关键词： 内部核糖体进入位点   非帽依赖翻译   反式作用因子   G-四链体   上游开放阅读框  

摘要： 内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)是一种存在于RNA内部的特殊功能元件,其可在不依赖5’端帽子结构的情况下直接招募核糖体启动蛋白翻译,已被发现与多种细胞过程密切相关。近来,越来越多的证据表明IRES在环形RNA翻译调控中扮演着极其重要的角色,由此IRES引起人们的极大关注。本文针对目前真核细胞中IRES介导的翻译调控机制进行了综述,并对IRES元件相关生物信息学工具进行了总结。

关键词： 5′UTR   上游开放阅读框   内含子   二级结构   基因表达调控  

摘要： 植物5′非翻译区(untranslated region,UTR)存在众多的调控元件,如内部核糖体进入位点、上游开放阅读框、内含子及各种二级结构,在基因表达调控中发挥重要作用。5′UTR还能够通过保留、删除或突变调控元件产生多个mRNA变体,从而影响翻译效率。本文对植物5′UTR中涉及的各种调控元件及二级结构的作用机制进行了总结归纳,期望较为全面展示植物5′UTR的结构和功能,并为研究植物5′UTR的调控机制提供参考。

关键词： uORF   翻译调控   核糖体   生长发育   作物育种  

摘要： 上游开放阅读框(upstream open reading frame, uORF)是一类能够精确控制蛋白质翻译的mRNA元件,位于mRNA的5'端前导区,主要通过抑制翻译起始来调节下游主体开放阅读框(main open reading frame, mORF)的翻译。目前对植物uORF的预测和鉴定主要集中于生物信息学和翻译组学鉴定技术。植物uORF广泛参与调节生长发育、营养代谢、抗病免疫等多个生命活动过程。本文对植物uORF的分类、功能机制、预测和鉴定方法、植物规避uORF的方式以及植物uORF的工程应用等进行综述归纳,旨在更系统和深入地理解植物uORF的功能与机制,并为uORF应用于作物分子育种工作提供参考。

关键词： 鸡   PPARγ基因   5’非翻译区   上游开放阅读框   翻译抑制  

摘要： 前期研究发现,鸡PPARγ基因转录本5(c PPARγ5)的5’非翻译区(5’untranslated region,5’UTR)存在两个上游开放阅读框(uORF1和uORF2)。为揭示这两个uORFs在鸡PPARγ基因表达转录后调控作用,试验使用报告基因、定点突变、q RT-PCR和Western blot等技术,分析两个uORFs对报告基因活性及PPARγmRNA和蛋白表达的影响。结果表明,与野生型相比,uORF1和uORF2分别突变和同时突变均显著促进报告基因活性及PPARγm RNA和蛋白表达(P<0.05)。mRNA稳定性分析发现,两个uORFs突变对报告基因mRNA稳定性无显著影响。启动子活性分析发现,c PPARγ的5’UTR区具有启动子活性。研究结果表明,cPPARγ5的两个u ORFs抑制其翻译。

关键词： 核糖体图谱   翻译调控   上游开放阅读框  

摘要： 随着高通量测序技术的持续发展和进步,开发出很多新颖的测序技术,为诸多悬而未决的生物学难题提供了解决方案。其中,核糖体图谱技术能够在全基因组水平和单核苷酸分辨率上监控细胞内的翻译事件,填补了转录组学和蛋白质组学研究之间的空隙。核糖体图谱技术不仅能够鉴定处于翻译状态的RNA分子,还能够精确定位RNA分子上正在翻译的核苷酸,进而准确描绘RNA分子上的开放阅读框。此外,结合转录组测序数据,核糖体图谱技术还可以确定每个转录本上的核糖体数量,从而计算每个转录本的翻译效率。目前,核糖体图谱技术已成功应用于动物、植物和微生物等研究领域,加深了人们对翻译调控机制的认识。然而,由于植物细胞和组织的特性,核糖体图谱技术在植物学研究中的应用仍然存在局限。该文综述了核糖体图谱技术的实验原理,以及在植物学研究中的相关进展。

关键词： 放疗皮肤辐射损伤   桥粒   PKP1   细胞压力应激   选择性翻译   上游开放阅读框  

摘要： 放疗在杀伤肿瘤组织的同时会损伤正常组织,从而造成如皮肤损伤等副作用。然而市面上多种防护剂对于放疗区域的皮肤防护效果并不好,因此对于电离辐射(Ionizing radiation,IR)引起的皮肤辐射损伤(radiation skin damage)的机制研究就显得尤为重要。我们实验室前期的工作发现细胞骨架角蛋白K17在大鼠/小鼠脚部皮肤辐射损伤后会先下调后显著上调,E-cadherin/β-catenin介导的粘附连接被Src/Abl激酶磷酸化而降解。然而电离辐射是否影响桥粒连接尚不明确。小鼠背部皮肤和人永久上皮细胞(Ha Ca T)的磷酸化蛋白质组均显示:PKP1(Plakophilin 1,桥粒斑菲素蛋白1)的磷酸化在电离辐射后上升。我们验证了其磷酸化的上升,并且PKP1在IR作用下磷酸化后即从桥粒连接释放到细胞质。接着我们用活细胞成像技术观察GFP-PKP1在辐照后的动态反应,检测到电离辐射、H2O2以及生长因子EGF处理GFP-PKP1有类似的变化。而在电离辐射前加一些通路抑制剂处理,显示MAPK通路抑制剂有抑制PKP1脱离桥粒的效果。5Gy辐照后4h的WT/PKP1 KO Ha Ca T蛋白质组相比辐照前下调蛋白均富集在核糖体通路。WT上调蛋白富集在细胞信号转导以及氧化还原反应,而PKP1 KO上调蛋白富集在炎症通路,WT上调蛋白在照射的PKP1 KO细胞系无差异变化。转录组数据显示,WT差异表达蛋白的m RNA水平没有显著变化。IR上调蛋白中的METTL16/ADK/MED9/STAT1在PKP1 KO细胞上升受阻,m RNA在两细胞系均不受IR调节。免疫沉淀结合质谱技术显示PKP1与翻译相关蛋白的结合,其中肽段数较多的是蛋白质翻译延伸因子EEF1A1。PKP1与EEF1A1在IR后相互作用并共定位。通过离心分离出核糖体,发现IR增加了PKP1蛋白在核糖体上的结合。并且相较于PKP1 KO细胞,编码WT细胞上调蛋白的基因的上游开放阅读框u ORF(upstream open reading frame)含量有所增加,这对于应激状态下的选择性翻译十分重要。综上所述,本研究揭示了桥粒组成蛋白PKP1对于电离辐射十分敏感。电离辐射诱导的MAPK信号激活PKP1磷酸化对于调节PKP1定位及功能的重要性,细胞质PKP1通过结合EEF1A1参与电离辐射下的翻译调节。本研究加深了对辐射损伤皮肤机制及桥粒电离辐射敏感性以及应激下翻译调节的认识,为缓解和治疗辐射损伤提供了新思路。

关键词： 乙肝病毒   nt1846突变   上游开放阅读框   Gibson组装   质粒构建  

摘要： 乙肝病毒作为逆转录病毒,容易发生基因突变并影响肝病进展。近年有研究发现B/C基因型HBV A1846T突变与慢加急性肝衰竭的发生独立相关,原因可能与nt1846突变引起HBV核心启动子上游开放阅读框起始密码子消除有关,如明确其具体机制,或许可以更科学地预测肝病进展和指导治疗。由于HBV特殊的复制和转录形式,体外进行HBV病毒学研究常常需要构建HBV 2.0质粒用于基因表达,而传统方法构建HBV 2.0质粒步骤繁琐,因此,开辟一种更简便的HBV 2.0质粒构建途径十分有意义。注意到近年来Gibson组装技术在分子生物学领域的广泛应用,本研究目的:运用Gibson组装技术构建HBV 2.0表达质粒来探究nt1846突变对HBV基因表型的影响。方法:从一名HBV感染者血清中提取出野生型HBV并将其克隆于pGEMTEasy载体,根据野生型HBV DNA测序结果设计定点突变引物,通过常规点突变得到A1846G(非A1846T)突变型质粒,创新性地运用Gibson组装(无缝克隆)技术构建了野生型和A1846G突变型pUC18-HBV Sph Ⅰ双体质粒并将其转染HepG2细胞,最终通过WB和qPCR来对比两组蛋白表达和HBV DNA复制水平的差异。实验结果:与野生组相比,A1846G突变组的HBcAg表达明显增加,HBV DNA复制水平增高。结论:***组装(无缝克隆)技术可以用来构建pUC18-HBV SphⅠ双体表达质粒并且比传统限制性酶切方法更加简单;2.B/C型HBV nt1846突变很可能通过消除CO-ORF而解除了 CO-ORF对下游C-ORF的抑制作用,引起C-ORF编码HBcAg增多,引起免疫反应增强,最终导致肝损害加重甚至慢加急性肝衰竭(ACLF)的发生。

关键词： 5'UTR   内部核糖体进入位点   上游开放阅读框   上游起始密码子   二级结构   5'UTR内含子  

摘要： 5'非翻译区(5'Untranslated Region,5'UTR)在基因表达调控中发挥重要作用,其不仅在翻译水平调控基因表达,还参与真核基因转录、转录后加工、成熟RNA运输等水平的调控。5'UTR介导的基因表达与自身存在的相关调控元件有关,主要包括内部核糖体进入位点、5'UTR二级结构、上游开放阅读框、上游起始密码子以及5'UTR内含子等元件,5'UTR异常可引起基因表达异常并引发疾病。本文综述了5'UTR调控基因表达的研究进展,以期为今后5'UTR的作用机制及相关疾病的诊断与治疗提供新的方向和理论依据。

关键词： 上游开放阅读框   翻译调控   转基因抗病育种   效应因子  

摘要： 在许多真核生物的转录本中广泛存在一类调控元件——上游开放阅读框(upstream open reading frame,uORF),它是位于信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,m RNA)5’非编码区的小开放阅读框,其起始密码子位于编码区起始密码子的上游,对下游编码区的翻译具有重要的影响。在农业生产中,农作物受到真菌、细菌、病毒等病原菌的侵染,引起多种病害,导致产量降低、品质不高,甚至人畜中毒。培育抗病品种是防治作物病害最经济环保有效的措施,转基因育种是植物抗病育种的重大突破,它通过将来源于其它生物的基因转入作物中使作物提高抗病性,但是植物在获得抗性的同时往往会对植物的生长发育产生不良影响。为了解决这个问题,本研究中提出了uORF介导的转基因育种新策略,期望通过利用uORF的调控作用使转基因植物的抗性与生长达到平衡。此外,疫霉菌是多种作物上危害比较严重的一类病原菌,在植物与疫霉菌互作过程中,疫霉菌分泌的效应因子是对植物致病的重要武器,本研究中以疫霉菌的效应因子作为切入点,利用了拟南芥(Arabidopsis thaliana)与丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae ***,Pst)DC3000的互作系统展开研究,具体研究内容如下:建立研究uORF功能的体系及ACD11-uORFs功能的初步探索:本研究选择了一种重要的拟南芥免疫系统调控因子加速细胞死亡11(accelerated cell death11,ACD11)的uORFs作为研究对象,通过将ACD11-uORFs、绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)、荧光素酶报告基因(luciferase,LUC)构建到p SUPER载体上,得到改造后的载体uORFs-GFP,将其在烟草中表达,通过活体成像仪观察到GFP的绿色荧光和LUC催化底物氧化时发出的生物荧光,并通过蛋白Western blot检测到与目的蛋白相同大小的目的带,说明了重组载体uORFs-GFP可以正常表达,本研究建立的研究uORF功能的体系是成功的。运用建立的体系,对uORFs-GFP以及uORFs-GFP突变获得的七个突变体进行研究,发现uORFs的不同组合对下游GFP的翻译具有不同的抑制效果,并且uORFs是作为调控元件在m RNA翻译水平上调控GFP的表达。uORFs在转基因抗病育种中的探索:利用uORFs的不同组合与抗病基因凝集素受体激酶Lec RK4.1串联表达,发现不同组合中Lec RK4.1的表达量不同,引起烟草细胞死亡情况不同,对辣椒疫霉菌都具有抗性,但是抗性强弱不同;利用uORFs的不同组合与感病基因BZR1串联表达,可以使烟草获得不同强度的抗性。利用拟南芥与DC3000的互作系统筛选疫霉菌的效应因子:利用实验室前期建立的筛选系统,采用两种筛选方案筛选疫霉菌的效应因子,第一种是将效应因子转入DC3000突变体菌株D36E中,筛选引起拟南芥黄化等表型的疫霉菌效应因子,筛选了9个辣椒疫霉菌的效应因子和4个大豆疫霉菌的效应因子,与对照相比,将Ps CRN63转入D36E之后,接种的拟南芥叶片出现了黄化现象,其余没有明显表型;第二种筛选方案是将效应因子转入DC3000菌株中,筛选引起接种三天后的拟南芥叶片中DC3000数量明显变化的效应因子,筛选了5个效应因子,与对照相比,细菌数量没有明显差异。

关键词： 玉米   核糖体图谱   翻译组   上游开放阅读框   下游开放阅读框   可变翻译  

摘要： 生命体遗传信息传递主要遵循中心法则。目前对生物体相关功能机制的系统解析多集中于基因组、转录组和蛋白质组水平。翻译组作为一种新兴的重要的遗传信息组学状态,其在动物中已得到广泛认识。然而,玉米作为重要的粮饲兼用作物,其全生育期的翻译组还未得到系统地注释。本研究对玉米B73自交系全生育期的21个组织进行了RNA-seq和Ribo-seq,从而对玉米全生育期的转录组和翻译组进行系统分析。我们构建了玉米翻译组图谱,鉴定了影响翻译水平变异的调控元件,解析了优势转录本在两个组学的变异特点以及可变翻译对玉米发育的可能影响。主要研究结果如下:1.收集了B73全生育期21个组织的高质量转录组和翻译组数据集,为探究玉米全生育期翻译元件及其变异规律提供了可能。全生育期Ribo-seq数据鉴定到94.98%的B73参考基因组Ref Gen＿v4的注释转录本,并发现了9,027个未被注释的新的转录本,完善了玉米全基因组功能元件的注释。2.构建了编码蛋白的mRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、环状RNA(circRNA)和微小RNA(miRNA)的翻译组表达变异图谱,发现非编码RNA的组织特异性更强。在翻译组水平构建了包含3,533,777个基因共表达边的网络并划分出2,959个模块,对基因数目≥30的78个模块进行了可视化并分别做了GO富集分析,得到了基因的互作关系以及各个模块的富集途径。3.探究了上游开放阅读框(uORF)、下游开放阅读框(dORF)和多聚腺苷酸(polyA)这三个元件对基因翻译水平变异的可能关系。发现uORF和dORF对转录本编码区(CDS)翻译效率可能有抑制作用,uORF的抑制能力可能比dORF的更强,这种抑制性是由其序列背景确定的。将B73的基因分为原有polyA基因和修饰添加polyA基因两类,发现原有polyA基因更倾向于被翻译。4.探究了转录组和翻译组之间优势转录本的变化规律,发现转录组的每个基因平均表达的转录本个数远高于翻译组。所有组织中有50%左右的优势转录本在两个组学上是不保守的,说明从转录到翻译的过程转录本的表达受到较大的变异调控,并且保守的转录本含有更利于翻译的序列结构。5.探究了不同剪接模式在两个组学上的变化,发现转录组和翻译组剪接事件发生的比例类似。内含子保留是最常见的剪接事件,其次是可变受体,再次是可变供体。比较了茎尖分生组织(SAM)到雌穗分生组织(ear)以及SAM到雄穗分生组织(tassel)之间的可变翻译事件,找到了它们CDS使用差异的基因。SAM与ear的CDS使用差异基因主要富集在胞质途径,而SAM与tassel的CDS使用差异基因主要富集在与翻译相关的途径。本研究收集了B73全生育期的转录组和翻译组数据,并且从表达图谱、变异元件以及可变翻译等方面详细地对翻译组数据进行了分析,为玉米生长发育以及性状变异的分子机制研究提供了重要的数据资源和新的视角。