达载体 p35S::SCBP，将构建好的互补载体转化 cbp60g-1突变体，并经筛选获得转基因纯合株系。通过细菌生长量检测，对 SCBP60g蛋白的功能进行初步的探讨。

关键词： UV-B   异三聚体G蛋白   H2O2   NO   气孔运动、拟南芥  

摘要： 紫外线B （UV-B）作为一种重要的环境信号调控着植物的生长发育,但目前对其信号转导机制却知之甚少。动物细胞中研究已表明异三聚体G蛋白参与了UV-B辐射信号的传递,但G蛋白是否也参与植物细胞响应UV-B信号的传递却并不清楚。在植物气孔运动的研究中,许多证据表明G蛋白参与了脱落酸、胞外钙调素、病源激发子和臭氧等多种刺激调控气孔运动的信号转导过程,且其作用是调控信号分子过氧化氢（H202）和一氧化氮（NO）的形成。在UV-B调控气孔运动的研究中,前期研究已表明H202和NO参与了UV-B诱导气孔关闭的信号转导过程,但对于（1）UV-B诱导H202和NO形成的具体酶学途径;（2）G蛋白是否参与该UV-B信号转导过程;（3）G蛋白与H202和NO的关系等一系列问题均不清楚。本研究结合药理学、遗传学和细胞生物学的研究方法,以模式植物拟南芥为材料,对上述问题进行了研究,得到以下主要实验结果和结论： 1.以野生型拟南芥叶片为材料,当UV-B辐射强度达到0.5W·m-2时诱导气孔关闭最为显著,且该剂量UV-B在辐射3h后气孔关闭程度最显著,说明0.5W·m-2UV-B辐射处理3h是诱导拟南芥叶片气孔关闭的最适辐射剂量和处理时间,故以下实验均采用该UV-B辐射强度处理3h。 2.G蛋白抑制剂百日咳毒素（PTX）能显著抑制0.5W·m-2UV-B诱导的气孔关闭,而其活化剂霍乱毒素（CTX）能模拟UV-B的作用诱导可见光下叶片气孔关闭;UV-B辐射不能诱导G蛋白α亚基GPA1的功能缺失突变体gpal-1和gpal-2的气孔关闭,却能诱导GPA1基因过表达株系wGa和其组成活化型株系cGa的气孔关闭,且cGa和wGα在UV-B辐射下气孔关闭速度明显快于野生型。表明异三聚体G蛋白α亚基参与了UV-B辐射诱导拟南芥气孔关闭的信号转导过程。 3.H202的清除剂抗坏血酸（ASA）和过氧化氢酶（CAT）以及NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘（DPI）均能显著抑制UV-B诱导拟南芥野生型气孔关闭和保卫细胞H202的生成;但UV-B不能诱导NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF的功能缺失单突变体和双突变体的气孔关闭和保卫细胞H2O2的生成。说明H2O2参与了UV-B诱导拟南芥气孔关闭的过程,且H2O2的形成依赖于NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF。 ***能显著抑制UV-B诱导保卫细胞H2O2的形成,外源H2O2也能逆转PTX对UV-B诱导气孔关闭的抑制效应;CTX能诱导可见光下保卫细胞H2O2的生成,且其诱导的H202的生成和气孔关闭均可被ASA、CAT和DPI抑制;UV-B不能诱导突变体gpal-1和gpal-2的保卫细胞形成H202,却能使cGa和wGa保卫细胞H202形成量高于野生型;外源H202能诱导可见光和UV-B辐射下突变体gpal-1和gpal-2的气孔关闭,CTX也不能诱导NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF的功能缺失单突变体和双突变体的气孔关闭和保卫细胞H202的生成。上述结果表明在UV-B诱导气孔关闭的信号转导过程中Ga作用于H202的上游。 ***清除剂c-PTIO和硝酸还原酶（NR）抑制剂钨酸钠均能抑制UV-B诱导的拟南芥野生型气孔关闭和保卫细胞NO的形成;但UV-B辐射不能诱导NR单突变体nial和双突变体nialnia2的气孔关闭和保卫细胞NO的形成,却能诱导NR单突变体nia2气孔关闭和保卫细胞NO的形成。该结果不仅再次证明NO参与了UV-B诱导气孔关闭的信号转导过程,而且进一步表明UV-B诱导的NO依赖于Nial,而不依赖于Nia2。 ***能抑制UV-B诱导保卫细胞NO的形成,外源NO供体硝普钠（SNP）也明显逆转PTX对UV-B诱导气孔关闭的抑制效应;CTX能诱导可见光下保卫细胞NO的生成,且其诱导的NO的生成和气孔关闭均可被c-PTIO和钨酸钠显著抑制;UV-B不能诱导突变体gpal-1和gpal-2的保卫细胞形成NO,却能使cGa和wGa保卫细胞NO形成量高于野生型;SNP能诱导可见光和UV-B辐射下突变体gpal-11和gpal-2的气孔关闭,CTX却不能诱导突变体nial和nialnia2的气孔关闭和保卫细胞NO的生成。上述结果表明UV-B诱导的保卫细胞NO形成依赖于Gα。 7.外源H202不能诱导可见光和UV-B辐射下突变体nial和nialnia2的气孔关闭,而SNP却能促使可见光和UV-B辐射下NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF的功能缺失单突变体和双突变体的气孔关闭;UV-B辐射不能诱导NADPH氧化酶AtrbohD和AtrbohF的功能缺失单突变体和双突变体的保卫细胞形成NO,却能诱导突变体nial和nial/nia2保

关键词： 植物代谢   气体交换   渗透调节   细胞形态学  

摘要： 气孔是植物与外界环境进行气体交换和水分代谢的通道,每个气孔均由一对保卫细胞组成。随着离子流动的变化和许多特异的渗透调节因子的调节,保卫细胞通过开关气孔完成植物与环境的水分及气体交换、响应外界环境变化、感受生物及非生物胁迫,使植物尽量迅速适应外界环境正常生存下去。在植物中异三聚体G蛋白介导的信号级联反应是重要的信号转导机制,拟南芥中目前仅有一个典型的G蛋白a亚基,GPAl,它参与水分代谢的调节、ABA调节的保卫细胞运动等许多信号转导通路。保卫细胞是在体内研究H+-ATPase活性及信号转导通路的理想系统,可以在生理学条件下研究H+-ATPase及相关调节元件的调节机制。目前已经证实H+-ATPase参与ABA诱导气孔运动过程、蓝光诱导气孔开放、植物与病原菌互作等多种进程。本实验室前期的试验结果表明,异三聚体G蛋白a亚基参与Eatp在光照条件下促进气孔开放、胞内Ca2+浓度的升高、ROS的产生以及H+离子流速上升等进程,而异三聚体G蛋白β、丫亚基不参与这些进程。　　本研究采用拟南芥生态型ws、col-O及异三聚体G蛋白a亚基的功能缺失突变体gpa1-1、gpa1-2,过表达株系wGa、cGa,还有在拟南芥保卫细胞中大量表达的H+-ATPase AHAI、AHA2、AHA5功能缺失突变体保卫细胞为材料,观察野生型与突变体在ATP处理前后气孔开度变化的差异,判断异三聚体G蛋白a亚基与H+-ATPase是否参与Eatp诱导的气孔开放。结果显示,异三聚体G蛋白a亚基的功能缺失突变体及AHAI、AHA2、AHA5功能缺失突变体对ATP反应不明显,而ws、col-o及过表达株系的气孔开度则在加入ATP后明显增大。这说明,异三聚体G蛋白a亚基与H+-ATPase很有可能参与了Eatp诱导的气孔开放过程。为探究ATP引起的质子外流是否由H+-ATPase介导,我们使用非损伤微测技术对在拟南芥保卫细胞中大量表达的H+-ATPaseAHAI、AHA2、AHA5功能缺失突变体及col-O加入ATP后保卫细胞质膜H+流速进行了测定。结果表明,AHAI、AHA2、AHA5功能缺失突变体中加入ATP后虽能够产生一定量的质子外流,但是其流速和持续时间均明显小于野生型中得到的结果。表明拟南芥保卫细胞中大量表达的H+-ATPaseAHA1、AHA2、AHA5参与了由Eatp诱导气孔开放的过程。

关键词： TAPa-LP   Gα   拟南芥   朗伯-比尔定律   蛋白质结构  

摘要： G蛋白是普遍存在于真核生物细胞中的一个与GTP结合蛋白家族,与膜受体偶联(Heterotrimeric GTP binding proteins),由α,β,γ三个亚基组成异三聚体复合物,分子量100kDa左右。哺乳动物目前发现23种左右的Gα,6种Gβ,14种Gγ蛋白,每个亚基都由多基因编码,从而构成多种多样的可能组合方式。目前已在豌豆、玉米、菠菜、拟南芥、燕麦、大豆、大麦、水稻等多种植物细胞中检测到了G蛋白的存在。植物中G蛋白数目很少,任一G蛋白亚基在各种植物中只有1到2个成员。如拟南芥中只有1个Gα,1个Gβ和2个Gγ。相互作用的只有少数几个蛋白,包括与Gα互作的AtPirinl (PRN1)、prephenatedehydratase1(PD1)、THYLAKOID FORMATION1(THF1)和PLDa1,以及与Gβ互作的N-MYCDOWN-REGULATED1(NDL1)。植物G蛋白的空间结构目前了解极少,主要是参考动物的G蛋白进行推测。Ga亚基有两个独立区域组成,一个区域(GTPase区)含有GTP结合域,这个区域参与GTPase结合。另一个区域即完整的α螺旋区域,它是由一个长的中心螺旋和5个短的螺旋组成,该区域是识别效应物的区段。目前对拟南芥G蛋白的了解很有限,需要进一步研究G蛋白的结构与功能,信号转导机制,及其相互作用因子。 因此我们发展了含有连接肽的串联亲和层析技术(命名为TAPa-LP),用以研究拟南芥G蛋白的互作因子,蛋白结构及其生理作用。 串联亲和纯化(tandem技术通过靶蛋白质一端嵌入一个特殊的蛋白质标签(TAP tag),不破坏靶蛋白质序列,经过两步连续的亲和纯化获得接近自然条件的特定蛋白质复合体,然后用质谱技术或Edman降解法进行蛋白质鉴定。 融合蛋白的功能可能改变或丧失(有的不影响),这也是TAP方法固有的一个缺点,解决的办法是增加一个柔性连接肽,使两边的蛋白质空间结构各自独立,减少干扰。本实验设计的连接肽为GGGGSGGGGGS,核酸序列为GGAGGAGGAGGATCAGGA GGAGGAGGAGGATCA,并构建了5套载体：p2300EC-GPT, p2300EC-GT, p2300EC-QT, p2300EC-QPT和p2300EC-FPT,这5种类型中有3种有连接肽,另2种不含连接肽。 TAPa-LP系统揭示了G蛋白在植物的发育过程起着极其复杂的作用。我们发现在叶、茎、花和果实的发育过程中GTP-Ga是一种正调控因子,而GTP-Ga在种子花青素和根的发育过程中为负调控因子。Gaβγ在主根、茎和果实的发育过程是正调控因子,而在叶片的表皮细胞横向增值的过程中起着负调控作用。也就是说在拟南芥发育过程中,GTP-Ga在不同的组织分别发挥4种正调控和2种负调控作用。三聚体Gap丫发挥着3种正调控和1种负调控作用。Gaβγ和GTP-Ga在根和叶的发育中起着相反的调控作用。我们推测·Gaβγ和GTP-Ga的比值影响着或强烈影响植物的生长。 在gpal和fpt中GPA1的缺失导致Gapy和GTP-Ga两者均缺失,植物的生长并没有受到明显的影响,这可能是因为G蛋白参与的正负调控的双双缺失造成的。这也说明G蛋白在植物的发育过程中并不是主要的调控元件,可能存在着另外的不为G蛋白参与的调控模式。gpt在T2代的类型中长的高大而粗壮,可能是35S启动子较强的功能提高了Gaβγ和GTP-Ga的含量。 qpt在T1代生长健壮但在T2代生长的极其柔弱,主根几乎不再生长,最终是全体死亡。其原因极可能是T1代的激素水平不同于T2种子的水平。看来植物生长的调控不仅依赖于Gaβγ和GTP-Ga的含量,而且也依赖于激素水平,不同的植物激素进行着复杂的植物的生长调控。 通过TAPa或linker-TAPa对Ga功能的干涉情况,来判断Ga亚基在空间结构上调控区域所在的空间位置。从实验情况来看,TAPa或linker-TAPa标签有时会影响Ga的功能。Ga的三维结构呈现出两个独立的区域,根据SWISS-MODEL预测的融合蛋白的结构,呈现出三个独立的区域,也就是比Hamm报道的多了TAPa区域。 当G、GPT、 QT和QPT中的一种或2种或3种能明显引起拟南芥某种表型发生变化时,调控区域可能定位在C端区域,因为TAPa干扰了G蛋白的功能,靠近C端最有可能的调控区是A stem, I primary root, A primary root, A silique size, I Seed color和A leaf。Gβγ二聚体结合在Ga的N端区域,功能区多在C端。 在筛选拟南芥G蛋白α亚基GPA1蛋白互作因子过程中,成功获取了Gγ1和Gβ两个互作因子,并首次获取了完整的G蛋白,从而进一步明确了各亚基之间的相互作用的关系。 用改

关键词： 异三聚体G蛋白   紫外线B辐射   气孔运动   拟南芥  

摘要： 【目的】了解异三聚体G蛋白在紫外线B(UV-B)辐射诱导气孔关闭中的作用,为进一步阐明植物细胞转导UV-B辐射信号的机制提供依据。【方法】以拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型、G蛋白α亚基基因缺失突变体及其超表达株系和组成活化型株系为材料,并结合药理学试验,通过气孔开度分析确定G蛋白在0.5 W.m-2UV-B辐射诱导拟南芥叶片气孔关闭中的作用。【结果】细菌毒素试验表明,G蛋白抑制剂百日咳毒素(PTX)能显著抑制UV-B诱导的气孔关闭,而其活化剂霍乱毒素(CTX)能模拟UV-B的作用诱导可见光下叶片气孔关闭。遗传学试验显示,UV-B不能诱导异三聚体G蛋白α亚基GPA1功能缺失突变体gpa1-1和gpa1-2的气孔关闭,却能诱导其超表达株系wGα和组成活化型株系cGα的气孔关闭,且cGα在可见光下气孔开度明显小于野生型,在UV-B辐射初期其气孔关闭速度明显快于野生型。【结论】异三聚体G蛋白α亚基参与了UV-B辐射诱导拟南芥叶片气孔关闭的信号转导过程。

关键词： 拟南芥   高迁移率族蛋白   毕赤酵母   真核表达  

摘要： [目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SaⅠl将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。

关键词： 花粉发育   种子重量与体积   WD40-repeat蛋白  

摘要： 植物中WD40-repeat蛋白在细胞周期调控等方面具有重要作用。本研究鉴定了一株拟南芥WD40-repeat蛋白基因突变体at1g65030,与野生型植株相比种子重量增重体积变大,营养生长长势较弱,角果种子结实率较低。以突变体作为母本/父本与野生型父本/母本杂交,前者杂交后代未显示有母本的突变表型,后者部分杂交后代显示出父本的突变表型,统计突变体后代分离比符合1:1。用苯胺兰(DAB)、4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、碘-碘化钾花粉染色,发现花粉部分败育且主要为核败育。爱氏苏木精花粉染色结果显示可观察到正常减数分裂各时期形态。采取热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)方法确认突变基因位于第一条染色体65030位置,生物信息学分析表明该基因含有DWD基序。半定量RT-PCR分析发现在拟南芥发育晚期该基因在花器官中大量表达,过表达该基因使种子重量减轻。推测At1g65030影响了拟南芥花粉发育细胞核有丝分裂过程,该研究增加了人们对调控拟南芥花粉发育分子机制的认识。